Bromodeoxyuridine 펄스 라벨링 분석: 세포 증식을 측정하는 기법

초록

출처: Welschinger R. et al. 동기화 필요 없이 유세포 분석을 사용한 세포 주기 진행의 시간적 추적. J. Vis. 특급 (2015)

이 동영상은 세포 증식을 측정하기 위해 브로모데옥시우리딘(BrdU)을 사용한 포유류 세포의 단계적 펄스 라벨링 분석에 대해 설명합니다. BrdU 흡수를 통해 세포를 동기화할 필요 없이 특정 시점에 합성 단계에 있던 세포를 시간적으로 추적할 수 있습니다.

프로토콜

1. 솔루션 및 시약

1. 완전한 RPMI
   1. 56ml의 송아지 혈청(FCS)과 5.5ml의 200mM L-글루타민을 RPMI-1640 배지 500ml 병에 추가합니다.
2. BrdU 스톡 솔루션
   1. Dulbecco의 인산염 완충 식염수(DPBS)에서 32.5mM BrdU(10mg/ml)를 준비합니다.
3. BrdU 완전한 RPMI
   1. 6.2μl의 BrdU 원액을 Complete RPMI 10ml에 첨가합니다.
4. DNase 솔루션
   1. DPBS로 1mg DNase/ml를 준비합니다.
5. 염색 완충액
   1. DPBS에서 3% 열 불활성화 FCS와 0.09% 아지드화나트륨을 준비합니다.
6. Fixation Buffer, Permeabilization Buffer 및 Wash Buffer의 정의는 Materials List를 참조하십시오.

2. 셀

참고: 세포는 6개월 이상 배양되지 않았습니다. 이 방법은 세포 밀도 및 배양 배지를 조정하여 부착되지 않은 모든 세포주에 직접 적용할 수 있습니다. 실험 시작 시 기하급수적으로 증가하는 세포를 사용합니다.

1. T-75 배양 플라스크의 NALM6 세포를 완전한 RPMI로 유지합니다. Class II Biosafety Cabinet을 사용하여 멸균 조건에서 모든 단계를 수행합니다.
매주
2. 3회 배양액을 분할하여 ml당 1-2 x 10⁶ 세포 사이의 NALM6 세포를 유지합니다.
3. 37 ° C에서 공기 중 5 % CO₂로 배양하십시오.

3. BrdU를 사용한 세포의 펄스 라벨링

주의: BrdU는 잠재적인 돌연변이 유발 물질 및 기형 유발 물질이므로 주의해서 다루십시오.

1. 150 x g에서 5분 동안 원심분리기 셀
   메모: 세포를 새로운 배지로 옮기면 결과의 재현성이 향상됩니다.
2. 세포 계수를 수행하고 2 x 10⁶ cells/ml에서 전체 RPMI로 세포를 재현탁합니다.
3. BrdU Complete RPMI로 세포 1 in 2를 희석하여 1 x 10⁶ cells/ml의 최종 세포 농도를 생성합니다.
4. 37°C에서 5% CO₂로 45분 동안 배양한 다음 완전한 RPMI로 세포 1/10을 희석합니다. 150 x g에서 5분 동안 세포를 원심분리하고 모든 상층액을 조심스럽게 버립니다.
5. 완전한 RPMI의 작은 부피(~100 μl)로 세포를 재현탁하고, 세포 계수를 수행하고, 1 x 10⁶ cells/ml로 조정합니다.
6. 1ml의 세포를 48웰 플레이트의 웰에 피펫팅합니다. DPBS 1ml를 비어있는 웰에 피펫팅하여 보다 재현성 있는 결과를 얻습니다.
7. 원하는 시점 동안 공기 중 5 % CO₂에서 37 ° C에서 배양하십시오 (여기에서 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 및 24 시간)
   메모: 시간의 길이는 실험 설계가 측정하려는 대상에 따라 달라집니다.
8. 피펫을 사용하여 모든 세포를 FACS 튜브로 옮깁니다. 1ml 용량의 PBS로 웰을 순차적으로 헹구어 최종 총 부피 5ml까지 만듭니다.
9. 150 x g에서 5분 동안 원심분리기를 가열하고 모든 상층액을 조심스럽게 제거합니다. 세포를 염색할 준비가 되면 즉시 이 작업(섹션 4)을 수행합니다.

4. 세포 염색

참고: 세포의 표면 염색이 필요한 경우 고정 전에 이를 수행하여 세포가 전체적으로 4°C로 유지되도록 합니다.

1. 100 μl의 염색 완충액에 세포를 재현탁시킵니다(선택적 표면 염색의 경우, 권장 부피의 항체를 표면 항원에 추가하고 4 °C에서 30분 동안 배양).
2. 염색 완충액 1ml를 넣고 150 x g에서 5분 동안 원심분리한 후 상등액을 버립니다.
   참고: 특정 항체, 농도, 배양 시간 등은 특정 실험 목표에 따라 달라집니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
NALM6	디에스엠즈	ACC-128
5-브로모-2'-데옥시우리딘	시그마	B5002-1G
RPMI 1,640 w/o L-Gln 500 ml	론자	12-167층
디피에스	론자	17-512층
소 태아 세럼	피셔바이오텍	FBS-7100113
CO2 인큐베이터	바인더	재질 보기 C 150
BD Falcon 12 x 75mm FACS 튜브	BD 바이오사이언스	352008
BD LSR FORTESSA 유세포 분석기	BD 바이오사이언스	포르테사
원심 분리기	스핀트론	GT-175R