集積光と原子間力顕微鏡による研究機械的刺激に対する細胞応答を生きる

機械的刺激に対する細胞のリアルタイム応答の研究は、まずガラス底の皿の上でGFP融合タンパク質を発現する細胞を増殖させることによって達成されます。2番目のステップは、A FMチップをビオチン化フィブロネクチンでコーティングすることです。次に、官能基化されたFMチップを細胞表面に接触させて、A FMチップの周囲に強い焦点接着を形成することで、フィブロネクチンコーティングチップと細胞との間のマトリックスインテグリンアクチン結合を介してAct細胞骨格を直接操作することができます。

最後のステップは、A FMチップの上向きの動きを制御することにより、生細胞を機械的に刺激し、強い焦点接着を壊すことなく細胞接触点に垂直方向の力が加えられるようにすることです。最終的に、結果は、細胞が基質への接着を強化し、リアルタイムの蛍光光学イメージングで記録されたアクチン細胞骨格の再編成を誘導することにより、機械的刺激に応答することを示しています。こんにちは、私はAndrea Trake、テキサス州およびm健康科学センターのシステム生物学およびトランスレーショナル医学部門の助教授です。

こんにちは、Sum Limです。私は、テキサス州および健康科学センターのシステム生物学およびトランスレーショナル医学部門の博士研究員です。今日は、機械的刺激に対する適応細胞リモデリングを研究するための手順をご紹介します。

私たちの研究室では、この手順を使用して、生きた血管平滑筋細胞のリアルタイムな細胞骨格リモデリングを調査しています。それでは始めましょう。これらの研究では、全反射蛍光または芝アタッチメントを備えた倒立型オリンパスIX 81顕微鏡とCSU 22横河スキャニングヘッドを組み合わせて使用します。

倒立型光学顕微鏡の上にバイオスコープSZ原子間力顕微鏡が取り付けられています。システム全体は研究グレードの光学テーブルに取り付けられており、以前に詳細に説明されています。この統合顕微鏡は、2つの定量EM電子増倍電荷結合デバイスまたはE-M-C-C-Dカメラを使用します。

1つは芝生イメージング用で、もう1つは共焦点イメージング用です。スピニングディスクスキャナーの外部フィルターホイールとE-M-C-C-Dカメラで構成される共焦点アセンブリは、振動減衰に必要なシリコンパッドの上に置かれたアルミニウムベースプレートに取り付けられています。共焦点アセンブリ全体は、ネジ付きカラー付きのフランジを介して顕微鏡と接続されます。

したがって、原子間力顕微鏡法またはFM測定中にアセンブリを顕微鏡から切り離して、回転ディスクスキャナーからの振動を回避できます。アルゴンクリプトンレーザーは、ターフイメージングモードと共焦点イメージングモードの両方の励起源として使用されます。レーザーは、2本の光ファイバーのいずれかに結合でき、レーザーを芝生アタッチメントまたは共焦点スキャンヘッドに送達します。

2つ目は、コンピューターがシステムを制御することです。1つは光学イメージングを制御するスライドブックソフトウェアを利用し、もう1つは、機械的刺激実験の24時間前にA FMを制御するナノスコープソフトウェアを使用して、ガラス底の細胞培養皿に特定のタンパク質を標的とするGFPコンストラクトを発現する生細胞を配置します。実験当日は、細胞培養培地をフェノールレッドフリー培地に交換してください。

FM実験はノイズに非常に敏感であるため、ノイズを最小限に抑えるために、実験中は光学テーブルや顕微鏡で話したり触れたりしないでください。FM測定では、スピニングディスク共焦点を顕微鏡から切り離します。実験は、細胞培養皿を磁気カラー付きのFMステージに取り付けて、皿を磁気顕微鏡ステージに固定することから始まります。

A FMプローブのV字型カンチレバーは、2ミクロンのビオチン化ガラスビーズでカスタマイズされています。カンチレバーは顕微鏡で簡単に見ることができます。ビーズはカンチレバーの最後に接着されており、ここにコーティング溶液を滴下する必要があります。

実験用のFMプローブを準備するには、まずチップをグラスホルダーに取り付け、次にグラスホルダーをテーブルマウントに置いてチップをコーティングします。チップの最後に10マイクロリットルのドコスリン酸緩衝生理食塩水またはDPBSを慎重に滴下してチップを洗い、次にキムワイプを使用してチップを乾かします。DPBSで1ミリグラム/ミリリットルで洗浄した後、この手順を5回繰り返します。

ソリューションに熱心です。先端にドロップワイズ。アバドンコーティング後、チップを5分間インキュベートします。

DPBSで先端をさらに5回洗います。次に、ビオチン化フィブロネクチンをアバドンに架橋し、1ミリグラム/ミリリットルの溶液を添加します。チップに滴下し、5分間インキュベートします。

最後に、DPBSでチップを再度5回洗い、最後の一滴をチップに残します。チップの準備ができたら、チップをFMスキャナーに取り付けます。FMチップを取り付けた後、ホルダーの周りに保護シリコンスカートを配置します。

次に、ビデオ視聴の顕微鏡をセットアップします。次に、FMチップを視野の中央に合わせます。カンチレバーの一番端にレーザービームを配置して、光学レバーをセットします。

次に、対物レンズをシングルセルイメージングに適した高倍率対物レンズに変更します。次に、機械的に刺激されるセルを視野に持ち込み、A FMチップがセル表面に着地する場所を選択します。最後に、その特定のセルに着地するまでFMチップを下げます。

チップを細胞に接触させた後、約20分間待ちます。これにより、細胞表面のFM接触点に強力な焦点接着が形成されます。待機期間の後、機械刺激実験の準備を開始することができます。

ビデオカメラからE-M-C-C-Dカメラに切り替えて、蛍光細胞を観察してイメージングできるようにします。次に、静止している細胞の初期画像を取得します。スピニングディスクと発声顕微鏡を使用して、細胞体全体の細胞骨格の作用を視覚化します。

逆に、芝を使用して焦点接着を視覚化し、細胞を刺激します。カンチレバーを使用して、3〜5分ごとに個別のステップで制御された上向きの動きを適用します。A FMデータを取得する際には、オペレーターがZ piso位置の電圧を常に監視して、垂直ポールの適切なタイミングを決定することが重要です。

FMデータ取得と同時に、スライドブックソフトウェアを使用して、各垂直プル後のセルの共焦点または芝の画像を記録します。最後に、刺激実験の完了時にFMチップを細胞から引き抜きます。アクチンMRFPおよびvculによる血管平滑筋細胞トランスフェクト。

GFPは、頂端細胞表面でFMを使用してイメージングされました。同じ細胞を基底細胞表面の芝を使用して画像化しました。ここでは、2 つの画像が重なっています。

同じ細胞の画像も、細胞体全体でスピニングディスク共焦点を使用して取得され、3Dスタックの最大投影として示されています。A FMとスピニングディスクの共焦点画像との間の良好なオーバーラップが示されています。アクチンMRFPをトランスフェクトした血管平滑筋細胞をA FMで機械的に刺激し、スピニングディスク共焦点顕微鏡で画像化した。

エラーは、FM刺激に対して顕著な再構築を示す作用性繊維を示しています。一部の作用繊維は重合し、他の作用繊維は機械的刺激によって解重合し、他の作用繊維は束ねられます。アクトリストラにより、EFMを使用して生命販売文化を機械的に刺激すると同時に、光学イメージング手法を使用してCY再配置を記録する方法を示しました。

この手順を実行するときは、FM実験が非常にノイズが多く、感度が高いことを覚えておくことが重要です。というわけで、これだけです。ご覧いただきありがとうございます、そしてあなたの発言に頑張ってください。