포유 동물 세포에 Glycoproteins의 N - 연결 설탕 체인 펄스 체이스 분석

요약

우리는 포유 동물 세포에서 생합성 후 glycoproteins의 초기 생활을 통해 N - 연결 glycans의 변조 분석을위한 방법을 설명합니다. 이것은 metabolically 표시 glycans, glycoproteins와 HPLC에 의해 시험에서 효소 릴리스의 펄스 체이스 분석에 의해 이루어진다.

초록

Glc의 첨부 파일

프로토콜

다음 프로토콜은 총 glycoproteins이나 관심의 특정 당단백질의 설탕 체인 분석위한 것입니다. 프로 시저는 기본적으로 프로토콜을 통해 언급한 몇 가지 변경 사항과 함께 두 경우 모두에 대해 동일합니다.

1. N - 연결 glycans의 대사 라벨링을 위해 각 샘플에 대해 90mm 접시에 밤새 자란 포유 동물 세포의 subconfluent 문화를 사용하는 한 요구 (샘플 서로 다른 시간 지점이나 트리 트먼트를 나타내는 수 있습니다.) 이 프로토콜은 NIH 3T3 세포에 최적화되어 있습니다.
2. 10% dialyzed FCS와 5-15분 4 MM 나트륨 pyruvate와 함께 제공된 신선한 사전 예열 (37 ° C) 포도당없는 매체, 5 ML에서 부화하여 포도당에 대한 세포를 굶어.
3. 사전 예열 1 ML과 기아 매체를 교체 (37 ° C) 포도당 무료 400 μCi가 포함된 매체 [2 - ³ H] (낮은 65 농도 μCi / ML은 총 glycoproteins의 라벨에 사용됩니다) mannose - 라벨, 1 시간 동안 정상적인 조직 문화 조건에서 세포를 품어.
4. 각 샘플의 라벨 미디어를 제거하고, 신중하게 4 PBS 2 ML을 추가 ° 추적에 해당하는 샘플을 필요로하는 동안 맥박과 얼음 (이 샘플 펄스....

토론

HPLC 분리 살 세포의 glycans의 펄스 체이스 분석 당단백질의 생활 전반에 걸쳐 올리 고당 구조 변경의 역학을 연구하는 방법을 제공합니다. 이러한 변경은 ER의 접이식, 품질 관리 및 인신 매매 시스템 ^2-5에 대한 신호를 생산에 관여하는 성장 증거가있다. 방법뿐만 아니라 관심의 특정 당단백질뿐만 아니라 우리가 대조 특정 ERAD 기판의 운명과 세포 당단백질 수영장의 비교이 문서에 설명된 총 glycoproteins, 구조의 역학을 분석하는 데 적용할 수 있습니다 . 정화 기술은 간단하지만, 그럼에도 불구하고 구체적인 것입니다. 이러한 O - 연결된 설탕 체인 및 GPI - 정박 단백질로 인간 - 엄격한 deglycosidases와 분자 여과를 사용하여 그것은 ^[3 H 2]로 표시된 다른 macromolecules 남겨두고, glycoproteins에서 출시만을 N - 연결 glycans를 얻을 것을 보장합니다. dolichol 전구체에서 발표 Oligosaccharides은 무시.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
600E 다중 용매 공급 시스템 컨트롤러	Waters	WAT062710
아세토나이트릴 LiChrosolv (액체 크로마토그래피용 그래디언트 등급)	Merck & Co., Inc.	1.0003
Microcon Amicon Ultra 0.5 ml 30K 또는 Centricon ultracel YM-30	EMD Millipore	UFC503024 또는 4208
농축기 5301, 48 x 1.5 / 2.0 ml 고정각 로터 포함	Eppendorf	5301 000.016
투석된 F–태아 송아지 혈청	바이오 산업	04-011-1A
Dulbecco’수정 이블(Modified Eagle)’배지	Life Technologies의 GIBCO	41965039
Dulbecco’수정 이글(Modified Eagle)’배지 - 포도당 무첨가	Sigma-Aldrich	D5030
Dulbecco’인산완충생리식염수(PBS)	Sigma-Aldrich	D1408
EDTA 이나트륨염(Titriplex Iii)	Merck & Co., Inc.	1084180250
Endo Hf Kit (1,000,000 units/ml)	New England Biolabs	p0703S
F–태아 송아지 혈청 (FCS)	생물 산업	04-001-1A
Frac-100 분획 수집기	Amersham	18-1000-77
LS 6500 액체 섬광 계수 시스템	Beckman Coulter Inc.	510720
만노스, D-[2-3H(N)]- (비방사능: 15-30Ci/mmol)	PerkinElmer, Inc.	NET570A
N-카보벤조실-류시닐-류시닐-류시날 (MG-132)	Calbiochem	474790
N-글리코시다아제 F (1000 units/ml)	로슈 그룹(Roche Group)	11365177
N-옥틸글루코사이드	Sigma-Aldrich	O3757
NIH 3T3 세포	American Type Culture Collection	CRL-1658
옵티-플라워(Opti-Flour)	PerkinElmer, Inc.	6013199
인산 용액 (49-51%, HPLC용)	Fluka	79607
프로테아제 억제제 칵테일	Sigma-Aldrich	P2714
Protein A-Sepharose 비드	Repligen	IPA300
토끼 폴리클론성 anti-H2 카복시 말단 항체 6
데옥시콜산 나트륨	Sigma-Aldrich	30970
소듐 도데실 설페이트	Bio-Rad	161-0301
인산나트륨	Sigma-Aldrich	342483
피루브산나트륨 용액 (100mM)	Sigma-Aldrich	S8636
Spherisorb NH2 컬럼, 5 $\mu\text{m}$ μm, 4.6 x 250 mm	Waters	PSS831115
Triton X-100	VWR	306324N
Vibra-Cell 초음파 처리기 VCX 750	Sonics and Materials, Inc.	690-003
<강력한>버퍼 A: PBS 내 1% Triton X-100, 0.5% w/v sodium deoxycholate, 2% v/v Protease inhibitor cocktail
<강력한>완충액 B: 0.5% w/v SDS, PBS 내 2% v/v 프로테아제 억제제 칵테일
<강력한>버퍼 C: N-glycosidase F 반응 완충액: 200mM Na3PO4, pH 8.0, 4mM EDTA, 1.5% N-octylglucoside
H2a를 안정적으로 발현하는 NIH 3T3 6
<강력한>완충액 D: 0.5% Triton X-100, 0.25% w/v 데옥시콜산나트륨, 0.5% w/v SDS, PBS 내 2% v/v 프로테아제 억제제 칵테일
<강력한>완충액 E: 0.5% w/v SDS, 1% v/v 2-Mercaptoethanol–에탄올, PBS 내 2% v/v 프로테아제 억제제 칵테일
2-머캅토–에탄올	Sigma-Aldrich	M3148