脳卒中前臨床評価ネットワーク:血栓塞栓性脳卒中および血栓溶解症の多検査室モデル:TE-MCAo

私たちの研究の範囲は、厳密な多検査室による前臨床治療試験に用いられる、制御された血栓塞栓性脳卒中モデルの開発です。当プロトコルは、臨床的血栓溶解を模倣し、多施設前臨床試験を支援する単純で再現可能な血栓塞栓性脳卒中モデルの欠如に対応しています。まず、PE-50チューブの端を斜めにカットして鈍く仕上げます。

マイクロハサミでベベルポイントの先端を切り落とします。麻酔ラットを手術準備した後、内腿に股径部の自然な折り目に沿って約1.5〜2センチの垂直切開を行います。切開は大腿動脈の予想される解剖学的経路に直交するべきです。

鈍的解離を使い、慎重に大腿血管まで解剖します。次に、同じ束を走る大腿動脈と静脈・神経を分離します。大腿動脈をできるだけ近位に骨格化し、動脈の後腹膜起源をたどります。

大腿動脈の周りに5-0シルクのループをゆるく巻きつけ、尾部で動脈近位端に優しく緊張をかけます。その後、5-0シルク結紮で大腿動脈を遠位に塞ぎ、縫合糸の尾部で止血クランプで遠位にわずかな緊張をかけます。近位縫合ループから約3分の2の距離に、動脈の下にシルク縫合糸を置き、緩い縫合線の遠位にマイクロハサミを使って小さな動脈切開を行います。

鋭い鉗子を使って動脈切開の上部の開口部を持ち上げ、鈍い面取りのPE-50カテーテルを開口部に挿入します。カテーテルをできるだけ近位部に進め、緩んだループが締めたときにカテーテル全体を包み込むようにします。縫合糸を優しく締め、カテーテルを塞いだり面取りに乗ったりしないように注意してください。

ゴム製のクランプを外してください。カテーテルはすぐに血液で満たされるはずです。1.5ミリリットルの遠心分離機チューブを3本満たし、4度の温度で保管します。

チューブが満たされたら、大腿動脈からPE-50カテーテルを抜き、近位端を結紮し、切開部を中断した5-0プロリーン縫合糸で閉じます。血栓を準備するには、新たに採取または保存されたドナー血液500マイクロリットルを1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離機チューブに移し、抗凝固逆転のために塩化カルシウム1ミリリットルを加えます。その後、マイクロ遠心分離機チューブから血液を100センチメートルのPE-50チューブに優しく吸引して吸引し、37度の予温PBSでコイルチューブをテーブルトップオーブンで2時間培養します。

血栓をPBSを含むペトリ皿に排出した後、カミソリの刃で約6センチメートルの断片に切り分けました。各血栓を優しくPE-50カテーテルに取り込み、完全に5回排出して洗浄します。血栓をPE-10カテーテルに優しく入れて15回完全に排出して再度洗浄します。

4%エバンスブルーを200マイクロリットル、PBS10ミリリットル入りのペトリ皿に加え、希釈番号1を作ります。次に、希釈1号を400マイクロリットルのピペットで、PBS20ミリリットルを含む別のペトリ皿に移液し、希釈剤2を作ります。より濃縮したエバンスブルーペトリ皿溶液に1秒間血の塊を入れ、その後薄めたエバンスブルーペトリ皿に移します。

洗浄された血栓1個を、空気塞栓なしで、湿から湿への方法でプレハブのマイクロカテーテルに挿入します。血栓が完全に積み込まれたら、マイクロカテーテル内に正確に5センチメートル残るまで十分な量の血栓を押し出します。余分な部分をカミソリの刃で切り落とします。

マイクロカテーテルの先端から16ミリメートルの位置に印をつけ、カテーテルの範囲を内光内で進めるべき範囲を示してください。予備充填された血栓塞栓は、6つの研究室にまたがる135名の被験者の頸動脈内動脈に注射され、血栓塞栓性中大脳動脈閉塞モデルの実現可能性を検証しました。3日後に102頭の動物で磁気共鳴画像法が行われ、スキャン完了率は75%でした。

画像診断前の動物の喪失は6つの検査室すべてで一貫していました。全部位の平均病変容積は同側半球の13%であり、6つの検査室で若干ばらつきがあった。当プロトコルはヒト血栓と血栓溶解を模倣し、動物の使用を減らし、手術を標準化し、信頼性の高い多施設での再現性を実現しています。

研究の重要な成果として、複数のラボで一貫したアウトカムと構造化された品質管理が可能なスケーラブルな再現性のTE-MCAoモデルを作成しました。このモデルは単一および複数検査室の脳卒中研究で一貫して使用でき、治療スクリーニングの向上と候補的な脳保護治療の翻訳促進に寄与します。