疾患における機能不全タンパク質間相互作用のマッピング

私たちの研究は、機能不全のタンパク質間相互作用をネイティブの細胞や組織から直接マッピングし、病気がどのように細胞ネットワークを再配線するかを明らかにしています。ほとんどの原子間法とは異なり、dfPPIは遺伝子工学や患者コホートへのスキルを必要としず、サンプルごとに1回の多重化キャプチャを使用します。まず、20ミリモラートリス、20ミリモラー塩化カリウム、5ミリモラー塩化マグネシウム、0.01%Nb-40を含むタンパク質抽出バッファーを準備します。

使用直前にプロテアーゼとリン酸化物阻害剤を加え、バッファーは氷の上で保管してください。凍結組織サンプルを乳棒付きの微小組織ホモジナイザーチューブに入れます。ネイティブ溶解バッファーを500〜700マイクロリットル追加し、組織のコンパクトさや均質化の容易さに応じて体積を調整します。

次に、試料を氷上で均質化し、乳棒を優しく上下に動かし、研磨壁に当てて均一な懸濁液を得るまで調整します。溶解液を4度Cで30分間培養し、バイアルを回転ユニットに置きます。培養中に回転しながらサンプルを優しく混ぜます。

ベンチトップ遠心分離機を使い、13,000Gで4度の温度で10分間遠心分離して細胞の残骸を除去します。上清液を慎重に採取し、透明な1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離機チューブに移します。製造元の指示に従い、BCAアッセイキットを使用して上清液中の総タンパク質濃度を測定してください。

次に、イソプロパノールストックから直接取るポリウレタンビーズのアリコートを取ります。ビーズが沈殿するまで待ち、貯蔵溶剤を除去します。イソプロパノールを慎重に吸引し、その後ネイティブリシスバッファーを加え、優しくピペッティングまたは逆回転でビーズを完全に再懸浮させます。

ビーズを洗浄し平衡させるために、チューブを渦巻かせてから遠心分離機で処理します。その後、ピペットチップ付きの真空ラインで上清液を吸引し、ペレットを乱さないように注意してください。洗浄したビーズに均等な比率で結合バッファーを加え、均一な作業ビーズスラリーを作ります。

40マイクロリットルのポリウレタンビーズスラリーを1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離機管に分割し、切断したピペットチップを使って滑らかなディスペンスを行います。その後、各チューブに1ミリリットルの緩衝液を加え、天然溶解バッファーでビーズを3回洗います。チューブをボルテックスしてビーズを再吊り下げ、10,000Gで1分間遠心分離し、吸引して上清液を捨てます。

最終洗浄後は、チューブから残った液体の大部分を取り除き、ビーズペレットが乱されないようにします。正規化されたタンパク質抽出物を、40マイクロリットルのコントロールビーズスラリーを含む1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離管に個別に追加します。適切な量のネイティブ溶解バッファーを加えて最終体積を250マイクロリットルに調整します。

サンプルは4度Cで30分間培養し、端から端まで回転する回転機で毎分10〜15回転で動作させます。チューブを10,000Gで4度Cで1分間遠心分離し、制御ビーズと凝集または不溶性タンパク質をペレットで落とします。コントロールビーズから1ミリリットルのピペットで上清液を慎重に採取し、洗浄済みポリウレタンビーズスラリー40マイクロリットルを含む新鮮な1.5ミリリットルチューブに移します。

サンプルは4度Cで3時間培養し、端と端を回す回転装置で行います。チューブを慎重に遠心分離した後、上清液を吸引し、先ほど示した通りビーズを4回洗浄します。チューブから残留するPBSを除去してください。

洗浄したビーズを、ピペッティングまたは短時間渦巻かせて、50ミリモラ重炭酸アンモニウムに新たに調製した2モル尿素80マイクロリットルに再懸濁します。次にジチオスレイトールを加え、最終濃度1ミリモルにします。チューブのキャップを閉めた後、加熱された軌道シェーカーで毎分1,100回転の振動を起こしながら30分間キュベートします。

ヨードアセタミドを加えて最終濃度3.67ミリモルにします。チューブを室温の暗闇で45分間孵化し、毎分1,100回転で振る。次に、未反応のヨードアセタミドを消滅するためにジチオスレイトールを追加し、最終濃度を3.67ミリモラーにし、ピペッティングで優しく混ぜます。

試料に0.5ミリグラム/ミリリットルの質量分析グレードのLys-Cプロテアーゼを750ナノグラム加えます。混合液を37度摂氏で1時間孵化し、1分あたり1,150回転で振る。次に、新たに調製された0.5ミリグラム/ミリリットルのシーケンシンググレードトリップシンを750ナノグラム加えます。

混合液を37度摂氏で一晩孵化し、毎分1,150回転で振る。翌日、サンプルを室温で1,000〜5,000Gで1〜5分間遠心分離します。ピペットを使って上清液を新しい1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離機チューブに慎重に移し、ビーズを廃棄します。

消化液のpHを3以下に調整するには、トリフルオロアセチン酸を50%ずつ滴ずつ加えます。インジケーターストリップを使ってpHを確認してください。PUビーズは、エピチャペロームの高解離物からHSP90、HSC70、熱いタンパク質を強く捕捉し、エピチャペローム低解離物からの信号は最小限に抑え、プローブの生物学的特異性を確認しました。

PUビーズのカーゴプロファイルはPUビーズレーンで高分子量の信号を示し、コントロールビーズレーンではほとんどバックグラウンドが見られず、プローブ活動の成功を裏付けました。クーマッシー染色されたSDS-PAGEゲルは、4つのゲル内処理サンプルで一貫したバンド分布を示し、質量分析前にネイティブ解体からタンパク質複合体の濃縮が成功したことを確認しました。技術的な再現性は主成分解析によって確認され、複製サンプルは密に集まり、異なるサンプルはきれいに分離されました。

前駆体イオン強度分布では、ほとんどの特徴が20%未満、中央値は9.7%から11.9%の間で、一貫したペプチド検出と回復が確認されました。ログ変換タンパク質の階層的クラスタリングにより、サンプル間の強力な分離と、低存在比から高濃縮タンパク質まで多様なタンパク質強度が維持されることが示されました。経路強化解析は、Reactome、KEGG、WikiPathwaysなどの遺伝子オントロジーカテゴリやキュレーションされたデータベースを含む複数のオントロジーにわたる幅広い注釈カバレッジを示しました。

dfPPIは、他のアプローチでは到達できない機構的・治療的知見を明らかにしてくれました。dfPPIはインターオミクスを実際の疾患コホートや先来の状態のレベルに引き上げ、正確な機構的および治療的仮説を可能にします。現在、アルツハイマー病やパーキンソン病などの神経変性疾患におけるネットワークレベルの変化をマッピングするためにdfPPIを拡大しています。