정소성 동종이식 종양 이식: 췌장 종양 마우스 모델을 생성하는 기술

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 종양이식 준비

1. 동물 사육
   1. 상업용 육종 공급업체에서 일반 C57BL/6 마우스를 구하십시오.
   2. 다음 조건에서 개별 환기 케이지에 있는 집쥐 (5): 온도: 20-26 °C; 습도 30-70%; 조명 주기: 12시간 밝음, 12시간 어둡게.
   3. 매주 교체되는 옥수수 속대 침구를 사용하십시오.
   4. 다이어트를 위해 전체 연구 기간 동안 방사선 살균된 건조 과립 식품을 제공하십시오.
   5. 물의 경우 동물이 멸균 식수를 자유롭게 이용할 수 있도록 합니다.
2. 공여체 종양 절편 준비
   1. 저울을 사용한 체중 측정을 통해 체중(BW)을 모니터링하고, 캘리퍼 측정을 통해 종양 보유 기증자 마우스의 종양 부피(TV)를 모니터링하는 것으로 시작합니다.
   2. TV가 500-1,200mm³에 도달하면 프로토콜에 따라 생물학적 위험 후드에 동물을 안락사시킵니다.
   3. 요오드핀 면봉을 사용하여 종양 주변 피부를 소독합니다.
   4. 프로토콜에 따라 외과적으로 종양을 제거합니다.
   5. 종결 전에 육안으로 그리고 촉진을 통해 만져질 수 있는 종양이 있는지 검사합니다.
   6. 종결을 위해서는 먼저 승인된 프로토콜에 따라 쥐를 안락사시키고 복부를 열고 췌장에 종양이 있는지 육안으로 검사합니다.
   7. 사망 후 수술로 종양을 잘라내고 차가운 PBS에 첨가합니다. 모든 동물을 사용할 이산화탄소를 운반할 수 있는 포트가 있는 특수 뚜껑이 있는 깨끗하고 충전되지 않은 반투명 안락사 챔버에 넣습니다.
   8. 동물에 대한 고통을 최소화하면서 빠른 의식을 잃게 하는 유속으로 가스를 챔버 안으로 방출합니다. CO₂의 최적 유속은 약 2–2.5L/min이어야 합니다.
   9. 안락사 절차 중 각 동물을 육안으로 관찰하여 모든 동물이 적절한 가스 농도를 받고 안락사 절차 중에 의식을 회복하지 않는지 확인합니다.
   10. 명백한 임상적 사망 후 최소 1분 동안 가스 흐름을 유지하여 동물이 회복할 가능성을 최소화합니다(무호흡이지만 죽지 않은 경우).
   11. 인접한 비종양 조직을 제거합니다. 청소된 종양은 빠르게 사진을 찍을 수 있습니다.
       종양 조직을 RPMI-1640에 넣고 해리하기 전에 얼음 위에 보관하십시오.
       메모: 동물 사체는 자루에 담아 적절한 냉동고에 보관하여 제거될 때까지 기다립니다.
   12. PBS 20mL가 들어 있는 페트리 접시에 종양을 넣습니다(동물을 안락사시키기 전에 배지 또는 완충액을 4°C로 사전 냉각
   ).
   13. 오염된 혈액이 있는 경우 종양을 다른 페트리 접시로 옮기고 PBS로 종양을 씻으십시오.
   14. 종양을 반으로 자르고 여분의 피부, 혈관, 석회화 및/또는 괴사를 제거합니다.
   15. 손상되지 않은 종양 조각만 선택하여 멸균된 50mL 원심분리 튜브에 넣고 PBS 20mL를 추가한 다음 약리학 연구를 위해 튜브를 별도의 동물실로 운반합니다.

2. 췌장 이소성 이식

1. 마취와 진통제
   1. 2mL 케타민 주사와 0.42mL 자일라진 주사(20mg/mL)를 5.91 멸균 주사 물 또는 식염수에 혼합하여 체중 0.06–0.1mL/20-25g의 용량으로 사용합니다.
      참고: 동물 복지에 따르면 진통제는 수술 전후에 모두 필요합니다. 0.05–0.1 mg 부프레노르핀/kg, SC. 첫 번째 용량은 수술 전이며 수술 후 4시간마다 3회 지속적으로 투여합니다.
2. 정형소 이식을 위한 외과적 수술
   1. 근육 주사(IM)를 통해 마우스를 마취합니다. 수혜 동물을 5% 이소플루란으로 마취시키며, 이는 콧방울에 의해 1%로 유지됩니다. 동물은 긴장을 풀기 시작하고 오른쪽 반사 신경을 잃고 결국 움직일 수 없게 됩니다. 이 깊은 마취 상태에서 그들은 고통스러운 자극에 의해 쉽게 깨어날 수 있다. 통증에 대한 그러한 반응이 사라질 때까지 마취가 깊어지도록 하십시오.
   2. 동물을 완전히 마취 한 후 마우스를 오른쪽 측면 위치의 실험 보드에 고정합니다.
   3. 마우스를 올바른 측면 위치에 유지합니다. 비장 주변 피부를 요오드로 소독한 다음 75% 에틸 알코올로 요오드를 제거합니다.
   4. 비장의 중간 지점을 찾아 복부를 1cm 수직 절개하여 비장을 노출시킵니다.
   5. 비장 아래의 췌장 조직 일부를 편평한 핀셋으로 부드럽게 뽑아내고, 종자 마우스의 종양 조각을 9-0 흡수성 수술 봉합사로 수혜자 마우스의 췌장에 봉합합니다.
   6. 더블 솔기로 6-0 실크 봉합사로 복부를 닫습니다. 압축을 통해 항상성을 달성합니다.
   7. 종양 이식이 끝난 후 출혈이나 종양 조직 누출이 발생하지 않으면 동물을 따뜻한 우리에 보관하십시오.
   8. 동물이 흉골 누운 자세를 유지할 수 있을 만큼 충분한 의식을 회복할 때까지 관찰하고, 마취에서 완전히 회복된 후 동물을 동물실로 되돌려 놓는다. 비장 근처의 복부를 촉진하여 종양이 있는 마우스를 모니터링하고 정소성 종양이 있는 마우스를 선택합니다.

3. 종양이 있는 마우스 건강 모니터링

1. 매일 물과 음식 섭취량을 확인하십시오.
2. 손질되지 않은 털, 덩어리, 야위어짐, 비정상적인 호흡 또는 복수가 있는지 마우스의 외모를 검사합니다.
3. 복부를 촉진하여 간이나 비장에 자발적 종양이 있는지 확인합니다.
4. 저울을 사용하여 매주 마우스의 무게를 잰다.
5. 다음과 같은 임상 징후 중 하나라도 관찰되면 샘플 채취 및 부검을 위해 마우스를 희생합니다: BW 손실 >20%; 이동성 손상(먹거나 마실 수 없음); 상당한 복수 및 복부 비대로 인해 정상적으로 움직일 수 없음; 호흡에 노력을 기울입니다.