Name: 無傷および再生中のウーパールーパー四肢の軟骨の原子間力顕微鏡測定 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-11T13:40:00.000+00:00
Duration: 9 min 19 s
Description: 学ぶ、原子間力顕微鏡を用いてウーパールーパー四肢軟骨の機械的特性を測定する方法。組織再生における機械シグナルの役割を解明し、再生医療研究に貢献する信頼性の高いプロトコルを確立します。

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<meta charset="utf8"></head><body>ウーパールーパー四肢再生中の組織硬直の機械的特性評価

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</ol>

<table><tbody><tr><td>Affinity Designer</td><td>のアフィニティ</td><td>&nbsp;バージョン1.10.4</td><td>図の組み立て用</td></tr><tr><td>アガロース 低メルト</td><td>ロート</td><td>6351.1</td><td>サンプル調製用</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Phalloidin</td><td>Invitrogen</td><td>A12379</td><td>組織を染色するには</td></tr><tr><td>Axiozoom</td><td>Zeiss</td><td></td><td>AFM下の画像サンプルへ</td></tr><tr><td>ベンゾカイン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1501</td><td>動物を麻酔するには</td></tr><tr><td>ブトルファノール(+)-酒石酸塩塩</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>&nbsp;B9156</td><td>鎮痛剤として</td></tr><tr><td>片持ち梁</td><td>NanoWorld</td><td>Arrow TL1</td><td>AFMインデンテーション測定用</td></tr><tr><td>Cellhesion 200セットアップ モーターステージを装備</td><td>JPK/Bruker</td><td></td><td>AFMインデンテーション測定用</td></tr><tr><td>CellSenseエントリー</td><td></td><td></td><td>ステレオスコープオリンパスUC90</td></tr><tr><td>ダルベッコでのイメージング用s リン酸緩衝生理食塩水 (DPBS, 1x)</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td>ビブラートーム下のサンプルと切片を洗浄するには</td></tr><tr><td>FIJI (ImageJ2)</td><td>https://imagej.net/software/fiji</td><td>version 2.9.0/1.53t</td><td>画像処理用</td></tr><tr><td>GraphPad Prism</td><td>GraphPad Software</td><td>(version 8.4.3)</td><td>データをグラフ化し、統計的に分析するには</td></tr><tr><td>熱不活性化FBS</td><td>Gibco</td><td>10270-106</td><td>細胞用培養液</td></tr><tr><td>ヒストアクリル接着剤 (2-ブチル-シアノアクリレート)</td> <td>ブラウン</td><td></td><td>サンプルをシャーレに接着するには</td></tr><tr><td>Hoechst 33258</td><td>Abcam</td><td>ab228550</td><td>組織を染色するには</td></tr><tr><td>インスリン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5500</td><td>細胞培養培地用</td></tr><tr><td>倒立共焦点顕微鏡</td><td>Zeiss</td><td>780 LSM</td><td>組織切片を画像化する</td></tr><tr><td>倒立共焦点顕微鏡</td><td>Zeiss</td><td>980 LSM</td><td>組織切片を画像化するには</td></tr><tr><td>JPK/Bruker データ処理ソフトウェア</td><td>JPK/Bruker</td><td>SPM 6.4</td><td>力-距離曲線を分析するには</td></tr><tr><td>L15 培地 (Leibovitz)</td> <td>Sigma</td><td>L1518</td><td>細胞培養培地用</td></tr><tr><td>L-グルタミン</td><td>Gibco</td><td>25030-024</td><td>細胞培養培地ペ</td></tr><tr><td>ニシリン/ストレプトマイシン</td>用 <td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>細胞用培養液</td></tr><tr><td>ポリスチレンビーズ(20&マイクロ;m直径);)</td><td>microParticles</td><td></td><td>AFMインデンテーション測定用</td></tr><tr><td>Pyjibe</td><td>Paul M&uuml著;ller https://github.com/AFM-analysis/PyJibe</td><td>0.15.0</td><td>粘弾性解析用</td></tr><tr><td>ステレオスコープ オリンパスSX10</td><td>オリンパス</td><td>SX10</td><td>四肢切断および組織固定用</td></tr><tr><td>ステレオスコープ オリンパスUC90</td><td>オリンパス</td><td>UC90</td><td>イメージング用</td></tr><tr><td>ビブラトームライカ</td><td>ライカ</td><td>VT 1200S</td><td>組織切片化用</td></tr></tbody></table>

無傷および再生中のウーパールーパー四肢の軟骨の原子間力顕微鏡測定

Atomic Force Microscopy Measurements of Cartilage in Intact and Regenerating Axolotl Limbs

上記のプロトコルを使用して、我々は、初期の軟骨組織溶解中、および後の軟骨凝縮段階(図1A)の間に、恒常性(「無傷」)状態で軟骨ウーパールーパー四肢組織の見かけのヤング率を測定した。また、カンチレバーの位置を示す画像に示されているように、中心と周辺を含むさまざまな領域の骨格要素の機械的特性を調査しました(図1B)。組織構造を表示し、それを剛性測定値と相関させるために、横方向の組織切片または測定が行われた組織ブロックのいずれかを固定し、アクチンフィラメントと核をそれぞれAlexa Fluor 488標識ファロイジンとヘキストで染色しました(図1C)。無傷の肢では、半径は尺骨よりも明らかに大きいが、両方の軟骨骨格要素は同様の形態を持ち、中央に均等に分布した丸い核があり、軟骨周囲に対応する扁平な核のリングに囲まれている24。組織溶解期には、組織構造の劇的な変化が検出され、骨格要素内の核が無秩序で密度が低くなりました。その後の軟骨凝縮段階では、核は再び組織化され、新たに形成された軟骨と周囲の再生組織との間に明確な境界が設けられます。しかし、この段階ではほとんどの原子核が平らになっており、中心と周辺の間に明確な形態上の違いはありません。
頬足領域(橈骨と尺骨)に存在する両方の骨格要素の横断面を測定したところ、無傷の四肢に区別できない明らかなヤング率が検出され、中央値はそれぞれ10.95 kPa±11.69 kPa、15.71 ± 6.49 kPa(図2D、左)であり、これは解剖学的類似性と一致しています(図1C)。興味深いことに、軟骨の中心 と 周辺部の分析では、無傷の状態で、中央の見かけのヤング率は周辺部よりも高く、中央値はそれぞれ16.48±6.86kPa対7.53±4.63kPaでした(図2E、左)。切断後5日目には、組織融解期に対応して、橈骨と尺骨の見かけのヤング率が大幅に減少しました(それぞれ0.03 ± 0.02 kPa、0.13 ± 0.09 kPa、 図2D、右)が、中心と周辺の違いも消え、ヤング率の中央値はそれぞれ0.11 ± 0.07 kPa、0.27 ± 0.34 kPaでした(図2E、右)。後の再生段階で軟骨特性を解析すると、軟骨が凝縮し始めた時点で、見かけのヤング率の有意な増加が検出され、無傷の段階と組織分解期の中間値(0.77 ± 0.29 kPa、 図2F)に達しました。
提供された例の曲線(図2B)に見られるように、ほとんどのアプローチ曲線と収縮曲線のペアの間でヒステリシスが発生し、力が加わった組織の粘弾性応答を示しています。さらに、さまざまな組織の粘弾性特性をより詳細に分析することに着手しました。複数の周波数にわたる振動測定は時間がかかり、特に複数の組織領域をマッピングする際に、組織の完全性を維持する上でやや重要であるため、カンチレバー26を即時に収縮させる前に力-距離曲線のアプローチ部分を適合させることができるAbuhattumらによって以前に発表された方法を使用しました.このモデルは、Kelvin-Voigt Maxwellモデル要素に基づいており、以前に細胞とヒドロゲル26、ならびに膵臓組織27の粘弾性特性の分析に適用されている。再生の異なる段階の組織について得られた中央の非弛緩弾性率(無傷:23.05 kPa、組織分解:0.20 kPa、凝縮軟骨:1.60 kPa)と見かけのヤング率(無傷:17.54 kPa、組織分解:0.07 kPa、凝縮軟骨:1.54 kPa)は、有意差を示しました(図2G-H)。全体として、変形に対する組織の主に弾性応答は、選択された変形速度で観察され、これは、緩んでいない弾性率と見かけの弾性率の大きな類似性に反映されています(図2G、H)。組織溶解期(0.72 Pa・s)では、インタクト(2.06 Pa・s)および凝縮軟骨期(2.32 Pa・s)と比較して、見かけの粘度の中央値の中央値が有意に低くなりました(図 2I)。予想通り、PyJjibe解析の見かけのヤング率(図2H)は、JPKデータ処理ソフトウェア(図2F)によって得られた値と高く一致していました。
結論として、機械的特性評価は、再生プロセス中の動的組織再構成を反映しています。これらの測定値は、組織構造の観察された変化(図1C)とともに組織の硬さが減少し、再生中に徐々に回復するという解剖学的観察と一致しています。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66946/66946fig01v2.jpg"> 図1:再生中のウーパールーパー四肢軟骨のくぼみ測定(A)再生段階の概略図。破線は、測定が行われたビブラトームによって生成された横方向のセクションのおおよその位置を示しています。(B)四肢軟骨の中心(上)と周辺(下)の測定の代表的な画像。黒い先端がカンチレバーです。スケールバー:100μm.(C)無傷の手足の組織構造(左)、組織溶解中の組織(中央)、軟骨の凝縮(右)。緑:核(Hoechst)、マゼンタ:アクチンフィラメント(ファロイジン)。スケールバー:500μm.C'パネルに輪郭が描かれた拡大領域。スケールバー:100μm。70 μm x 70 μmのくぼみグリッドは、白(中央)と黄色(周辺)の点線で示されます。パネルBとCでは、文字RとUはそれぞれRadiusとUlnaを示しています。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66946/66946fig01largev2.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66946/66946fig2v5.jpg"> 図2:AFMによるウーパールーパー四肢再生中の軟骨剛性の測定(A)AFMインデンテーション実験の概略図を、時間の関数としての力(上)と圧子とサンプルの間の距離の関数としての力(下)として示しました。アプローチカーブとリトラクトカーブは、それぞれ青と赤で表示されます。接触点は、黒の縦破線で表示されます。フォースインデンテーション曲線は、Hertz/Sneddonモデル(JPKデータ処理ソフトウェアおよびPyjibe)またはPyjibeの粘弾性KVMモデル拡張を使用して、曲線のアプローチ部分内に収まりました。(B)組織溶解および凝縮軟骨期における無傷および再生中の四肢のAFM測定からの代表的な力-距離曲線。解析可能な曲線(アーティファクトなし)の割合は、各曲線の右上隅に示されます。(C)力-圧痕曲線の典型的なアーティファクトの例、たとえば、圧子と表面の不適切な接触によるもの。示されている例は無傷の手足に対応していますが、すべての条件で同等の種類のアーティファクトが観察されました。B-Cの場合:代表的な力-距離曲線をPyjibeを使用してフィットさせ、表示しました。水色の曲線は曲線のアプローチ部分を表し、薄い赤色の曲線は後退部分を表しています。濃い青色の線は、球状の圧子に適した適用されたヘルツ/スネドンです。フィットからのそれぞれの残差は、ボトムフォース-距離曲線について下に示します。プロットされた残差は、適合値と実際の力値の差を表します。(D)無傷の四肢で測定され、組織溶解を受けている橈骨および尺骨中心の見かけのヤング率。(E)無傷の四肢および組織溶解中の軟骨中心対末梢(Peri)の明らかなヤング率。(F)再生の分析段階で軟骨中心について測定された見かけのヤング率。D-Fの場合:各ドットは、解析に成功した1つの力-距離曲線から導出され、大きいドットはサンプルあたりの中央値に対応します。見かけのヤング率は、JPK BrukerソフトウェアのHertz/Sneddonモデルフィットを使用して取得されました。(G-I)非弛緩弾性率(G)、見かけのヤング率(H)、および見かけの粘度(I)は、再生の分析段階での軟骨中心測定からPyJibe(KVM拡張)を使用して計算されました。各ドットは、解析に成功した1つの力-距離曲線から導出されます。線は、条件ごとのすべての測定値の中央値に対応します。D-Iの場合:Kruskal-WallisとDunnの多重比較検定。異なる文字は、統計的に互いに異なる条件を表します (p &lt; 0.05)。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66946/66946fig2v5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

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