Name: 原子間力顕微鏡を用いたヒト関節軟骨外植片のマイクロインデンテーションにおける実用的課題への対処 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-10-28T14:10:00.000+00:00
Duration: 8 min 6 s
Description: 学ぶ 原子間力顕微鏡マイクロインデンテーションを用いたヒト関節軟骨外植片の作製法。変形性関節症の進行における軟骨の力学的特性を評価し、診断・治療アプローチの開発に有用なモデルを提供します。

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組織サンプルを提供してくださったテュービンゲン大学病院整形外科の整形外科医に感謝します。

著者は何も開示していません。

進行性および多因子性疾患として、OAは関節軟骨の構造的および機能的変化を引き起こします。OAの過程を通じて、機械的特徴の障害は、関節軟骨の表面における構造的および生化学的変化を伴う27,31。OAで発生する最も初期の病理学的事象は、コラーゲンネットワークの破壊と組み合わされたプロテオグリカンの枯渇である32,33,34。このような初期の微妙な表面変化は、機械的挙動が組織全体の深さにわたって平均化されるため、バルク試験で特定して特定することは困難です。さらに、臓器や組織レベルでの機能的変化が、ミクロまたはナノスケールの構造的および機能的変化に関連しているかどうかという問題もまだ解決されていません。このため、AFMは最も感度の高い方法の1つであり、OA発症に伴って発生する最も初期の生体力学的変...

電子機器やシステムの小型化に伴い、マイクロ・ナノベースの技術や機器の急速な発展が加速しています。そのようなデバイスの1つが原子間力顕微鏡(AFM)で、生体表面をスキャンし、ナノメートルスケールとマイクロメートルスケールの両方で地形情報または生体力学的情報を取得できます1,2。その膨大な機能の中で、このツールは、さまざまな生物学的システムの機械的特性に関する情報を取得するためのマイクロおよびナノインデンターとして操作できます3,4,5,6。データは、先端部で約1nmと小さくなり得る機械プローブを介して表面と物理的に接触することによって収集される7。次に、試料の結果として生じる変形は、片持ち梁先端のくぼみの深さと試料8に加えられた力に基づいて表示される。
変形性関節症(OA)は、関節および周辺組織の関節軟骨の劣化を特徴とする長期の変性慢性疾患であり、骨表面の完全な露出につながる可能性があります。オープンアクセスの負担は相当なものです。現在、65歳以上の女性の半数、男性の3分の1がOA9に罹患しています。外傷、肥満、およびその結果生じる関節10の変化した生体力学は、関節軟骨変性を決定し、これは一般的な最終結果と見なされる。Ganzらの先駆的な研究は、OAプロセスの初期段階には軟骨の生体力学的特性が関与している可能性があると仮定し11、それ以来、研究者はこの仮説を確認してきました12。同様に、組織の生体力学的特性は、超微細構造組織、ならびに細胞間および細胞マトリックスのクロストークによって機能的に調整されることが一般的に認められています。いかなる変化も、組織全体の生体力学的機能に劇的な影響を与える可能性がある13。今日まで、OA診断は臨床的であり、プレーンフィルムX線撮影に基づいている14。このアプローチは2つの側面があります:第一に、OAの診断を定式化するための定義された変性カットオフ閾値がないため、状態の定量化が困難になり、第二に、イメージング法は感度と標準化を欠いており、局所的な軟骨損傷を検出できません15,16,17。この目的のために、軟骨の機械的特性の評価は、疾患の病因に関係なくOAの過程で変化するパラメータを記述し、非常に早い段階で組織の機能に直接影響を与えるという決定的な利点を有する。圧痕器具は、組織が圧痕に抵抗する力を測定します。実際、これは新しい概念ではありません。初期の研究は1980年代と1990年代にさかのぼります。この時期、多くの研究により、関節軟骨の関節鏡視下測定用に設計された圧痕器具が軟骨の変性変化を検出するのに適している可能性があることが示唆されました。30年前でさえ、いくつかの研究は、関節鏡検査中に圧縮剛性測定を行うことにより、組織変性中の軟骨表面のin vivo変化をインデンテーション機器が検出できることを実証することができました18,19,20。
関節軟骨のAFMインデンテーション(AFM-IT)は、組織の極めて重要な機械的特性、すなわち硬さに関する情報を提供します。これは、加えられた非破壊荷重と、くぼみのある組織領域21の結果として生じる変形との関係を記述する機械的パラメータである。AFM-ITは、巨視的に影響を受けていないコラーゲンネットワークにおける硬さの加齢による変化を定量化できることが示されており、したがって、OA発症に関連する病理学的変化(関節軟骨のアウターブリッジスケールでグレード0)を区別することができます22。AFM-ITは、軟骨細胞の早期変性を示す画像ベースのバイオマーカーとして、軟骨細胞の空間的組織化に基づいて、定量化だけでなく、最も初期の変性機械的変化を実際に特定できることを示しました。これらの発見は、すでに他の人によって確認されています23,24。したがって、AFM-ITは、初期の変性変化を診断および特定するための興味深いツールとして機能します。これらの変化はすでに細胞レベルで測定されており、OAの病態生理学的プロセスの理解を再構築しています。
このプロトコルでは、天然の軟骨外植片の準備からAFMデータの取得と処理まで、関節軟骨外植片の完全な組織学的および生体力学的等級付け手順を実証します。ステップバイステップのアプローチにより、2D大型モザイクイメージングとそれに続くマイクロAFMインデンテーションにより、変性のさまざまな段階に応じて関節軟骨組織を生成、等級付け、および視覚的に分類する方法を示します。
現在、AFM-ITは、他の機器技術と同様に、軟骨の生体力学的変化を測定するための最も感度の高いツールの1つですが7、誤ったデータ収集につながる可能性のある制限と実用的な特殊性25があります。そのために、軟骨外植片のAFM測定中に発生する最も一般的な問題を精査し、可能であれば、それらを最小化または克服する方法を説明します。これらには、サンプルの地形的側面と、AFM互換環境でサンプルを安定させることの難しさ、組織表面の物理的特性、およびそのような表面でAFM測定を行うことの難しさが含まれます。また、誤った力-距離曲線の例も示され、それらを引き起こす可能性のある条件が強調されています。また、カンチレバー先端の形状に固有の制限や、データ解析にヘルツモデルを使用することについても説明します。

<table><tbody><tr><td>Amphotericin B</td><td>Merck KGaA, Darmstadt, Germany</td><td>1397-89-3</td><td></td></tr><tr><td>原子間力顕微鏡(AFM)ヘッド&nbsp;</td><td>CellHesion 200, Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany</td><td>JPK00518</td><td></td></tr><tr><td>生体適合性サンプル接着剤&nbsp;</td><td>Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany</td><td>H000033</td><td></td></tr><tr><td>Calcein AM</td><td>Cayman, Ann Arbor, Michigan, USA</td><td>14948</td><td>軟骨椎間板の選別に使用される細胞膜透過性染色-上面図イメージング</td></tr><tr><td>カンチレバー</td><td>Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany</td><td>SAA-SPH-5UM</td><td>周波数名:30KHz、k:0.2N/m、長さ名:115&mu;m、幅公称:40&mu;メートル、&nbsp;幾何学:長方形、5&muの円筒形の先端。m終末橈骨</td></tr><tr><td>切除装置&nbsp;</td><td>自作&nbsp;</td><td>n/a</td> AFMに統合された<td>4mmx1mm CDDカメラの定義済み全体を含む切断プラスチックデバイス</td></tr><tr><td></td><td>The Imaging Source Europe GmbH, Bremen, Germany</td><td>DFK 31BF03</td><td></td></tr><tr><td>CDDカメラは蛍光顕微鏡に統合</td><td>Leica Biosystems, Wetzlar, Germany</td><td>DFC3000G</td><td></td></tr><tr><td>Cryotome</td><td>Leica Biosystems, Wetzlar, Germany</td><td>CM3050S&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Data Processing Software for the AFM</td><td>Bruker Nano GmbH, Berlin,</td> Germany <td>n/a</td><td>Version 5.0.86,&nbsp; は、次のウェブサイトから無料でダウンロードできます https://customers.jpk.com</td></tr><tr><td>Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM)&nbsp;</td><td>Gibco, Life Technologies, Darmstadt, Germany</td><td>41966052</td><td></td></tr><tr><td>蛍光顕微鏡 (Leica DMi8)</td><td>Leica Biosystems, Wetzlar, Germany</td><td>11889113</td><td></td></tr><tr><td>ガラスブロック カンチレバーホルダー</td><td>Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany</td><td>SP-90-05</td><td>JPK PetriDishHeaterTM (Bruker) で使用するために特別に設計された、角度のついた面を持つ超長ガラスブロックです。</td></tr><tr><td>倒立位相差顕微鏡(AFMに内蔵)</td><td>AxioObserver D1, Carl Zeiss Microscopy, Jena, Germany</td><td>L201306_03</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz's L-15 medium without L-glutamine&nbsp;</td><td>Merck KGaA, Darmstadt, Germany</td><td>F1315</td><td></td></tr><tr><td>Microscope glass slides</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA</td><td>CLS294775X50</td><td></td></tr><tr><td>Mounting medium With DAPI</td><td>ibidi GmbH, Gr&auml;felfing, Germany</td><td>50011</td><td>軟骨椎間板に使用される核DAPI(4&prime;,6-ジアミジノ-2-フェニルインドール)対比染色による封入剤&nbsp; サイドビューイメージング</td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>AFM(Petri Dish Heater)Bruker</td> <td>Nano GmbH, Berlin, Germany</td><td>T-05-0117</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel</td><td>Feather Medical Products, Osaka, Japan</td><td>2023-01</td><td></td></tr><tr><td>Silicone Skirt</td><td>Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany</td><td>n/a</td><td>保護シリコン膜 (D55x0.25) これは、AFMヘッド内の中程度の結露を防ぐために、グラスブロックのベースに基づいて配置されています。</td></tr><tr><td>統計プログラム - SPSS</td><td>IBM, Armonk, New York, USA</td><td>SPSS Statistics 22</td><td>Vesion 280.0.0.0 (190)</td></tr><tr><td>組織培養皿&nbsp;</td><td>TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen, Switzerland</td><td>TPP93040</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-tek O.C.T. Compound</td><td>Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Netherlands</td><td>SA6255012</td><td>水溶性包埋培地&nbsp;</td></tr></tbody></table>

原子間力顕微鏡を用いたヒト関節軟骨外植片のマイクロインデンテーションにおける実用的課題への対処

Addressing Practical Issues in Atomic Force Microscopy-Based Micro-Indentation on Human Articular Cartilage Explants

原子間力顕微鏡(AFM)は、現在、生物学的分野におけるマイクロやナノキューを評価するための最も強力で有用な技術の1つであることは間違いありません。しかし、他の微視的アプローチと同様に、方法論的な課題が生じる可能性があります。特に、サンプルの特性、サンプル調製、装置の種類、およびインデンテーションプローブは、望ましくないアーチファクトにつながる可能性があります。このプロトコルでは、健康な変形性関節軟骨外植片だけでなく、変形性関節症の関節軟骨外植片に関するこれらの新たな問題を例示します。この目的のために、まず、組織外植片全体の大規模な2Dモザイク蛍光イメージングにより、変性のさまざまな段階に応じてex vivo関節軟骨椎間板を生成、等級付け、および視覚的に分類する方法を段階的なアプローチで示します。ex vivoモデルの主な強みは、老化した天然のヒト軟骨で構成されており、変形性関節症の早期発症から進行までの変化を調査できることです。さらに、組織調製における一般的な落とし穴、および実際のAFM手順とその後のデータ解析についても説明します。サンプルの調製と処理、高度な縮性によって引き起こされるトポグラフィーサンプルの特性、サンプルとチップの相互作用など、基本的かつ重要なステップがデータ取得にどのように影響するかを示します。また、AFMの最も一般的な問題を精査し、可能であれば、それらを克服する方法を説明します。これらの限界に関する知識は、正しいデータの取得、解釈、そして最終的には幅広い科学的文脈への発見の埋め込みにとって最も重要です。

自作の切断装置を用いて、単一糸(SS、図2A)、二重糸(DS)、小クラスター(SC)、大クラスター(BC;図2A)、および拡散(図2B)です。代表的な軟骨外植片を図3Aに示します。1種類のパターンのみを表示するディスクの選択は、トップダウン蛍光イメージングを使用して行われました(図2)。軟骨表面円板のトポグラフィー的変化は、軟骨円板から生成された厚さ60μmの切片の側面画像によってさらに示されました(図2C)。摘出された変形性関節症軟骨椎間板の表面には、表在性細動とマトリックスの裂け目が見られました(図3B、C)。これは、BCの存在によって表さ...

原子間力顕微鏡のマイクロインデンテーションに関連する最も一般的な問題を特定し、対処するための段階的なアプローチを紹介します。私たちは、変形性関節症によるさまざまな程度の変性を特徴とする天然のヒト関節軟骨外植片の新たな問題を例示しています。

Without a doubt, atomic force microscopy (AFM) is currently one of the most powerful and useful techniques to assess micro and even nano-cues in the ...

このプロトコルの目的は、変形性関節症の発症と進行時の関節軟骨の機械的特性を研究するためのin vitroモデルを作成することでした。本技術の主な利点は、軟骨外植片が生成しやすく、天然の年齢軟骨を高度に代表していることである。このモデルは、さまざまな変形性関節症、診断、および治療アプローチを生体力学的レベルで分析および監視するために使用できます。まず、メスを使って軟骨を骨から切り取ります。生検パンチを使用して、直径4ミリメートルの椎間板を生成します。ディスクを特注の切断装置に置きます。ヘラを使用して、軟骨椎間板を固定して安定させます。軟骨椎間板をカミソリの刃で切ります。へらを使ってディスクを集め、1.5ミリリットルのチューブに入れます。軟骨サンプルに留まるには、130マイクロリットルの細胞透過性蛍光色素を96ウェルプレートの各ウェルに添加し、プレート上のディスクをウェルごとに1枚のディスクとして分配します。96ウェルプレートを蛍光顕微鏡のプレートホルダーに置きます。適切な蛍光フィルターと対物レンズを選択します。個々の軟骨を含む事前に選択されたウェルの下に対物レンズを配置します。椎間板に焦点を合わせて、細胞のパターンを確認します。ナビゲーター機能を選択すると、坑井全体の概要を把握できます。マウスの左ボタンを使用してドラッグし、別のステージ位置に移動します。スキャンする対象領域を囲む正方形を選択します。ソフトウェアのフォーカスマップポイントオプションを選択し、タイルの中央を左クリックして個々のタイルを選択します。表示されたウィンドウで、以前に選択したすべてのタイルを含むオプションフォーカスマップを選択します。タイルをダブルクリックして表示し、適切なフォーカスに移動します。次に、「Zを設定」をクリックしてフォーカル・プランを保存し、次のタイルに進みます。個々のタイルのフォーカルプランを調整した後、スキャンの開始を押して画像取得を開始します。細胞パターンを含む事前に選択された各軟骨ディスクを、ディスクの上部、下部、左側、および右側に十分な生体適合性接着剤を追加して、ペトリ皿に固定します。L-グルタミンを含まない2.5ミリリットルのリーボビッツ培地でディスクを覆います。ペトリ皿をAFM装置サンプルホルダーにセットします。AFMカンチレバーを校正するには、ガラスブロックカンチレバーの表面に置き、ガラスブロックの中心にある研磨された光学面に載るようにします。カンチレバーが媒体に完全に沈むまで、ステッピングモーター機能を使用して100マイクロメートル刻みでカンチレバーを下げます。目的の軟骨測定部位を特定するには、ペトリ皿のきれいなサンプルのない領域にカンチレバーを使用してスキャナーアプローチを開始します。次に、カンチレバーをプレートの底から1.5ミリメートル引きます。明視野表示から蛍光表示に切り替えて、ディスクの上部を視覚的に識別します。AFMサンプルホルダーをディスクの中央に向かって正確に2mm動かします。スキャナーアプローチを実行して軟骨椎間板の表面に到達し、カンチレバーを100マイクロメートル引っ込めます。力の距離曲線を生成するには、目的の測定部位に配置されたセルに焦点を合わせます。実行ボタンをクリックして測定を開始し、各測定部位で5つの力距離曲線を取得します。検査後にカーブを保存します。ヤング率を推定するには、[分光曲線のバッチを開く]オプションを使用して、解析する生成された力の距離曲線を開きます。ヘルツ近似モデルを選択し、続いて弾性近似オプションを選択します。次に、ヤング率を視覚化して文書化します。ポアソン比 0.5 と適切なカンチレバー先端半径を使用して調整します。次に、力の距離曲線のフィットを視覚的にチェックして、正確性を確認します。圧痕の深さを決定するには、生成された各力距離曲線をデータ解析ソフトウェアで開き、解析プロセスとしてヘルツフィットモデルを選択します。基線オフセットの減算オプションを適用して垂直方向のたわみ軸をゼロにし、オフセットとチルト機能を選択します。接触点検索機能を使用して、接点を自動的に識別します。垂直先端位置関数を使用して、圧痕中の生のピエゾ高さからカンチレバーのたわみのみを考慮した距離を差し引きます。elasticity-fitオプションを選択して、処理された力の距離曲線を表示します。次に、垂直先端位置軸上で最も負の値と揃うようにグラフの領域を選択します。[XMIN] ボックスの [パラメーター] タブで、インデントを読み取って文書化します。1本の弦を含む椎間板は、中央値が2.6キロパスカルと高い剛性値を示し、これは妥協のない健康な軟骨領域を表しています。変形性関節症の発症と進行に伴い、AFM測定では、ダブルストリングで42%、小さなクラスターで77%、そして最終的には大きなクラスターで表される進行段階で88%の剛性が段階的に大幅に低下することが示されました。拡散パターンを含むディスクは、ヤング率の単一値の重要な変動を伴う高い弾性で表示されました。主要な細胞パターン構成が割り当てられたすべての軟骨椎間板について、採用された設定値に関連するくぼみの深さは、硬さに反比例することがわかりました。生成された力の距離曲線に見られるアーチファクトは、AFMカンチレバーと軟骨表面の接触が最適でないか、サンプルがペトリ皿に不適切に固定されていることを示しています。当社の軟骨外植片は、elizaによるタンパク質分析、免疫標識、ウェスタンモディング、PCRによる遺伝子分析など、さまざまな分子生物学的手法を用いてさらに処理および分析することができます。この方法は、関節軟骨に対する新しい治療法の直接的な影響を研究するために使用され、研究者が変形性関節症のポトーマメカニズムに関する重要な洞察を得るのに役立つ可能性があります。

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