原子間力顕微鏡を用いた肺組織のマイクロメカニカル特性

次の実験の全体的な目標は、原子間力顕微鏡のマイクロインデンテーションを使用して、新鮮なミラーリング肺組織の局所弾性特性を直接測定することにより、常在細胞に関連する空間スケールで肺実質の局所的な機械的環境を特徴付けることです。これは、アガロ膨らませたマウスの肺組織をカミソリまたはメスの刃で切断し、長さと幅が5 x 5ミリメートル、厚さが400マイクロメートルの肺実質ストリップを調製することによって達成されます。次に、固定されていないun perme肺組織ストリップは免疫染色であり、FMマイクロインデンテーションの関心領域を特定します。

次に、室温でPBSの組織ストリップにFMマイクロインデンテーションを行います。新鮮な肺組織の局所弾性特性を直接測定するために、結果が得られます。これは、正常肺実質と線維性肺実質における組織硬直の範囲と分布に顕著な違いがあり、特に線維性肺サンプル内での硬直の大きな空間的変動を示しています。

FMマイクロインデンテーションを使用して得られた強制変位曲線から抽出された剛性マップに基づいています。ティッシュストリップストレッチのような既存の測定方法に対するこの手法の主な利点は、組織硬化のマイクロスケールの変動について独自の視点を提供する前例のない空間分解能を提供することです。この測定は、組織内で剛性が空間的にどのように変化するか、疾患における剛性の変化の範囲と空間スケールは何かなどの重要な質問に答えるのに役立ちます。

組織リモデリングにつながるプロセス 肺組織のストリップを準備するには、孤立したマウスの肺を膨らませて切断するための肺構造を安定させることから始まります。気管内では、PBSで調製された温かい2%低ゲルポイントアロを体重1キログラムあたり50ミリリットルで気管を結び、4°CのPBS浴で膨らんだ肺を60分間冷却します。アロスは、空気空間でゲル化して硬化し、肺の構造を穏やかに安定させます この間、カミソリまたはメスを使用して、アロス安定化マウスの肺組織を長さと幅が約5 x 5ミリメートル、厚さが400マイクロメートルのストリップに切断します。

次に、ストリップをPBSで摂氏37度で5分間洗浄し、残留アロを取り除き、大きな気道や血管を排除します。大きな血管の気道を画像化する場合は、主幹気管支から離れた胸膜下領域からストリップを切断します 肺組織からストリップを切断し、主幹気管支の近位にある FM マイクロ インデンテーションの関心領域を分離します。フェイスコントラスト顕微鏡または免疫染色で組織を可視化し、蛍光顕微鏡で可視化します。

手順については、このプロトコールの書面による部分を参照してください。FM特性評価の直前に、フローティング組織の下からカバースリップを持ち上げて、ティッシュストリップをポリLリジンコーティングされた15mmカバースリップに取り付け、ティッシュストリップがカバースリップ表面に均一に広がることを確認します。必要に応じて、ストリップを2番目のきれいなコーティングされていないカバースリップで挟み、ポリLリジンコーティングされたカバースリップへの組織の付着を助けるために穏やかな圧力を加えます。.

マイクロインデンテーション実験の各ラウンドの直前に、製造元の指示に従ってAFMシステムを校正します。このためには、2つの重要なパラメータを決定します。空気中の熱変動法を使用したカンチレバースプリング定数と、フォトダイオードの出力信号を実際のカンチレバーのたわみ距離にスケーリングするために使用されるパラメータであるカンチレバーたわみ感度。

きれいなスライドガラス上でPBSの標準的な強制変位曲線を取得することにより、たわみ感度を校正します。次に、強制変位曲線の測定で強制変位曲線の傾きを計算します。A FMチップは、カンチレバーデルタDのたわみをチップ変位デルタの関数として監視し、サンプル表面に向かって一箇所で伸縮させます Z.It、直径5マイクロメートルのケイ酸ケイ酸球状チップを持つ窒化ケイ素三角形カンチレバーを使用することをお勧めします。

当社は、 100 〜 50 、 000 パスカルに及ぶ純正の軟質材料を機械的に特徴付けています。サンプルカバースリップの底面をティッシュペーパーで拭き、真空グリースで標準的なスライドガラスに固定します。スライドガラスをA FMサンプルステージに取り付け、500マイクロリットルの室温PBSで組織を覆います。

次に、FMスキャンヘッドを上に置きますampファイル。顕微鏡を調整しますamp接眼レンズ用の顕微鏡を設定します view視野の中央にAFMチップを合わせます。A FMサンプルステージを動かして、組織上の関心のある領域を選択します。

その後、CCDカメラ表示に切り替えて、必要に応じて組織の位相差画像や蛍光画像を記録します。A FMチップをゆっくりと下方に動かし、サンプルに正確に接触します。ソフトサンプルのFMマイクロインデンテーション特性評価では、大きな局所ひずみを避けるために小さなインデンテーション深さが必要であり、大きなひずみを避けるために弾性率計算に使用されるヘルツモデルを無効にし、カンチレバーの最大たわみを500ナノメートルに設定してトリガーモードでインデントを実行します。

このたわみ限界により、最大押し込み力が30ナノニュートン未満に抑制されます。押し込み速度は、ソフトサンプルの粘弾性特性ではなく弾性特性を探索するために十分に遅く選択する必要があります。肺組織の速度範囲を毎秒2〜20マイクロメートルで選択し、対象領域から1回測定します。

A FMプローブを目的の位置に移動し、1つのくぼみを実行して標準の力変位曲線を収集します。プローブはZ方向にのみ移動します。関心領域の自動マッピングを行うには、フォースマップモードに切り替えて、選択した領域内のスキャンサイズとサンプリングポイントを選択します。

A FMチップは、インデンテーション動作間のサンプル表面を横切ってRAし、定義されたサンプルグリッド内の各ポイントで個々の強制変位曲線を収集します。16 x 16のサンプルグリッドを使用して、毎秒20マイクロメートルのインデンテーション速度で80マイクロメートル×80マイクロメートルの領域をマッピングすることが実用的であることがわかりました。ヤング率を計算するには、ここに示すように、FがKサブC×デルタDがカンチレバーを曲げる力であるように、リースクエアの非線形曲線フィッティングを使用して、力変位曲線をヘルツ球面インデントモデルにフィットさせます。

K sub Cはカンチレバースプリング定数です。Rは球の先端半径、デルタはデルタZからデルタを引いたもの、Dはくぼみ、newはサンプルのポアソン比で、肺組織の0.4に等しくなります。近似の品質を評価するには、SSR値、または非線形曲線近似中のデータと近似値との差の平方和を計算します。

SSR値が大きい不良曲線のデータを破棄することで、信頼性の低い測定値や解釈不能な測定値を排除します。必要に応じて、弾性率または E を純弾性率に変換します。G.関係Eは、1と新しい時間の合計の2倍に等しい G.To フォースマップモードで収集された剛性の空間パターンを視覚化し、弾性率データと等高線マップをプロットします。たとえば、80マイクロメートル×80マイクロメートルの領域をカバーする16×16のグリッドで

大量の力曲線データを処理するために、カスタムアルゴリズムを記述して、力変位曲線を自動的に適合させ、モジュラーおよび/またはプロット輪郭マップまたはELAグラフトを抽出することができます。この図は、今説明したのと同じ手順とパラメータを使用して、Imが組織を適切に切断し染色することを示しています。肺実質の肺胞マイクロは、基底膜成分であるラミニンを固定または透過せずに免疫蛍光染色することにより観察されるように、良好に保存されています。

これらのパネルは、以前にPBSで処理したマウス、または線維化を誘発するためにブリオマイシンで処理したマウスから採取した新鮮な未固定肺のコラーゲンの免疫蛍光染色を示しています。FMマイクロインデンテーションから得られたサンプルの力変位プロットを、同じ加えられた力でここに示します。A FMチップは、軟部に大きなくぼみを生成し、その結果、青色で示される比較的平坦な力変位曲線に対して、赤色で示される硬い領域では小さなくぼみと急な力変位曲線が得られます。

各くぼみの後にきれいな力曲線を得るためには、A FMチップをサンプル表面から完全に引っ込め、次のくぼみの前に接触しないようにする必要があります。この接触のない状態は、先端がカンチレバーのたわみなく並進する曲線の平坦な領域に対応します。この図は、柔らかいサンプルがチップに付着するときなど、チップがサンプル表面から完全に引っ込められていない場合に発生する、フラットな領域のない典型的な偽のカーブを示しています。

曲線は、明確なたわみがなく、ノイズが小さいため、このように見える場合があります。この図は剛性を示しています。ELAグラフトと呼ばれる剛性マップとして空間的に表示された強制変位曲線から抽出されたデータは、剛性ELAグラフトのカラースケールが、正常および線維性肺実質における組織剛性の範囲と分布の顕著な違い、特に線維性肺サンプル内の剛性の大きな空間的変動を示しています。

このビデオを見た後、原子間力顕微鏡コピーを使用して新鮮な肺組織の局所弾性特性を直接測定することにより、肺実質の局所的な機械的環境を特徴付ける方法を十分に理解できるはずです。