Name: 集積光と原子間力顕微鏡による研究機械的刺激に対する細胞応答を生きる (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-10-04T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: 学ぶ 集積型原子間力顕微鏡と蛍光イメージングを用いた生細胞の機械的刺激応答解析法。GFP融合タンパク質発現細胞でアクチン細胞骨格の動的再構成をリアルタイムで観察し、細胞接着と力学的応答のメカニズム解明に活用できます。

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ビンキュリン- GFPプラスミドは、歯科および頭蓋顔面研究所の国立研究所のケネス山田、国立衛生研究所から贈られた、プラスミドベセスダ、メリーランド州、およびアクチン- MRFPはマイケルソン、フロリダ州立大学、タラハシー、フロリダ州から寄贈されたもの。 この作品は、Andreea TracheにNSFのキャリア賞＃0747334とAHA -ナショナルSDG＃0835205Nによってサポートされていました。

1。統合顕微鏡システムの概要これらの研究に使用される顕微鏡システムは、詳細1に記載されている。簡単に言えば、TIRFアタッチメント（オリンパス、センターバレー、ペンシルバニア州）と反転オリンパスIX - 81顕微鏡は、CSU - 22横河スキャニングヘッド（横河電機株式会社、日本）と組み合わされる。ビオスコープSZ原子間力顕微鏡（Veeco社インスツルメンツ社、サンタバーバラ、カリフォルニア州）は、光学倒立顕微鏡の上部に取り付けられており、全体のシステムは研究用光学テーブルの上（ニューポート、アーバイン、カリフォルニア州）に配置されます。 回転ディスクスキャナー、外付けのフィルターホイールとそのEMCCDカメラ（ローパーサイエンティフィック- Photometrics、ツーソン、アリゾナ州）から構成される共焦点アセンブリは厳密に振動減衰のために必要なシリコンパッド上に配置アルミベースプレートと接続​​されています。共焦点スキャナは、回転ディスクスキャナからの振動がAFMの測定に影響を与えるしませんようにAFM測定、中に顕微鏡から切り離すことができる踏み襟付きのフランジを介して顕微鏡に接続します。アルゴンクリプトンレーザー（スペクトラフィジックス、マウンテンビュー、カリフォルニア州）はそれぞれ、全反射と共焦点イメージングの両方のモードの励起源として使用され、全反射の添付ファイルまたは走査ヘッドにレーザーを提供する2本の光ファイバで交互に結合することができます。 。 2台のコンピュータがシステムを制御します。Slidebookソフトウェアは、光学イメージングを制御し、ナノスコープのソフトウェアは、AFMを制御します。 2。細胞の文化特定のタンパク質を標的とGFPコンストラクトを発現している生きている細胞は、24時間前に機械的刺激実験にグラスボトム細胞の培養皿に配置する必要があります。実験日にフェノールレッドを含まない培地で細胞培養の培地を交換してください。細胞培養ディッシュは、磁気襟とAFMステージに搭載されている。 3。 AFMチップの調製と顕微鏡のセットアップ 2ミクロンでカスタマイズAFMチップは、ガラスビーズをDPBSで5回洗浄し、アビジン（1 mg / ml）を、5分間インキュベートし、DPBS 5回で再び洗浄し、1 mg / mLのbiotinilatedで5分間インキュベートされますbiotinilatedフィブロネクチン。先端には、エンド2でさらに5回洗浄し、AFMスキャナ上にマウントし、保護シリコンスカートは、ホルダーの周囲に配置されますされます。視野の中心にAFMの先端を揃えるために、ビデオ視聴のための顕微鏡を設定します。カンチレバーの一番最後にレーザービームを配置することにより、光てこを合わせ、単一細胞イメージングのための適切な高倍率にする目標を変更してください。先端のばね定数は、実験開始前に決定する必要があります。このパラメータは、ナノスコープのソフトウェアで利用可能な熱調整法を用いて測定されます。蛍光イメージングを可能にするためにビデオカメラからEMCCDカメラに切り替えます。その後、セルを選択し、その特定の細胞と接触AFMの先端をもたらす。 20分が細胞表面との接触AFMの時点で形成するために強力な接着斑のために必要な時間を、待機した後、機械的な刺激の手続きが開始されます。 4。ライブセルの機械的刺激 3月4日全反射イメージングは、接着斑の可視化と定量化のための選択の方法となり、回転ディスク共焦点イメージング5は、細胞体全体にアクチン細胞骨格を可視化するために使用されます。 AFM 6は流体下での接触モードのイメージングに使用されます。 セルの全反射や共焦点画像は、機械的な刺激の手順を開始する前に取得されます。機械的な刺激は、一定期間（1〜1.5時間）以上のすべての3〜5分離散的なステップで上方に移動される官能化されたAFMのプローブによって誘導されます。細胞の反応性応答は1秒の単位時間を表す画像の各ライン、高さのイメージとして、ナノスコープのソフトウェアで連続して記録されます。 AFMデータの取得中、オペレータは、常時AFMチップのZ位置は、次のプルダウンのための適切なタイミングを決定するために監視します。 各機械的な刺激の後にそれが継続的にAFMのデータを取得しながら、Slidebookソフトウェアにおけるセルの全反射や共焦点画像を取得することが可能です。光学画像は、アクチン細胞骨格と接着斑の再編成を示してムービーを作成するためにオフラインで処理することができます。また、各画像は、セル面積、特定のタンパク質の領域を決定する、と一般的な細胞形態を分析するために定量的に処理することができます。 実験の終わりにAFMの先端が細胞から回収され、AFMチップの感度は、ナノスコープのソフトウェアで測定されます。 実験は、非常にノイズに敏感です！ EX中に触れてどんな話したり、顕微鏡perimentは避けてください。 AFM測定でノイズを最小限に抑えるために、回転するディスク共焦点は、顕微鏡からデ結合してください。細胞表面と探針の間に強力な接着斑を形成するために待っている時間は、使用する細胞の種類、チップ上の行列のコーティングによって異なる場合があります。 5。代表的な結果<img src="/files/ftp_upload/2072/2072fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1。アクチン- MRFPとビンキュリン- GFPをトランスフェ同じ血管平滑筋細胞（VSMC）は次式で画像化した。頂端細胞表面での（A）AFM、（B）基底細胞の表面で全反射、および（C）回転ディスク共焦点顕微鏡細胞体全体に。共焦点画像は3 - Dスタックの最大投影として示されています。 AFMとTIRFや回転するディスク共焦点画像間の良好なオーバーラップは（D）及び（E）、それぞれに示されています。画像サイズは64 × 50ミクロンです。 <img src="/files/ftp_upload/2072/2072fig2.jpg" alt="図2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2"> 図2。アクチン- MRFPでトランスフェクトしたVSMCは、機械的にAFMによって刺激され、回転するディスク共焦点顕微鏡で画像化した矢印はそのアクチン繊維を示す：（a）は厚く/重合、（b）の解重合/消える、または（c）により、一緒に結束アクチンの再構築へ。白い点線は、セルの上にAFMチップを表します。画像サイズポスター91 x 91ミクロン。

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</ol>

利害の衝突は宣言されません。

細胞骨格7-10と接着斑11-16細胞が移動または機械的な力17に対応するように、組み立て分散とめくる動的な構造です。彼らは、細胞増殖、生存、および遺伝子発現の調節において重要な機能を持っています。彼らの特定の分布と動態を知ることは、細胞がマトリックスで、自分自身との間の通信方法のより良い理解を提供します。 この新しい顕微鏡システムは、任意の付着生細胞における分子動力学研究の広い範囲にわたって広く適用可能である。統合された顕微鏡は、急速なサブ細胞の変化の定量的なモニタリングを可能にし、機械的な力に反応して細胞のリモデリングの基本的なプロセスを理解する上で重要な新たなツールを提供しています。

<table><tbody><tr><td>AFMチップ</td><td>Novascan Technologies, Inc.</td><td></td><td>2 micron ホウケイ酸ビーズ, 0.01N/m, ビオチン表面</td></tr><tr><td>アビジン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9275</td><td>1mg/mL in DPBS</td></tr><tr><td>フィブロネクチン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4759</td><td>1 mg/mL</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Invitrogen</td><td>21600-051</td><td></td></tr><tr><td>平滑筋細胞用Amaxaトランスフェクションキット</td><td>Lonza Inc.</td><td>VPI-1004</td><td></td></tr><tr><td>Mattekガラス底ディッシュ</td><td>MatTek Corp.</td><td>P60G-1.5-30-F</td><td>滅菌済み60mm Falconディッシュ、ガラス底カバーガラス no. 1.5付き</td></tr></tbody></table>

集積光と原子間力顕微鏡による研究機械的刺激に対する細胞応答を生きる

Live Cell Response to Mechanical Stimulation Studied by Integrated Optical and Atomic Force Microscopy

高い空間分解能と時間分解能を持つサブ細胞レベルでの細胞の挙動を調査することができる新技術、生きている細胞は機械的な力を感知するメカニズムを理解するために、およびそれらがどのように対応し、その環境に適応することは開発されました。このように、原子間力顕微鏡（AFM）は、全内部反射蛍光（全反射）顕微鏡と高速回転ディスク（FSD）共焦点顕微鏡と統合されました。統合されたシステムは、リアルタイムでの機械的刺激への細胞応答の直接光イメージングを可能にする、任意の付着生細胞における分子動力学研究の広い範囲にわたって広く適用可能である。アクチンフィラメントと接着斑の大幅な再編成が原因で、細胞体全体の細胞構造に変化を誘導することが頂端細胞の表面での局所力学刺激することが示された。これらの革新的な技術は、機械的な力に反応して生細胞の再構築とダイナミクスを理解するための新たな情報を提供します。機械的な刺激にショーの生細胞応答が記載されている詳細なプロトコールと代表的なデータセット。

本論文では、培養中の生細胞の機械的刺激のための統合された原子間力光学イメージング顕微鏡の操作で、リーダーに指示することを目指しています。ステップバイステップのプロトコルが表示されます。機械的な刺激に生細胞の応答を示す代表的なデータセットが表示されます。

生細胞が機械的な力を感知するメカニズム、およびそれらがどのように環境に反応し適応するかを理解するためには、...を可能にする新しい技術が（必要です）。

機械的刺激に対する細胞のリアルタイム応答の研究は、まずGFP融合タンパク質を発現させた細胞をガラスボトムディッシュで24時間培養することから始まります。次のステップでは、AFMチップをビオチン化フィブロネクチンでコーティングします。その後、機能化されたAFMチップを細胞表面に接触させ、AFMチップの周囲に強固な焦点接着を形成させます。これにより、フィブロネクチンでコーティングされたチップと細胞との間のマトリックス・インテグリン・アクチン連結を介して、アクチン細胞骨格を直接操作することが可能になります。最終ステップは、AFMチップを制御しながら上方に移動させ、生細胞を機械的に刺激することです。これにより、強力な焦点接着を破壊することなく、細胞の接触点に垂直方向の力が加わります。最終的に、リアルタイム蛍光光学イメージングで記録された結果から、細胞は基質への接着を強化し、アクチン細胞骨格の再編成を誘導することで、機械的刺激に反応することが示されました。こんにちは、テキサスA&amp;Mヘルスサイエンスセンターのシステム生物学・トランスレーショナル医学部の助教授、Andrea Trakeです。こんにちは、Sum Limです。私はテキサスA&amp;Mヘルスサイエンスセンターのシステム生物学・トランスレーショナル医学部門で博士研究員を務めています。本日は、機械的刺激に対する細胞の適応的リモデリングを研究するための手順をご紹介します。当研究室では、生きた血管平滑筋細胞における細胞骨格のリアルタイムな再構成を調べるためにこの手順を用いています。それでは、始めていきましょう。これらの研究では、全内部反射蛍光（TIRF）アタッチメントとCSU 22 Yokogawaスキャニングヘッドを組み合わせたOlympus IX 81倒立顕微鏡を使用します。倒立光学顕微鏡の上にBio Scope SZ原子間力顕微鏡が搭載されています。システム全体は研究グレードの光学定盤上に設置されており、その詳細は既報の通りです。この統合顕微鏡では、2台のQuant EM電子増倍電荷結合素子（EMCCD）カメラを使用しています。一方はターフイメージング用であり、もう一方は共焦点イメージング用です。回転円盤スキャナー、外部フィルターホイール、およびE-M-C-C-Dカメラで構成される共焦点アッセンブリは、振動減衰に必要なシリコンパッドの上に配置されたアルミニウムベースプレートに取り付けられています。共焦点アッセンブリ全体は、ネジ付きカラーを備えたフランジを介して顕微鏡に接続されます。これにより、スピンディスクスキャナーからの振動を避けるため、原子間力顕微鏡（AFM）またはFM測定時にアセンブリを顕微鏡から切り離すことができます。アルゴンクリプトンレーザーが、turfおよび共焦点イメージングモードの両方の励起光源として使用されます。レーザーは2本の光ファイバーのいずれかに結合させることができ、これによりレーザーがturfアタッチメントまたは共焦点スキャンヘッドに供給されます。2台のコンピュータでシステムを制御します。1台はスライドブックソフトウェアを用いて光学イメージングを制御し、もう1台はナノスコープソフトウェアを用いてAFMを制御します。機械的刺激実験の24時間前に、特定のタンパク質を標的としたGFPコンストラクトを発現させた生細胞を、ガラスボトム細胞培養ディッシュに播種します。実験当日、細胞培養培地をフェノールレッドフリー培地に変更します。a FM実験はノイズに非常に敏感であるため、ノイズを最小限に抑えるために、実験中は会話を避け、光学定盤や顕微鏡に触れないようにしてください。a FM測定では、回転ディスク共焦点顕微鏡を顕微鏡本体から切り離します。まず、磁気カラーを用いて細胞培養ディッシュを磁気顕微鏡ステージに固定し、a FMステージに装着することから実験を開始します。AFMプローブのV字型カンチレバーには、2 µmのビオチン化ガラスビーズが装着されています。カンチレバーは顕微鏡で容易に確認できます。ビーズはカンチレバーの最先端に接着されており、ここにコーティング溶液を滴下します。実験用のFMプローブを準備するには、まずチップをガラスホルダーに取り付け、次にチップをコーティングするためにガラスホルダーをテーブルマウントに設置します。チップの先端に10 µLのdocosリン酸緩衝生理食塩水（DPBS）を慎重に滴下してチップを洗浄し、キムワイプでチップを拭き取ります。1 mg/mLのDPBSで洗浄した後、この手順を5回繰り返します。Avidを溶液中に準備します。チップの先端に滴下します。Avadonコーティング後、チップを5分間インキュベートします。チップをDPBSでさらに5回洗浄します。次に、1 mg/mLのビオチン化フィブロネクチン溶液をチップに滴下し、5分間インキュベートして、アバドン上に架橋させます。最後に、チップをDPBSでさらに5回洗浄し、チップの先端に最後の一滴を残します。チップの準備が完了したら、チップをa FMスキャナーに取り付けます。a FMチップを取り付けた後、ホルダーの周囲に保護用シリコンスカートを配置します。次に、ビデオ観察用に顕微鏡をセットアップします。続いて、FMチップを視野の中心に合わせます。レーザービームをカンチレバーの最先端に配置し、光学レバーを設定します。次に、単一細胞イメージングに適した高倍率の対物レンズに切り替えます。続いて、機械的刺激を与える細胞を視野に入れ、AFMチップを細胞表面のどの位置に着地させるかを選択します。最後に、AFMチップを、その特定の細胞に接触するまで降ろします。チップを細胞に接触させた後、約20分間待ちます。これにより、細胞表面のFM接触点に強力な焦点接着が形成されます。待機期間の後、機械的刺激実験の準備として、機械的刺激の手順を開始することができます。ビデオカメラからEMCCDカメラに切り替え、イメージング用に蛍光細胞を視認できるようにします。次に、静止状態にある細胞の初期画像を撮影します。スピニングディスク共焦点顕微鏡を用いて、細胞体全体のアクチン細胞骨格を可視化します。逆に、細胞を刺激するために、ターフを用いて焦点接着を可視化します。カンチレバーを使用して、3〜5分ごとに不連続なステップで制御された上方への移動を適用します。AFMデータを取得している間、オペレーターはZピエゾ位置の電圧を常に監視し、垂直方向の操作の適切なタイミングを判断することが重要です。FMデータの取得と同時に、Slidebookソフトウェアを用いて、垂直方向の牽引を行うたびに細胞の共焦点またはTURF画像を取得します。刺激実験の完了後、最後にaFMチップを細胞から取り出します。actin MRFPおよびvculをトランスフェクトした血管平滑筋細胞。FMを用いて、細胞頂端面のGFPを撮像しました。同じ細胞の細胞基底面をturfを用いて撮像しました。ここでは、これら2つの画像を重ね合わせています。同じ細胞の画像は、回転円盤共焦点顕微鏡を用いて細胞体全体にわたって取得され、3Dスタックの最大輝度投影として示されています。AFMと回転円盤共焦点顕微鏡画像の良好な重なりが確認できます。actin MRFPを導入した血管平滑筋細胞にAFMで機械的刺激を与え、回転円盤共焦点顕微鏡で撮像しました。これらの誤差は、FM刺激によって顕著な再構成を示すアクチン線維を示しています。機械的刺激により、一部のアクチン線維は重合し、別の線維は脱重合し、さらに別のアクチン線維は束状になります。アクチンの再構成に基づき、EFMを用いて生細胞培養に機械的刺激を与えながら、光学イメージング法を用いて細胞骨格の再編成を同時に記録する方法を提示しました。この手順を行う際は、FM実験が極めてノイズが多く、感度が非常に高いことに留意することが重要です。以上となります。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験がうまくいくことを願っております。

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