Name: chromium release assay for immune cell killing
Uploaded: 2023-04-30T07:09:15.000Z
Duration: 11 min 48 s
Channel: JoVE

절차 개요
세포 사멸 측정을 위한 일반적인 51Cr방출 분석법은 다음 단계를 포함합니다:
<ol><li>먼저, 표적 셀은 Na2[51Cr]O4로표지된다. 이것은 분석기의 이펙터 세포와 구별됩니다.</li>
	<li>표적 세포가 라벨링하는 동안, 이펙터 셀이 수집되고, 직렬 희석 기술을 이용하여, 이펙터 세포의 감소적 적정은 라운드 하단 96-tassay 플레이트에서 생성된다.</li>
	<li>표적 세포 라벨링의 끝에서, 세포는 먼저 세척되고 그 후 고정된 수의 세포가 이미 일련의 이펙터 세포 희석제를 포함하는 분석 판에 첨가된다.</li>
	<li>다음으로, 표적 이펙터 세포 혼합은 표적 세포와 충분한 세포 상호 작용을 허용하고 세포 용액을 중재하기 위해 정의된 기간 동안 배양된다.</li>
	<li>마지막으로, 문화 슈퍼 나일체는 수확하고 튜브로 수집됩니다. 51Cr 양은 감마 카운터를 사용하여 양화됩니다.</li>
	<li>결국, 데이터는 수집되어 대상 셀의 "백분율 특정 셀 용해"를 계산하는 데 사용됩니다.</li>
</ol>1. 51Cr로 대상 셀 라벨링
<ol><li>시작하려면, 표적 세포(여기-인간 흑색종 세포주 WM793)를 단일 세포 현탁액으로 준비한다.</li>
	<li>이렇게하려면 먼저 조직 배양플라스크에서 미디어를 제거하십시오.</li>
	<li>그런 다음, 1X PBS의 5mL로 세포를 씻는다.</li>
	<li>-2 분 동안 접시에 트립신 1 mL을 추가하여 세포를 트립시인화합니다.</li>
	<li>플라스크를 부드럽게 눌러 플라스크 표면에서 세포를 느슨하게 합니다.</li>
	<li>플라스크에 RPMI 미디어 5mL을 추가하고 미디어를 위아래로 파이프하여 세포를 분리합니다.</li>
	<li>세포 현탁액을 15mL 원칼 튜브로 수집하고 1200 rpm에서 5 분 동안 세포 현탁액을 원심분리합니다. 상체를 장식합니다.</li>
	<li>펠릿에 10mL의 미디어를 추가하고 미디어를 위아래로 부드럽게 파이프하여 세포를 현탁액으로 가져옵니다.</li>
	<li>혈종계를 사용하여 세포 농도를 결정합니다.</li>
	<li>새로운 15 mL 원문 튜브로 1x106 세포를 전송합니다.</li>
	<li>1200 rpm에서 5 분 동안 세포 현탁액을 원심 분리하고 상체를 데칭합니다.</li>
	<li>튜브를 잠시 소용돌이쳐 소량의 중간 체적으로 세포 펠릿을 다시 일시 적으로 돌보냅니다.</li>
	<li>WM793 대상 셀 서스펜션에 51Cr의 100 μCi를 직접 추가합니다. 참고: 특정 방사능에 대한 전용 실험실 공간이 설정되어야 합니다. 또한 모든 단계에서 51Cr을 안전하게 보관하고 사용하기위한 충분한 납 차폐뿐만 아니라 51Cr이있는 샘플이 보관되는 위치를 나타내는 적절한 사이니지가 있어야합니다. 팬케이크 프로브가 장착된 가이거 카운터도 필요한데, 오염 가능성을 조사하기 위해.
</li>
	<li>튜브가 이제 방사능임을 나타내기 위해 작은 방사성 테이프를 튜브에 추가합니다.</li>
	<li>튜브를 납 쉴드가 있는 37°C 인큐베이터에 놓고 1시간 동안 배양합니다. 크롬의 표적 세포 섭취량을 증가시키기 위해 15-20 분마다 튜브를 쓸어 넘깁니다.</li>
	<li>인큐베이션 기간 후, FBS의 5mL로 대상 세포를 세척하여 초과 51Cr을 제거하십시오.</li>
	<li>5 분 동안 1200 rpm에서 세포를 원심 분리합니다. 방사능 FBS는 적절한 폐기물 용기로 세척합니다.</li>
	<li>펠릿을 다시 중단하고 FBS로 두 번째로 세척하십시오. 가이거 카운터를 사용하여 통합 방사능펠릿을 확인하십시오.</li>
	<li>10mL 완전 배지에서 펠릿을 다시 중단하여105 셀/mL의 세포 농도를 달성한다. 참고: 51Cr 라벨링 후 셀 카운팅 단계는 안전상의 이유로 주로 여기에서 생략됩니다. WM793 세포 농도가 51Cr 라벨링 이전과 동일하다고 가정할 수 있다.
</li>
</ol>2. 이펙터 셀 준비
<ol><li>인간 또는 마우스 T 세포 및 NK 세포와 같은 다양한 이펙터 셀을 사용할 수 있다. 이 예에서, 표준 밀도 그라데이션 원심분리(5x106의농도)에 의해 전혈에서 분리된 PBMC가 사용되었다.</li>
	<li>시작하려면 96웰의 둥근 바닥 플레이트의 행 하나(여기 행 A, 표 1 참조)의모든 웰에 100 μL의 조직 배양 배지를 추가합니다. 여기서, 이펙터 세포가 첨가되지 않으며, 대상 세포로부터 "최소/자발적 51Cr 방출"을 결정하기 위한 '공백'으로 작용할 것이다.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10505/10505table1.jpg"> 표 1: 51Cr 방출 분석 레이아웃: 행 A-대상 셀(104셀/100 μL)은 미디어만으로 배양됩니다("최소/자발적 51Cr 릴리스"를 결정하기 위한 '공백'을 생성합니다). 다른 이펙터를 포함하는 행 B - C- 우물 : 대상 셀 (E:T) 비율, 50:1에서 1.5:1에 이르기까지. 행 H-표적 셀(104셀/100 μL)은 1% NP-40(NP-40은 표적 세포를 lyses하여 "최대 또는 총 51Cr방출")을 생성한다. 모든 E:T 비율은 모든 실험 조건에 대해 삼중에서 테스트됩니다. 열 1-3- 자극되지 않은 PBMC 및 열 4-6- CpG 자극 PBMC.
<ol start="3"><li>다음으로, PBMC의 2X 직렬 셀 희석(각 실험 조건에 대한 삼중분리)을 생성하여 5x10내지 15,625세포/100 μL에 이르는 이펙터 세포 농도를 얻습니다(여기 행 B내지 G). 참고: 이 예에서 시작 효과자: 대상 셀(E: T) 비율은 50:1입니다. 그러나, 이 비율은 실험적인 세부사항에 따라 조정될 수 있다.
</li>
	<li>이러한 웰에 이펙터 셀을 추가하지 않음으로써 마지막 행(여기 행 H)을 비워 둡니다. 이 행은 "총 카운트/분, 또는 (c.p.m) 또는 "최대 51Cr 릴리스"를 생성하는 데 사용됩니다.</li>
	<li>대상 셀을 추가할 준비가 될 때까지 플레이트를 37°C 인큐베이터에 넣습니다.</li>
</ol>3. 분석지에 51Cr 라벨 WM793 대상 셀 추가
<ol><li>인큐베이션 기간 이후에는 인큐베이터에서 표적 세포를 제거하고 5mL의 FBS로 세척하여 초과 51Cr을 제거합니다.</li>
	<li>지정된 원심분리기를 사용하여 5분 동안 1200 rpm에서 세포를 원심분리합니다.</li>
	<li>FBS 세척(방사성 상수)을 적절한 폐기물 용기에 제거합니다.</li>
	<li>FBS의 신선한 5mL에서 펠릿을 다시 중단하여 세척 단계를 반복합니다.</li>
	<li>원심 분리는 5 분 동안 1200 rpm에서 세포를 다시 분리합니다.</li>
	<li>마지막으로, 완전한 매체의 10 mL에서 펠릿을 다시 중단합니다.</li>
	<li>51Cr 라벨WM793 셀 서스펜션(105 셀/mL)을 일회용 시약 저장소에 붓습니다.</li>
	<li>그런 다음, 다중 채널 파이펫을 사용하여, 96 웰 이펙터 세포 판의 각 웰에, 이러한 표지 대상 셀의 100 μL을 추가합니다.</li>
	<li>다음으로, 1% NP-40(물)의 100 μL을 이펙터 세포가 없는 우물행에 추가합니다(여기 행 H). 1% NP-40은 표적 셀을 lyse 것이며, 따라서 이러한 우물은 "총 카운트/분, 또는 (c. p.m) 또는 최대 51Cr 방출을 결정하는 컨트롤 역할을 합니다.</li>
	<li>플레이트의 양쪽에 작은 가스 투과 성 테이프를 추가하여 플레이트에 뚜껑을 고정하고 51Cr이 포함되어 있음을 나타내기 위해 뚜껑에 방사성 테이프 조각을 배치합니다.</li>
	<li>간단히, 원심 분리판에서 1200 rpm. 하나의 실험 플레이트만 사용 중인 경우 원심분리기에 밸런스 플레이트를 추가합니다. 참고: 방사성 샘플을 처리하기 위해 표시된 원심분리기를 사용하는 것이 중요합니다.
</li>
	<li>원심분리기에서 접시를 제거합니다.</li>
	<li>플레이트를 37°C 인큐베이터에 작은 납 차폐물로 배치하여 추가 안전을 위해 플레이트 위에 차폐합니다. 대상 세포 용해를 허용하기 위해 16 h에 대한 인큐베이션. 참고: 잠복기는 사용된 이펙터 세포 및 사용된 살인의 잠재적인 기계장치에 따라 4에서 18h까지 다양할 수 있습니다.
</li>
</ol>4. 수퍼네티츠 수확
<ol><li>인큐베이션 기간이 끝나면 플레이트 가장자리 주변의 테이프를 조심스럽게 제거하고 뚜껑을 제거합니다.</li>
	<li>다음으로, 각 면 플러그에 대해 작은 필터 디스크가 제자리에 있는지 확인하여 접시에 수확 프레임을 배치합니다. 이렇게 하면 셀 프리 상수의 수집이 보장됩니다.</li>
	<li>이제 면 플러그를 우물에 천천히 부드럽게 누릅니다.</li>
	<li>약 10초 후에 면 플러그의 압력을 해제한 다음 면 플러그를 튜브 스트립으로 옮습니다.</li>
	<li>이러한 각 튜브를 보조 FACS 튜브에 넣습니다.</li>
	<li>마지막으로, FACS 튜브를 감마 카운터에 로드하고 샘플을 실행하여 각 조건에서 방출되는 51Cr의 양을 양량화합니다. 샘플은 일반적으로 1분 동안 측정되므로 "카운트/분"을 쉽게 측정할 수 있습니다.</li>
	<li>조심스럽게 튜브가 카운터에 로드된 순서를 기록합니다.</li>
</ol>5. 데이터 분석
<ol><li>여기서, 자극받지 않은 PBMC는 처음 3개의 열에 추가되었고, CpG 자극 된 PBMC (CpG ODN, (1 μg/mL)를 24 시간 동안 열4-6에 첨가하였다. 표 2를 참조하십시오.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>1</td>
			<td>2</td>
			<td>3</td>
			<td>4</td>
			<td>5</td>
			<td>6</td>
			<td>7</td>
			<td>8</td>
		</tr>
<tr>
<td>A</td>
			<td>1251</td>
			<td>1157</td>
			<td>1086</td>
			<td>917</td>
			<td>1118</td>
			<td>1140</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>B</td>
			<td>1832</td>
			<td>1986</td>
			<td>1971</td>
			<td>7629</td>
			<td>7913</td>
			<td>8180</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>C</td>
			<td>1677</td>
			<td>1739</td>
			<td>1428</td>
			<td>5454</td>
			<td>5055</td>
			<td>5268</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>D</td>
			<td>1638</td>
			<td>1552</td>
			<td>1734</td>
			<td>4239</td>
			<td>3582</td>
			<td>3786</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>E</td>
			<td>1658</td>
			<td>1580</td>
			<td>1339</td>
			<td>2818</td>
			<td>2623</td>
			<td>2750</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>F</td>
			<td>1579</td>
			<td>1472</td>
			<td>1483</td>
			<td>2028</td>
			<td>1779</td>
			<td>1769</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>G</td>
			<td>1326</td>
			<td>1325</td>
			<td>1184</td>
			<td>1801</td>
			<td>1654</td>
			<td>1565</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>H</td>
			<td>9220</td>
			<td>9367</td>
			<td>8067</td>
			<td>8774</td>
			<td>9647</td>
			<td>8236</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>나는</td>
			<td colspan="2">A1, A2, A3 -&gt; 평균</td>
			<td>1164.67</td>
			<td>자발적인 c.p.m</td>
			<td></td>
			<td>1058.33</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>J</td>
			<td colspan="2">평균 B1, B2, B3 -&gt;</td>
			<td>1929.67</td>
			<td>9.91%</td>
			<td></td>
			<td>7907.33</td>
			<td>87.50%</td>
			<td>50:1</td>
		</tr>
<tr>
<td>K</td>
			<td colspan="2">C1, C2, C3 -&gt; 평균</td>
			<td>1614.67</td>
			<td>5.83%</td>
			<td></td>
			<td>5259</td>
			<td>53.67%</td>
			<td>25:1</td>
		</tr>
<tr>
<td>L</td>
			<td colspan="2">평균 D1,D2,D3 -&gt;</td>
			<td>1641.33</td>
			<td>6.17%</td>
			<td></td>
			<td>3869</td>
			<td>35.91%</td>
			<td>12.5:1</td>
		</tr>
<tr>
<td>M</td>
			<td colspan="2">평균 E1, E2, E3 -&gt;</td>
			<td>1525.67</td>
			<td>4.68%</td>
			<td></td>
			<td>2730.33</td>
			<td>21.36%</td>
			<td>6.25:1</td>
		</tr>
<tr>
<td>N</td>
			<td colspan="2">평균 F1, F2, F3 -&gt;</td>
			<td>1511.33</td>
			<td>4.49%</td>
			<td></td>
			<td>1858.67</td>
			<td>10.22%</td>
			<td>3.12:1</td>
		</tr>
<tr>
<td>O</td>
			<td colspan="2">G1, G2, G3 -&gt; 평균</td>
			<td>1278.33</td>
			<td>1.47%</td>
			<td></td>
			<td>1673.33</td>
			<td>7.86%</td>
			<td>1.56:1</td>
		</tr>
<tr>
<td>P</td>
			<td colspan="2">평균 H1, H2, H3 -&gt;</td>
			<td>8884.67</td>
			<td>최대 c.p.m</td>
			<td></td>
			<td>8885.67</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>팀없는 PBMC</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>CpG-stim PBMC</td>
			<td>E:T 비율</td>
		</tr>
</tbody></table>표 2: 51Cr 릴리스 분석 데이터: '분당 카운트' / 'c. p.m' 데이터 값, 평균 c. p. p.m 값, 계산퍼센트 별 리시스 값.
<ol start="2"><li>수집된 데이터(분당 카운트, 즉 .c.p.m)는 샘플이 원래 플레이트에 배치된 것과 동일한 방식으로 스프레드시트의 셀에 입력하였다.</li>
	<li>첫째, 삼중기의 평균이 계산되었습니다. 표 2 - C3에서 P3까지, 자극되지 않은 PBMC 및 세포 I6 ~P6, CpG 자극 된 PBMC용.</li>
	<li>평균이 결정되면 각 조건에 대한 특정 용해의 백분율은 다음 수식을 사용하여 계산되었습니다. <img src="/files/ftp_upload/10505/10505eq1.jpg">
</li>
	<li>특정 용해의 백분율은 각 조건에 대해 계산되었다 (표 2 - 세포 J4 O4, 자극되지 않은 PBMC및 O7에 대한, 자극되지 않은 PBMC에 대한).</li>
</ol>

여기에 기재된 분석체는 상당한 유연성을 가지며, 다양한 이펙터 및 표적 세포가 묻는 질문에 따라 사용될 수 있다. 예를 들어, 이펙터 세포 특이성은 상이한 표적 세포 또는 이펙터 세포 살상 메커니즘을 사용하여 특정 단백질에서 결핍된 세포를 사용하거나 단백질 특이적 억제제를 사용하여 결정될 수 있다. 51Cr 방출 분석의 주요 문제는 대상 셀에 의한 높은 자발적 방출 속도에 대한 잠재력입니다. 단독으로 배양할 때(이펙터 셀 없이), 대상 셀에 의한 51Cr의 자발적인 방출은 대상 세포에 의해 방출되는 총("최대")의 30% 이상이어야 한다. 더 높은 자발적 방출 속도 건강에 해로운 대상 세포를 사용 하 여 때문일 수 있습니다., 가난한 건강 으로 인해 (예를 들어, 세포줄의 확장 된 문화) 또는 지나치게 긴 라벨 기간.

세포 사멸 분석: 세포 독성 능력의 크롬 방출 분석

Assay for Cell Death: Chromium Release Assay of Cytotoxic Ability

출처: 프랜시스 V. 자아스타드1,2,휘트니 스완슨2,3,토마스 에스 그리피스1,2,3,4 1 미생물학, 면역학 및 암 생물학 대학원 프로그램, 미네소타 대학교, 미니애폴리스, MN 55455 2 면역학 센터, 미네소타 대학, 미니애폴리스, MN 55455 3 미네소타 대학교 비뇨기과, 미니애폴리스, MN 55455 4 Masonic 암 센터, 미네소타 대학, 미니애폴리스, MN 55455
면역 계통의 세포의 주요 기능 의 한은 바이러스에 감염되었거나 종양 세포로 변환을 겪은 표적 세포를 제거하는 것입니다. 면역 세포의 세포 독성 용량을 측정하기위한 체외 분석을 수년 동안 실험실에서 주식으로 되어 왔습니다. 이러한 소약은 T 세포, NK 세포 또는 항원 특이적 또는 비특이적 방식으로 표적 세포를 죽이는 다른 면역 세포의 능력을 결정하는 데 사용되었습니다. 데스 리간드(예를 들어, 파스 리간드 또는 트레일), 사이토카인(예를 들어, IFNg 또는 TNF), 또는 이펙터 세포에 의해 발현된 세포독성 과립(즉, 페포린/그란자임 B)은 표적 세포 사멸을 유도할 수 있는 몇 가지 방법이다. 최근 몇 년 동안 종양 면역 요법 연구의 폭발로 환자 결과를 개선하기 위해 면역 세포의 세포 독성 활성을 증가시키는 에이전트를 찾는 데 관심이 증가하고 있습니다. 반대로, 몇몇 질병은 면역 세포 중독 활동의 과잉 활동으로 특징지어집니다, 이 반응을 강화하는 에이전트를 확인하는 노력의 결과로. 따라서, 사용자가 실험 설계에 임의의 상이한 이펙터 세포, 표적 세포 및/또는 반응 수정자를 쉽게 통합할 수 있는 분석체는 표적 세포의 세포 독성 용량 및/또는 반응성을 신속하게 평가하는 귀중한 수단으로 작용할 수 있다.
이러한 시험관 내 아세약은 다른 세포 집단의 혼합뿐만 아니라 이펙터 및 표적 세포 모두의 상대적으로 낮은 수를 사용하는 것을 포함한다. 따라서, 분석의 한 가지 필요성은 표적 세포를 쉽게 검출하고 수량화할 수 있는 방식으로 라벨을 부착하여 사용자가 이펙터 세포에 의해 매개되는 '백분율 특이용 용해'를 결정할 수 있도록 하는 것이다. 방사능 -특히, 크롬 51(51Cr)의 형태로 Na251CrO4- 표적 세포 내의 신속하고 비구체적으로 라벨 세포 단백질을 저렴한 방법입니다 (1). 짧은 라벨링 및 총 분석 시간은 분석의 결과에 영향을 미칠 수 있는 표적 세포의 수 및/또는 표현형에 있는 중요한 변경에 대한 잠재력을 감소시킵니다. 이펙터 세포의 세포 독성 활성의 결과로 표적 세포의 막 무결성의 상실시, 대상 세포 내의 51Cr 라벨 세포 단백질은 배양 상수로 방출되어 양수에 사용할 수 있게 된다. 시험관 내면역 세포의 기능을 검사하는 분석과 마찬가지로 실험의 성능을 개선하는 것을 고려하는 중요한 고려 사항이 많이 있습니다. 가장 중요한 특징 중 하나는 건강한 이펙터 (최대 세포 독성 활성)와 대상 (최대 반응성과 최소한의 자발적 사망 /51Cr 방출) 세포를 사용하는 것입니다. 이펙터 및 표적 세포 접촉이 요구된다(세포-세포 접촉을 장려하기 위해 라운드 하단 96-웰 플레이트의 일반적인 사용으로 이어지도록 유도) (2). 마지막으로, 데이터 분석은 양수 및 음극대상 세포 집단의 포함에 의존한다.
다음 프로토콜은 유로피움을 이용한 비방사성 버전이 최근에 개발되었지만, 이펙터 세포의 집단의 세포 독성 능력을 측정하기 위한 표준 51Cr 방출 분석기를 수행하기 위한 단계를 설명할 것입니다. 51 Cr은 강력한 γ 방사선 방출기입니다. 따라서 이 분석법의 사용에는 적절한 방사선 안전 교육, 전용 실험실 공간, 감마 카운터 및 방사성 시료 의 폐기가 필요합니다.
이 분석기의 일반적인 이벤트 순서는 다음과 같습니다: 1) 51Cr 라벨 대상을 준비; 2) 대상 세포가 라벨링하는 동안 이펙터 세포를 준비하고 접시에 추가; 3) 플레이트에 레이블이 붙은 대상을 추가합니다. 4) 인큐베이션 플레이트; 5) 수퍼나일체 수확; 및 6) 카운터에서 샘플을 실행한 후 데이터를 분석합니다. 샘플은 일반적으로 triplicate에서 제조된 다음 미묘한 파이펫팅 차이를 설명하기 위해 평균화됩니다.
적절한 PPE는이 분석에 중요합니다. 특히, 사용자는 실험실 코트와 장갑을 착용해야합니다. 안전 안경은 실험실 이나 기관에 따라 필요할 수 있습니다. 모든 단계에서 51Cr을 안전하게 보관하고 사용할 수 있는 충분한 리드 차폐가 있어야 합니다. 마지막으로, 51Cr을 사용하는 전용 실험실 공간과 장비가 있어야 하며, 51Cr을가진 시료가 보관되는 위치를 나타내는 모든 적절한 사이니지와 감마 프로브가 장착된 가이거 카운터를 포함하여 오염 가능한 오염을 위한 공간을 조사해야 합니다.
본 실험실 운동에서는 인간 흑색종 세포를 죽이는 인간 말초 혈액 단핵세포(PBMC), (CpG 자극 대 자극) 인간 흑색종 세포주 WM793를 모델및 크롬 방출 분석으로 결정할 것이다.

이 예에서, 이펙터 세포는 CpG(도 1, 흑원)로자극되어 표적 세포에 대한 이펙터 세포의 비율이 증가함에 따라 대상 세포를 보다 효과적으로 죽였다. 이러한 증가는 자극되지 않은 PBMC(백색원)에서관찰되지 않았으며, 이는 표적 세포 용해의 관찰된 증가에 CpG 자극이 필요하다는 것을 나타낸다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10505/10505fig1.jpg"> 도 1: 51Cr 분석산란 플롯: 인간 PBMC에 의한 종양활성, 자극되지 않은(백색원) 및 CpG(블랙서클)로자극후 다른 이펙터에서 테스트: 표적 세포 비율(E: T) 비율(50:1 ~1.5:1).

Source: Frances V. Sjaastad1,2, Whitney Swanson2,3, and Thomas S. Griffith1,2,3,4
1 Microbiology, Immunology, and Cancer Biology Graduate Program, ...

이 비디오에서는 크롬 방출 분석을 수행하고 효과기 세포의 세포 독성 가능성을 측정하는 방법을 관찰합니다. 면역 세포는 면역 반응의 필수적인 부분인 암이나 바이러스에 감염된 세포와 같이 잠재적으로 해로운 세포를 신체에서 식별하고 제거하는 역할을 합니다. T세포 및 NK 세포와 같은 여러 면역 세포는 표적 세포를 식별하고 해당 표적 세포의 단백질 분해, 용해 및 사멸을 유도하는 단백질을 분비하는 능력인 세포 독성 전위(cytotoxic potential)로 알려진 특성을 가지고 있습니다. 세포독성 전위를 정량화하는 것은 면역 세포 활성화 및 효능을 측정하는 데 중요하며, 크롬 방출 분석은 이러한 목적으로 일반적으로 사용됩니다. 이 방법을 통해 사용자는 다양한 조건에서 특정 유형의 면역 세포에 의해 유발된 cytoxicity를 비교할 수 있으며, 이는 암 면역 요법 및 면역 관련 질병을 연구하는 데 유용합니다. 우선, 암세포와 같은 표적 세포는 세포가 흡수하는 방사성 동위원소인 크롬 51로 배양됩니다. 다음으로, 이러한 무선 표지된 세포는 두 세포 유형 간의 상호 작용을 촉진하기 위해 둥근 바닥, 96웰 플레이트에서 효과기 세포라고도 하는 분리된 면역 세포와 공동 배양됩니다. 분석의 전반적인 설정에는 적절한 대조군과 함께 면역 세포의 농도가 다른 특정 수의 표적 세포를 배양하는 것이 포함됩니다. 공동 배양을 통해 effector 세포가 표적 세포에서 세포사멸 및 용해를 유도할 수 있으며, 그 결과 세포 내 크롬 51이 상층액으로 방출됩니다. 그런 다음 사전 최적화된 시점에 방출된 크롬을 포함하는 상등액이 모든 웰에서 수확됩니다. 방사성을 띤 크롬 51은 자발적으로 방사성 붕괴를 겪어 감마선을 방출합니다. 분석 플레이트에 있는 모든 웰의 상등액에서 나온 감마선 수치는 표적 세포의 용해에 대한 정량화 가능한 출력을 나타냅니다. 이는 감마 계수기를 사용하여 측정한 다음 면역 세포의 세포 독성 가능성을 결정하는 데 사용됩니다. 먼저, 표적 세포인 이 예시의 인간 흑색종 세포주 WM793을 단일 세포 현탁액으로 준비합니다. 이를 위해 먼저 조직 배양 플라스크에서 배지를 제거하고 5ml의 1X PBS로 세포를 세척합니다. PBS를 디캔팅한 다음 약 2분 동안 플레이트에 트립신 1ml를 추가합니다. 플라스크를 부드럽게 두드려 플라스크 표면에서 세포를 느슨하게 한 다음 플라스크에 5ml의 RPMI 매체를 추가합니다. 배지를 위아래로 피펫팅하여 세포를 수집하고 이 현탁액을 15ml 원추형 튜브에 추가합니다. 튜브를 1200RPM으로 5분 동안 원심분리기에 놓습니다. 다음으로, 세포 펠릿을 방해하지 않도록 튜브에서 매체를 제거합니다. 튜브 바닥을 부드럽게 튕겨 세포 펠릿을 파괴하고 튜브에 10ml의 배지를 추가합니다. 그런 다음 배지를 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 세포를 현탁액으로 만듭니다. 다음으로, 혈구계를 사용하여 세포 농도를 측정하고 원래 세포 현탁액 2ml를 새로운 15ml 원추형 튜브로 옮깁니다. 튜브를 원심분리기에 넣고 5분 동안 1200RPM으로 셀을 펠릿화합니다. 원심분리 후 튜브의 여분의 매체를 폐기물 용기에 붓습니다. 튜브를 잠시 와류로 돌려 세포 펠릿을 남겨진 소량의 배지에 재현탁시킵니다. 다음으로, 이 특정 방사능 전용 실험실 공간으로 이동하여 Chromium 51을 사용할 준비를 합니다. 모든 단계에서 Chromium 51의 안전한 보관 및 사용을 위한 충분한 납 차폐가 있어야 하며, Chromium 51이 함유된 샘플이 보관되는 위치를 나타내는 적절한 표지판이 있어야 합니다. 팬케이크 프로브가 장착된 가이거 계수기도 오염 가능성이 있는 공간에서 사용하기 위해 필요합니다. 방사능의 적절한 사용을 위해 설정되면 Chromium 51 100마이크로큐리를 표적 세포 현탁액에 직접 첨가합니다. 그런 다음 튜브에 작은 방사성 테이프 조각을 추가하여 샘플과 튜브가 이제 방사성임을 나타냅니다. 납 보호막이 있는 섭씨 37도의 인큐베이터에 튜브를 놓고 15-20분마다 튜브를 튕기면서 한 시간 동안 배양합니다. 타겟 세포가 라벨링되는 동안 effector 세포의 단일 세포 현탁액을 준비합니다. 이 예에서 인간 말초 혈액 단핵 세포(PDMC)는 표준 밀도 구배 원심분리를 통해 전혈에서 5 곱하기 10에서 6까지의 농도로 분리되었습니다. 이 effector cell suspension을 일회용 시약 저장소로 옮긴 다음 이 현탁액 200μl를 96well 둥근 바닥 플레이트에 있는 B열의 각 well에 추가합니다. 다음으로, 플레이트의 C열에서 G행까지의 각 웰에 100마이크로리터의 RPMI를 추가합니다. 이제 먼저 B행의 웰에서 100마이크로리터의 세포를 제거하고 이를 C행에 추가하여 다양한 효과기 세포 수를 갖도록 PBMC의 연속 희석을 시작합니다. 그런 다음, 100마이크로리터의 세포를 C행에서 D행으로 이동시켜 효과기 세포를 추가로 희석합니다. 연속 희석을 계속합니다. G 행에 도달하면 우물에서 100 마이크로 리터를 이동하여 해당 행의 각 우물에 100 마이크로 리터의 최종 부피를 남겨 둡니다. 다음으로, 100마이크로리터의 조직 배양 배지를 A열의 웰에 추가하여 이 열에 effector 세포를 추가해서는 안 되므로 표적 세포에서 Chromium 51의 자연 방출에 대한 제어 역할을 합니다. 그런 다음 타겟 세포를 추가할 준비가 될 때까지 플레이트를 섭씨 37도의 인큐베이터에 넣습니다. 배양 기간이 끝나면 인큐베이터에서 표적 세포를 제거하고 FBS 5ml로 세척하여 과도한 Chromium 51을 제거합니다. 그런 다음 튜브를 지정된 원심분리기에 넣고 1200rpm으로 5분 동안 회전합니다. 방사성 FBS 세척제를 적절한 폐기물 용기에 넣고 펠릿을 5ml의 새 FBS에 재현탁하여 세척 단계를 반복합니다. 튜브를 지정된 원심분리기에 넣고 1200rpm에서 5분 동안 셀을 다시 회전시킵니다. 두 번째 세척을 제거하고 가이거 계수기를 사용하여 펠릿에 방사능이 포함되어 있는지 확인합니다. 마지막으로, 펠릿을 10ml의 완전한 배지에 재현탁하고 Chromium 51 라벨이 붙은 표적 세포 현탁액을 일회용 시약 저장소에 붓습니다. 그런 다음 100마이크로리터의 라벨링된 표적 세포를 96웰 효과기 세포 플레이트의 모든 웰에 추가합니다. 다음으로, 물 중 100마이크로리터의 1% NP-40을 H 열의 우물에 추가하여 각 행의 모든 대상 세포를 용해합니다. 이 웰은 분당 총 개수 또는 cpm을 결정하기 위한 제어로 사용됩니다. 이제 접시가 준비되었으므로 접시의 양쪽에 작은 테이프 조각을 추가하여 뚜껑을 고정하고 뚜껑에 방사성 테이프를 붙여 크롬 51이 포함되어 있음을 나타냅니다. 그런 다음 방사성 샘플을 처리하도록 표시된 원심분리기에 플레이트를 놓습니다. 실험용 플레이트를 하나만 사용하는 경우 원심분리기에 밸런스 플레이트를 추가합니다. 원심분리기를 1200rpm으로 설정하고 플레이트의 속도를 높입니다. 속도에 도달하면 기계를 멈춥니다. 원심분리기에서 플레이트를 제거합니다. 그런 다음 추가 안전을 위해 플레이트 위에 작은 납 차폐 조각이 있는 섭씨 37도의 인큐베이터에 플레이트를 놓습니다. 표적 세포가 용해될 수 있도록 16시간 동안 배양합니다. 배양 기간이 끝나면 접시 가장자리 주위의 테이프를 조심스럽게 제거하고 뚜껑을 제거합니다. 다음으로, 수확 프레임을 접시에 놓고 각 면 플러그에 작은 필터 디스크가 제자리에 있는지 확인합니다. 이제 면 마개를 우물에 천천히 부드럽게 누르십시오. 약 10초 후 면 플러그의 압력을 풀고 면 플러그를 튜브 스트립으로 옮깁니다. 이러한 각 튜브를 보조 FACS 튜브에 넣습니다. 마지막으로, FACS 튜브를 감마 카운터에 로드하고 샘플을 실행하여 각 조건에서 방출된 크롬 51의 양을 정량화합니다. 튜브가 카운터에 적재된 순서를 주의 깊게 기록하십시오. 여기서, 자극되지 않은 PBMC는 처음 3개 레인에 추가되었고, CPG 자극된 PMBC는 4-6개 레인에 추가되었습니다. 이 예에서는 샘플이 원래 플레이트에 배치된 것과 동일한 방식으로 스프레드시트의 셀에 분당 개수를 입력하고 삼중의 평균을 계산했습니다. 예를 들어 첫 번째 조건의 경우 셀 A1, A2 및 A3의 평균이 I3 셀에서 구해졌습니다. 평균이 결정되면 이 공식을 사용하여 각 조건에 대한 특정 용해의 백분율을 계산할 수 있습니다. 예를 들어, 표적 세포에 대한 effector 세포의 비율이 50:1인 자극되지 않은 세포에 대한 특이적 용해 퍼센트를 계산하기 위해 이 예에서 1164.67인 자발적 CPM을 실험 CPM 1129에서 뺍니다. 67. 그런 다음 이 숫자를 최대 CPM과 자발적 CPM의 차이로 나눈 다음 100을 곱하여 백분율 특이적 용해를 제공할 수 있습니다. 그런 다음 각 조건에 대해 계산됩니다. 그런 다음 이러한 데이터를 그래프로 표시하여 자극되지 않은 PBMC와 CPG 자극 PBMC 모두에 대한 백분율 특정 용해와 E 대 T 비율의 비교를 표시할 수 있습니다. 이 예에서 CPG로 자극된 효과기 세포는 표적 세포에 대한 효과기 세포의 비율이 증가함에 따라 표적 세포를 더 효과적으로 죽였습니다. 이러한 증가는 자극되지 않은 PBMC에서 관찰되지 않았으며, 이는 CPG 자극이 관찰된 표적 세포 용해의 증가에 필요함을 나타냅니다.

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chromium release assay for immune cell killing

The chromium release assay measures how well immune cells kill target cells in the lab. It is used to test the cytotoxic ability of T cells, NK cells, and other effector cells against infected cells or tumor cells.

This assay works by labeling target cells with chromium-51, a radioactive tracer called Na2 51CrO4. The label quickly marks cellular proteins inside the target cells. When effector cells damage the target-cell membrane, the labeled proteins are released into the culture supernatant and can be measured.

Researchers use this setup to study antigen-specific and nonspecific killing. It is also useful in tumor immunotherapy research, where scientists may look for agents that boost immune cell killing. In other cases, the assay can help test ways to reduce overly strong immune cytotoxic activity.

Several practical points matter for a good result. Healthy effector cells give stronger killing, and healthy target cells help keep spontaneous death and background chromium release low. Because cell-to-cell contact is needed, round-bottom 96-well plates are often used. Proper data analysis also requires positive and negative control target cell groups.

The standard protocol includes preparing 51Cr-labeled targets, preparing effector cells, adding both cell groups to the plate, incubating, harvesting supernatants, and then analyzing the samples on a counter. Samples are often run in triplicate and averaged to reduce the effect of small pipetting differences. A nonradioactive Europium-based version is also available.

Because 51Cr is a powerful gamma radiation emitter, the assay requires radiation safety training, dedicated lab space, a gamma counter, and proper waste disposal. Users should wear a lab coat and gloves, and safety glasses may also be required. Lead shielding, clear signage, and a Geiger counter with a gamma probe are important for safe handling and contamination checks. In this lab exercise, human peripheral blood mononuclear cells, or PBMCs, are tested as CpG-stimulated or unstimulated effector cells against WM793 human melanoma cells.

Chromium Release Assay for Immune Cell Killing

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flow cytometry and fluorescence-activated cell sorting (facs): isolation of splenic b lymphocytes

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Sorting B Cells from Spleen with FACS

Flow cytometry and FACS can be used to separate B lymphocytes from a mixed spleen cell sample. The immune system protects the body from infectious organisms and other invaders. White blood cells, also called leukocytes, are the main cells involved in this defense. Leukocytes can be grouped into subpopulations such as myeloid cells, lymphocytes, and dendritic cells. These groups can be distinguished by biological, physical, and functional features. Cell size, granularity, and secretion are...

magnetic activated cell sorting (macs): isolation of thymic t lymphocytes

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Enriching Thymic T Cells with Magnetic Sorting

Thymic T cell enrichment with magnetic sorting helps isolate a targeted immune cell group from a mixed sample. The immune system relies on many cell types, and lymphocytes are a major part of adaptive immunity. B cells usually respond to extracellular infections, such as bacterial infections, while T cells usually respond to intracellular infections, such as viral infections. Magnetic sorting enriches selected cells by using magnetic beads and antibodies against cell surface proteins. First,...

elisa assays: indirect, sandwich, and competitive

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ELISA Methods for Detecting Antigens

ELISA methods detect antigens, antibodies, proteins, hormones, peptides, and other biomolecules in biological samples. Enzyme-linked immunosorbent assay is highly sensitive because it can detect very low antigen levels. It works by using an antigen-antibody interaction, then an enzyme-linked antibody turns a colorless substrate into a colored or fluorescent signal that a plate reader can measure. Different ELISA formats are used for different sample types and antibody setups. Indirect ELISA is...

elispot assay: detection of ifn-&#947; secreting splenocytes

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ELISPOT Assay for Single-Cell Immune Detection

ELISPOT is a sensitive assay for detecting immune cells that release a specific protein. It is based on an ELISA, or enzyme-linked immunosorbent assay, but it shows single-cell responses as visible spots. The method was first described in 1983 by Czerkinsky to count B cell hybridomas that produce antigen-specific immunoglobulins. The assay was later adapted to measure cytokine-producing T lymphocytes. Because of that, ELISPOT is now a gold standard for measuring antigen-specific T cell...

immunohistochemistry and immunocytochemistry: tissue imaging via light microscopy

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Antibody Staining of Tissue and Cells

Antibody staining of tissue and cells lets scientists see where a specific antigen is located. Immunohistochemistry, or IHC, uses thin tissue sections. Immunocytochemistry, or ICC, uses isolated cells or cells grown in culture. Both methods rely on antibodies that carry a chemical or fluorescent tag, such as peroxidase or rhodamine, so the target antigen can be detected under a light microscope. IHC keeps the structure of the whole tissue in place while the sample is stained. That makes it...

antibody generation: producing monoclonal antibodies using hybridomas

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Hybridoma Cell Culture for Monoclonal Antibodies

Hybridoma cell culture is used to produce monoclonal antibodies, or mAbs, with a known antigen specificity. Monoclonal antibodies come from a single clone of cells, so they recognize one target more precisely than polyclonal antibodies, which are a mixed group of antibodies against different antigenic determinants. That difference matters when similar molecules share epitopes, or antigen sites, that can confuse an antibody test. Polyclonal antisera can react with more than one related antigen.

immunofluorescence microscopy: immunofluorescence staining of paraffin-embedded tissue sections

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Fluorescent Antibody Staining of Tissue Slides

Fluorescent antibody staining lets scientists see specific proteins in thin tissue sections on glass slides. It is used to study normal tissue structure and to better understand how disease works. In many cases, the tissue comes from patient biopsies or from experimental in vivo models. The tissue is usually fixed in formalin or paraformaldehyde and embedded in paraffin wax before it is cut. This preservation method supports long-term storage and makes sectioning possible. A microtome is used...

confocal fluorescence microscopy: a technique to determine the localization of proteins in mouse fibroblasts

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Confocal Microscopy for Protein Localization

Confocal fluorescence microscopy is used to show where proteins are located inside cells with better detail than wide-field epifluorescence microscopy. It improves image clarity by scanning the sample with lasers and using a pinhole to block out-of-focus light. This makes it easier to see whether a signal comes from the cell surface or from inside the cell. The method relies on fluorescence, which happens when a molecule absorbs light and then gives off a new photon. A fluorophore is a...

immunoprecipitation-based techniques: purification of endogenous proteins using agarose beads

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Protein Pull-Down with Antibodies and Beads

Immunoprecipitation uses antibodies and Protein A/G agarose beads to isolate a specific protein from a cell lysate. It is also called a pull-down assay. The term "immuno" refers to the antibody, and "precipitation" means pulling a substance out of solution. The target protein can be endogenous or recombinant. Recombinant proteins often carry epitope tags such as myc or flag, which makes purification easier because antibodies against these tags are usually strong and effective. Antibodies...

cell cycle analysis: assessing cd4 and cd8 t cell proliferation after stimulation using cfse staining and flow cytometry

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Tracking T Cell Division with CFSE and Flow Cytometry

Tracking T cell division with CFSE and flow cytometry shows how immune cells respond after stimulation. The cell cycle is a normal process of life. During it, a cell changes step by step and divides into two daughter cells. This happens throughout life when the body needs new cells for growth and repair. Cells that are not cycling are in the G0 phase, which means they are quiet. Once a cell enters the cycle, it moves through G1, S, G2, and M phases. G1 is a checkpoint for the resources needed...

adoptive cell transfer: introducing donor mouse splenocytes to a host mouse and assessing success via facs

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Tracking Transferred Mouse Splenocytes by FACS

Adoptive cell transfer is a method for moving cells into a host animal to study biology or help treat disease. Researchers can use it to follow cell movement and distribution, or to test how transferred cells behave in a mouse model. Tracking systems such as cell surface markers and CFSE staining can help show where the cells go after transfer. This approach has several uses in mouse studies. It can support cancer research by transferring specific cell populations as an experimental treatment...

assay for cell death: chromium release assay of cytotoxic ability

The chromium release assay measures how well immune cells kill target cells in the lab. It is used to test the cytotoxic ability of T cells, NK cells, and other effector cells against infected cells or tumor cells. This assay works by labeling target cells with chromium-51, a radioactive tracer called Na2 51CrO4. The label quickly marks cellular proteins inside the target cells. When effector cells damage the target-cell membrane, the labeled proteins are released into the culture supernatant...

immunology

이 컬렉션은 면역 세포의 라벨링 및 분류를 포함하여 면역학 실험실의 많은 주요 기술을 다룹니다. 또한 ELISA를 포함한 면역 활성에 대한 일반적인 분석뿐만 아니라 면역 세포 및 항체 증식 방법을 보여줍니다. 마지막으로 면역 조직 및 세포 검체의 염색 및 이미징을 보여줍니다.

Measure immune cell killing with the chromium release assay. Learn how 51Cr-labeled target cells, PBMCs, and melanoma cells are used to assess cytotoxicity.

Chromium Release Assay for Immune Cell Killing

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