Summary
Animal caps overexpressie genproduct (s) worden getransplanteerd om de flank van de ontwikkeling van
Abstract
Veel eiwitten spelen een dubbele rol in de embryonale ontwikkeling. Degenen die lot van de cel bepalen regelen in een specifiek weefsel kan ook invloed hebben op de ontwikkeling van een groter gebied van het embryo. Dit maakt de definitie van zijn rol in een bepaald weefsel moeilijk te analyseren. Bijvoorbeeld:
Protocol
Deel I. Set-up voor de ACT-test
- Genereer afgetopt RNA voor injectie zoals voorgesteld door de fabrikant, met behulp van hun fenol: chloroform zuiveringsmethode (bijvoorbeeld mMessage mMachine Kit; Applied Biosystems / Ambion, Austin, TX). RNA dat codeert voor een fluorescerend eiwit wordt gebruikt als een tracer. We overschrijven ofwel geel fluorescerend eiwit (YFP) of mCherry 5 cDNA, die in een pCS2 + expressievector.
- Trek borosilicaatglas capillaire buizen aan taps toelopende glas tips met behulp van een micropipet trekker vormen. We maken gebruik van Sutter Micropipet Puller, P-97 (Sutter Instruments, Inc, Novato, CA), zoals eerder beschreven 6.
- Maak steriele oplossingen in tabel 1 van een 10 X Marc's gemodificeerd Ringer (MMR) oplossing voorraad (10 mM MgCl2, 20 mM KCl, 20 mM CaCl2, 50 mM HEPES, 1 M NaCl, pH 7,5, geautoclaveerd en opgeslagen bij RT).
- Isoleer testes van een mannelijke kikker en bewaar het weefsel bij 4 ° C in een steriele oplossing van 1X MMR / gentamicine (50 ug / ml gentamycine-sulfaat, BioWhittaker, Cat # 17-518Z). Dit kan worden gedaan tot een week voor de start van het experiment, maar het is verliest de effectiviteit in de tijd.
- Eileg oplossing (1X: 150 mM NaCl, 2,62 mM KCl, 0,8 mM Na 2 HPO 4, 20 mM Trizma basis, 2,62 mM NaHCO 3 en 2,75 mM MgSO 4, op pH 7,6) kan worden gemaakt als een 8X voorraad, die kan worden opgeslagen bij 4 ° C gedurende maximaal twee weken. Opmerking: pas op voor besmetting in deze oplossing, omdat dit de kwaliteit van uw eieren beïnvloeden.
- Genereer injectie platen. Om dit te doen, smelten 1% agarose in 0.4x MMR in de magnetron, voeg ~ 6 ml gesmolten agarose-oplossing in 60 mm platen, zachtjes uitrollen een elastomeer mal (figuur 1) op de top van de oplossing om bubbels te voorkomen en laat afkoelen voor ongeveer 20 minuten bij RT. Voor het bepalen van de benodigde nummer, kunt u overwegen het aantal experimentele condities (bijvoorbeeld 1, YFP, 2, YFP + Noggin) en het aantal getransplanteerde gastheer embryo's nodig. Voor onze experimenten hebben we het genereren van minstens 20 getransplanteerd gastheer embryo's voor elke experimentele conditie. Bij 18-19 ° C, embryo's zal op het podium 15 voor ongeveer een uur. Als het duurt een uur uit te voeren 20 transplantaties, dan twee bevruchting tijdstippen nodig zijn, ervan uitgaande dat de gastheer embryo's accepteren alle transplantaties. Daarom zal vier injectie gerechten nodig zijn (2 x 2 exp voorwaarden bemesting tijdstippen = 4). Bewaar de platen bij 4 ° C gedurende maximaal een week.
- Genereer cap isolatie platen met behulp van 1% agarose + 0,7 x MMR met schimmels als voor de injectie plaat. Maak hetzelfde aantal cap isolatie als injectie platen plus een extra bemesting per tijdstip (4 + 2 bemesting tijdstippen = 6).
- Injecteren vrouwen met 500 eenheden humaan choriongonadotrofine laat op de dag op de dag voor micro-injectie. Bewaar vrouwtjes bij 16-18 ° C gedurende de nacht.
Deel II. RNA micro-injectie van Xenopus laevis embryo's
A. Voorbereiding voor micro-injectie
- Verwijder hormonaal geïnduceerde vrouwelijke en plaats ze in individuele tanks met 1X eileg-oplossing (ELS). Opmerking: we maken geen gebruik van eieren die zijn geweest in de ELS meer dan twee uur als de kwaliteit van de eieren wordt verminderd. Daarom ongeveer een uur voor in vitro fertilisatie, we leggen alle eieren uit de tank, zodat alleen vers gelegde eieren worden verzameld.
- Bereid de naald voor micro-injectie door knippen uit de tip om een 25 tot 35 micrometer diameter te verkrijgen. Plaats de naald op de picoinjector en te kalibreren, zodat het uitdeelt 10 nL per injectie.
- Stel een incubator op 14 ° C.
- Zodra vrouwen hebben eieren voor ongeveer een uur, verwijder dan de eieren van de tank met behulp van een transferpipet en plaats ze in 60 mm petrischalen. Verwijder zo veel ELS uit de eieren mogelijk te zijn en te vervangen door 1X MMR. De eieren kunnen meteen worden bemest of verblijf in 1X MMR voor maximaal een uur. Voor de transplantatie assay, is het het beste om twee schotels, 80% vol van een enkele laag van eieren in maximaal bevruchten drie verschillende partijen rond 11 uur, 's middags en 1 uur. Na injectie, zullen ze worden geplaatst bij 14 ° C, zodat ze zal groeien tot de gewenste stappen voor de cap isolatie (fase 8,5-9) en transplantatie (etappe 15, zie Deel I, # 6 hierboven).
- Het controleren van de kwaliteit van de testes, voeren we een vroege ochtend bevruchting (~ 8 uur), waardoor we testes uittreksel uit een ander mannetje als het sperma van de eerste is niet levensvatbaar. Let op: wij homogeniseren ~ 0,25 testes in 1 ml 1X MMR en voeg ongeveer 5 tot 7 druppels per plaat van de eicellen.
- In vitro bevruchten van de eieren met gehomogeniseerde testes en een uur later, de gelei laag op de eieren met behulp van de-jelly oplossing te verwijderen (164μl 1M DTT + 10mL 1 M Tris, pH 8,8 tot 50 ml geautoclaveerd nanopure water). Wacht tot ze bij twee-cellig stadium te sorteren, die ongeveer twee uur duurt bij 18 ° C beginnen of 1,5 uur bij kamertemperatuur (22 ° C).
- Met behulp van een transfER pipet, sorteren uniform gepigmenteerd en gelijkmatig verdelen embryo's, zoals getoond in de linker dier kap in figuur 3, in de bron van een injectie schaal gevuld met 0.4x BMR + 6% Ficoll.
B. micro-injectie
- Stretch Parafilm over de bovenkant van een 60 mm petrischaal deksel. Pipetteer 2 pi van uw eerste RNA-monster op de Parafilm en zuig met behulp van de PLI-100 om uw injectienaald te vullen. Zorg ervoor om te controleren of de naald nog steeds 10 nL doseren van het monster vóór het begin van injectie.
- Injecteren 20-30 twee-cellig stadium embryo's (beide blastomeren) met 500 pg YFP RNA in een schotel en je gen van belang (bijvoorbeeld 20 pg Noggin RNA) plus YFP RNA in een andere schaal 7.
- Plaats 100 tot 200 niet-gespoten embryo's per tijdstip in een andere injectie schotel met de Ficoll oplossing. Verplaatsen in en uit de couveuse op hetzelfde moment als de geïnjecteerde embryo's. Dit zijn de gastheren om gebruikt te worden in deel IV.
- Na injectie, incuberen alle embryo's bij 14 ° C gedurende de nacht. Herhaal dit voor alle tijdstippen.
Deel III. Isoleer dier doppen van geïnjecteerde embryo's
- Arriveren vroeg in de ochtend om de embryo's podium. De vroegste tijdstip moet worden in fase 9. Verwijder die dat niet deden overleven. Ga verder met de volgende stappen uit te werken met elk tijdstip in batches.
- Giet de Ficoll oplossing van elk bord en voeg weer 0,7 x MMR / gentamicine oplossing. Om een pet isolatie schotel, voeg een flinke hoeveelheid van 0,7 x MMR / gentamicine oplossing. Los embryo's van hun injectie schotel putten met behulp van een transferpipet en plaats in de vers bereide dop isolatie gerecht.
- Isoleren van dieren caps in 0,7 x MMR + gentamicine oplossing, het houden van twee of drie intacte embryo's voor enscenering. Of de Gastromaster, uitgerust met een gele punt omgebogen tot 400 micrometer, of een paar scherpe nummer 5 tang kan worden gebruikt.
- Leg caps in 14 ° C incubator tot de volgende dag. De host embryo's moet worden verwijderd uit de incubator op hetzelfde moment als de caps te houden in dezelfde ontwikkelingsfase als de donor weefsel.
Deel IV. Transplantatie van caps op flank
- Verwijder het kapje en embryo's van de eerste keer dat punt van de 14 ° C incubator en het stadium van de embryo's. Sorteer voor uniforme geel of rood fluorescerend-positieve caps, afhankelijk van de tracer geïnjecteerd (figuur 2).
- Tel het aantal caps en verwijder het dubbele van het aantal van fase 12 tot 13 embryo's op een vers bereide injectie schotel met 0,7 x MMR / gentamicine oplossing. Met scherpe # 5 tang, verwijder de vitelline membraan van elkaar. Overbrengen naar de plaat met de caps, maar wees voorzichtig. Zonder hun vitelline membranen, kunnen embryo's snel los op het wateroppervlak.
- Met behulp van de gastromaster (gele tip, 200-250μm gebogen draad, hoogste stand) of # 5 tang, verwijderen van een 200 pm plein aan de kant van de embryo's in stadium 14-15 (figuur 3). Daarna, snijd een kapje in de helft (met de gastromaster of de # 5 pincet) en plaats het weefsel in het gat gemaakt in de gastheer embryo. Draai de embryo tegen het goed om genezing mogelijk te maken. Doe dit voor zoveel embryo's als je kunt, terwijl ze op het podium 15. Herhaal dit voor alle tijdstippen.
- Het embryo zal genezen meestal binnen 30 minuten. Verwijder de dode cellen (wit) met een zachte borstel beweging met een # 5 pincet. Groeien ze op 18 ° C gedurende de nacht.
- Onder het ontleden fluorescentie microscoop, een soort embryo's met fluorescent-gelabeld, getransplanteerde weefsel. Leg ze terug bij 18 ° C te groeien tot het podium 42-43.
- Verdoven van de dieren in tricaïne. Op dit punt, kunt u foto's onder een fluorescentie microscoop dissectie. Nadat je klaar bent, te repareren, sectie en immunostain of het uitvoeren van in situ hybridisatie met behulp van markers voor uw weefsel van belang.
Figuur 1. Ontwerp van plexiglas voor het uitbrengen van het elastomeer mal wordt gebruikt voor het maken van embryo holding gerechten. Een 38 x 38 mm rond-hoekig vierkant (~ 5 mm diep) is gerouteerd uit een stuk plexiglas, dat is 50 x 50 mm vierkant en 25 mm dik. Circulaire, gelijkmatig verdeelde Wells (1,5 mm diameter) zijn geboord 1 mm diep in het plastic. Om de elastomeer mal voor de micro-injectie gerechten, we gegoten Sylgard elastomeer in het plexiglas en liet het te stollen, als per instructies van de fabrikant. Dit elastomeer mal wordt gebruikt om de injectie en cap isolatie platen te maken.
Figuur 2. Animal cap sorteren voorafgaand aan de transplantatie is belangrijk, omdat uitdrukking kan variëren. Animal dop op de linker uitdrukt gelijkmatig mCherry het hele weefsel, terwijl de explantatie aan de rechterkant heeft vlekkerig uiting en zal worden weggegooid.
Figuur 3. Een host tadpole heeft ontwikkeld, een eye-achtige structuur op zijn flank van de getransplanteerde dieren cap-cellen. Een TL-beeld is overlayed op de helderveld beeld.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In deze video, hebben we aangetoond onze versie van de klassieke technieken die worden gebruikt door Xenopus biologen, die we herschikt om het dier dop transplantatie assay te creëren. Bij kamertemperatuur, Xenopus embryo's ontwikkelen zich zeer snel door stadia 9 en 15. Door ze bij 14 ° C, de ontwikkeling van het embryo wordt vertraagd en nog veel meer transplantaties kunnen worden uitgevoerd in een experiment. Als het nodig is om de embryo's groeien naar oudere stadia (> 42/43), dan raden wij u aan transgene venus YFP dieren, omdat het geïnjecteerde fluorescent eiwit-signaal verdwijnt in oudere kikkervisjes. We hebben gebruik gemaakt van deze test om dat dier cap weefsel uiten EFTFs of Noggin is gespecificeerd in oog-achtige weefsel vast te stellen. Deze test kan worden gebruikt als een eenvoudige test om vast te stellen of er een gen (s) van belang is noodzakelijk voor het bepalen van een bepaalde cel lot.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door subsidies van onderzoek naar Blindness (Career Development Awards voor MEZ en ASV en een onbeperkte subsidie aan de afdeling Oogheelkunde), de E. Matilda Zeigler Foundation (MEZ en ASV) en het National Eye Institute / NIH (MEZ voorkomen , subsidies R01EY015748 en R01EY017964).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| mMessage mMachine SP6 Kit | Applied Biosystems | AM1340 | |
| Borosilicate Capillary Tubes (1.0mm OD x 0.5mm ID) | FHC, Inc. | 27-30-1 | |
| Sutter Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Gentamicin sulfate [50 mg/ml] | Fisher Scientific | BW17-528Z | |
| Sylgard/elastomer Kit 1.1lb | Fisher Scientific | NC9644388 | |
| 60 x 15 mm polystyrene petri dish | USA Scientific, Inc. | 8609-0160 | |
| human chorionic gonadotropin | Intervet Inc. | 22219 | |
| Pico-Injector Microinjection Systems | Harvard Apparatus | 650003 | |
| Torrey Pines Scientific ECHOtherm Incubator | Fisher Scientific | 11-680-21 | |
| Transfer pipette | Krackeler Scientific, Inc. | 6290-20635A | |
| Dumostar #5 Forceps | Fisher Scientific | 11295-10 |
References
- Smith, W. C., Harland, R. M. Expression cloning of noggin, a new dorsalizing factor localized to the Spemann organizer in Xenopus embryos. Cell. 70, 829-840 (1992).
- Lamb, T. M. Neural induction by the secreted polypeptide noggin. Science. 262, 713-718 (1993).
- Green, J. Molecular Methods in Developmental Biology: Xenopus & Zebrafish. Methods in Developmental Biology. , Humana Press. Towata, N.J. (1999).
- Viczian, A. S., Solessio, E. C., Lyou, Y., Zuber, M. E. Generation of functional eyes from pluripotent cells. PLoS Biol. 7, e1000174-e1000174 (2009).
- Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nat Methods. 2, 905-909 (2005).
- Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. Making patch-pipettes and sharp electrodes with a programmable puller. J Vis Exp. , (2008).
- Lan, L. Noggin Elicits Retinal Fate in Xenopus Animal Cap Embryonic Stem Cells. Stem Cells. , (2009).
