Summary
Cette vidéo va montrer des méthodes pour induire des infections de souris transurethrally des voies urinaires et de quantifier l'ampleur des infections résultant.
Abstract
Souches uropathogènes bactériennes d'intérêt sont cultivés sur gélose. Généralement, uropathogènes
Protocol
I. Préparation de sonde urétrale
- Pour chaque vessie et du rein de souris à échantillonner, placez 5-6 billes en acier inoxydable (vessie, 1,6 mm ou de 0,9 à 2,0 la taille mélange mm) ou des billes d'oxyde de zirconium (rein, 0,5 mm taille) dans un tube cryovial, respectivement. Autoclaver les tubes de perles contenant.
- Après les tubes refroidir à température ambiante, ajouter 200 microlitres de PBS stérile à chaque acier billes contenant le tube inox et 400 microlitres de PBS stérile à chaque oxyde de perles tube contenant du zirconium.
- Nous préparons sonde urétrale décrite par Hung et Hultgren 13. Autoclave une paire propre de tête plate pinces et de ciseaux fins (iris ou de type similaire) et permettre les instruments à refroidir à température ambiante. Essuyez les surfaces d'une hotte à flux laminaire avec de l'éthanol à 70%. Dans la hotte, couper un 30 cm (approximative) du segment de tuyau en polyéthylène. Aseptiquement place une aiguille de calibre 30 stériles (1 / 2 pouces longue aiguille) sur une seringue stérile de 3 cc. Ramassez une extrémité du tuyau de polyéthylène coupés avec des pinces à l'autoclave et faites glisser le tube sur l'aiguille jusqu'à ce qu'il rencontre le moyeu. Couper le tube de telle sorte que d'environ 2 cm s'étend au-delà de la pointe de l'aiguille. Retirer le cathéter de la seringue et le placer dans une boîte de Pétri stérile.
- Pour réduire la probabilité de contamination croisée, nous faisons un cathéter pour chaque souris. Après tous les cathéters sont faites, les stériliser par une exposition dans un plat de Pétri découverts à une irradiation UV pendant au moins 30 minutes. Ne pas regarder directement les lampes UV ou exposer toute partie du corps dans la hotte tandis que les lampes sont activées. Après exposition aux UV, les cathéters peuvent être stockées à long terme dans la boîte de Pétri. Nous vous recommandons de sceller le plat avec du parafilm pour aider à maintenir la stérilité.
II. Inoculation à l'animal
- Souris doivent arriver au moins une semaine avant la manipulation expérimentale, afin d'éviter le stress induit par des facteurs confondants. Des souris femelles sont utilisées car l'urètre souris mâle est extrêmement difficile à cathétériser. CBA / J est une couramment utilisées, l'UTI sensibles souche de souris consanguines. Souris devrait être utilisé entre 8 et 12 semaines d'âge, puisque c'est la fenêtre de la maturité immunologique avant la sénescence. Le premier jour de l'expérience, tremper le bout d'une anse stérile inoculation dans un flacon de stock bactériennes congelées. Racler un petit inoculum et hors série sur une plaque de gélose appropriée. Généralement uropathogènes, E. coli (UPEC) et d'autres souches peuvent être cultivées pendant une nuit sur le milieu de Luria-Bertani (LB) d'agar à 37 ° C dans l'air ambiant. UPEC souches poussent aussi solide, blanc-jaunâtre colonies translucides sur gélose LB. Remettre immédiatement le stock bactérienne au congélateur. Souches uropathogènes bactérienne peut devenir moins virulent dans le temps avec répétées, les cultures de série. Par conséquent, nous recommandons de stries sur une gélose fraîche pour chaque expérience.
- Le jour 2 de l'expérience, après avoir confirmé la morphologie des colonies bon, ramasser des colonies isolées à partir de plaques d'agar et le lieu dans au moins 5 cc de bouillon de culture pendant la nuit. Bouillon LB peut être utilisé pour la plupart des souches bactériennes uropathogènes (37 ° C, 200 rpm dans l'air ambiant). Gardez les bouchons en vrac sur les tubes de bouillon de culture pour permettre l'aération.
- Au jour 3 de l'expérience, de prendre 10% du bouillon de culture première et culture dans un bouillon à nouveau pendant la nuit (généralement 37 ° C et 200 rpm), pour améliorer l'expression de type I pili. Cultures de bouillon de série permet d'optimiser uropathogenicity bactérienne, car les pili de type I a été démontré pour être un facteur de virulence essentiel pour uropathogènes in vivo 1. Gardez les bouchons en vrac sur les tubes de bouillon de culture pour permettre l'aération.
- Au jour 4, de l'expérience, mesurer la DO 600 de la culture en bouillon du jour 3. S'il n'est pas déjà connu pour la souche bactérienne testée, effectuez dix fois plaquage de dilution en série sur au moins 7 logs (dilutions effectuées avec du PBS, les cultures effectuées sur gélose LB, 37 ° C une nuit d'incubation) pour déterminer la relation entre la DO 600 et CFU / ml. En règle générale, une DO 600 de 0,4-0,5 correspond généralement à la 1-2x10 7 cfu par 50 microlitres. Une fois la relation entre l'OD 600 et UFC / ml a été déterminée, on peut ajuster le bouillon de culture à la DO 600 correspondant à l'ufc désiré par souris dans 50 microlitres de PBS. Certains travaux ont suggéré que l'inoculation de 10 microlitres, plutôt que 50, conduit à moins de reflux dans l'kidneys6. Cependant, la plupart des publications ont rapporté l'utilisation de 50 microlitres par souris. Généralement, les gammes ufc souhaitée entre 10 6 et 108 ufc / souris, mais chaque combinaison souche bactérienne / souris doit être empiriquement testée in vivo.
- Pour aider à s'assurer que les inoculums ne sont pas annulés immédiatement après l'instillation, les souris doivent être privés d'eau pendant au moins 30 minutes avant l'induction de l'anesthésie générale. Une autre manoeuvre clé est d'induire la miction avant l'induction de l'anesthésie par gommante souris et en appuyant doucement la partie inférieure Abdomfr. Deux à 2,5% d'isoflurane est une dose d'induction sûre pour les 8-12 semaines vieilles souris CBA féminine, suivie par l'anesthésie de maintenance avec 1,8 à 2% d'isoflurane.
- Une fois l'anesthésie est réalisée, les souris sont placées en position couchée avec leur tête inséré dans une coiffe connecté à l'isoflurane contenant de l'oxygène. Le bas-ventre est massé pour évacuer l'urine de la vessie. Si la vessie est relativement vide, cette manoeuvre peut ne pas donner l'urine. Le bas de l'abdomen et du périnée est imbibé d'éthanol à 70%.
- Une seringue de 1 cc stérile sans aiguille est utilisée pour établir l'inoculum désiré bactérienne. Ensuite, un cathéter stérile urétrale est aseptiquement placés sur la seringue. L'excès de tube est coupé le cathéter avec une paire de ciseaux de telle sorte que seulement 1-2 millimètres de tubes restent en aval de la pointe de l'aiguille. Ensuite, la seringue est taraudé et le piston enfoncé avec la seringue verticale pour enlever toutes les bulles. Une cuillerée de gelée de lubrification bactériostatique est aspergé sur une boîte de Pétri stérile ou à l'intérieur de l'enveloppe seringue stérile. L'extrémité du cathéter (avec une seringue jointe) est plongé dans la gelée. Si plusieurs souches bactériennes sont actuellement testés dans la même expérience, faites attention à ne pas utiliser la même goutte de gelée pour lubrifier les cathéters contenant des souches différentes.
- En utilisant un microscope stéréo (0,8 x au zoom 5x) pour l'agrandissement, le capuchon du clitoris de la souris anesthésiée est doucement saisi dans la main non dominante avec une paire de pinces à dents fines et soulevé céphalique pour exposer le rose profond méat urétral ( Figure 1). La seringue (avec cathéter attaché) est saisi dans la main dominante avec un grip crayon et l'extrémité du cathéter est engagé dans le méat urétral à un angle de 45 degrés. Le capuchon du clitoris est tendu dans l'axe de la seringue, de manière efficace "chargement" de l'urètre sur le cathéter. Cette manœuvre est essentielle puisque l'urètre de la souris est redondante. Le cathéter doit glisser facilement dans la vessie (jusqu'à la plate-forme, la figure 2), et peut être doucement tournoyé pour aider à naviguer dans les plis redondants de l'urètre. Une fois le cathéter S'articulant, la seringue peut être abaissé jusqu'à ce qu'il soit parallèle à l'axe longitudinal de la souris. La main non dominante peut descendre la pince pour aider à stabiliser la position du cathéter et la seringue que la main dominante est utilisée pour injecter lentement l'inoculum (au moins 5 secondes). Si le fluide est considéré coule autour du cathéter pendant l'injection, soit la vessie est pleine ou le cathéter est dans le vagin (juste caudale de l'urètre). L'injection doit être immédiatement arrêté et la position du cathéter soigneusement examinée. Si le cathéter a été dans l'urètre, la souris étant donné devraient pas être inclus dans l'expérience. D'autre part, un cathéter égaré dans le vagin peuvent être repositionnées et l'injection ré-essayé. Après l'injection, le cathéter et la seringue est lentement retiré de la souris.
- Pour réduire la probabilité du début de la miction post-inoculation, ce qui peut évacuer les bactéries administrés et ainsi conduire à des niveaux d'infection variable, certains chercheurs maintiennent souris sous anesthésie pendant 30 minutes après inoculation10 transurétrale. Après la chirurgie, les souris doivent récupérer sur une couverture chauffante nettoyer avec une observation continue pour confirmer le retour des modèles de respiration et d'activité normale. Une fois que les animaux ont complètement récupéré la capacité de ramper, ils peuvent être retournés à la literie contenant des cages.
III. UFC mesure dans les tissus infectés
- Diverses publications de souris UTI ont rapporté les résultats de culture de 6 heures à une semaine ou plus après l'inoculation. Les points de temps optimal doivent être déterminées empiriquement pour chaque combinaison de souche / souris bactérienne. Urine émise est obtenue pour la culture en gommante souris sur une boîte de Pétri stérile. Urines collectées doivent être conservés sur la glace en tout temps. De multiples tentatives pour obtenir l'urine annulés pendant plusieurs heures peut être nécessaire, puisque la souris est mictions fréquentes, de faible volume (30-100 microlitres par void), et le stress-dépendante.
- Après l'obtention d'échantillons d'urine annulée, nous sacrifions les souris par dislocation cervicale et de l'isoflurane. L'abdomen est ouvert de façon aseptique. Si un échantillon d'urine a été annulée pas réussi à obtenir plus tôt, une petite quantité d'urine peut souvent être aspiré à travers la paroi de la vessie à l'aide d'une aiguille de calibre 30 et une seringue.
- Un ou deux reins sont retirés, émincées dans au moins 4 pièces (chaque pièce doit être inférieure à 50 microgrammes) sur une boîte de Pétri stérile, et placés dans le zirconium billes / PBS contenant cryotubes sur la glace. La vessie est enlevée, hachée en au moins quatre morceaux, et placés dans des billes d'acier inoxydable / PBS contenant cryotubes sur la glace. Le tissu / perle / PBS contenant cryotubes sont placés dans un homogénéisateur Bullet Blender et les tissus sont homogénéisés à l'aide du "8" réglage de la vitesse pendant une minute. Il est fréquent que certains fragments de tissus de rester après homogénéisation. Aussi longtemps que 50-100 microlitres d'homogénat liquide peut être pipeté, fragments solidesne sont pas nécessairement un problème. Si le temps d'homogénéisation est augmenté pour certains échantillons, il est essentiel de le faire pour tous les tissus afin de maintenir la cohérence de l'homogénéisation. Nous utilisons un Bullet Blender homogénéisateur car il évite la possibilité de contamination croisée, est plus rapide que le traitement des échantillons individuels, un par un en utilisant un homogénéisateur standard, et ne modifie pas significativement la chaleur les échantillons étant homogénéisé.
- Au moins deux ou trois à dix dilutions d'urine recueillis et homogénats de tissus devrait être réalisé dans une plaque de microtitration. Pour les expériences préliminaires, il peut être prudent de faire au moins sept à dix dilutions. Culture jusqu'à 100 microlitres d'urine, la vessie et / ou des homogénats de rein sur gélose appropriée. Depuis les échantillons d'urine peuvent être à volume limité, il peut être nécessaire d'apporter leurs volumes à 100 microlitres avant d'effectuer dix dilutions. Si cela est nécessaire, la dilution initiale (avant dix-dilution) devront être pris en compte dans les calculs définitifs des rendements bactérienne. Nous préférons UPEC culture sur l'éosine-bleu de méthylène ou gélose de MacConkey (une nuit d'incubation à 37 ° C), car ces médias sont sélectifs pour les germes à Gram négatif. UPEC souches poussent sur gélose de MacConkey que centralement ombiliquées, rouge-rose colonies en raison de leur capacité à fermenter le lactose.
- Après une nuit de culture, compter le ufc pour chaque plaque. Pour les échantillons dilués en série, la dilution plaque contenant 50-100 colonies est considéré comme le résultat le plus précis. "Retour" calculer ufc par les tissus, par milligramme de tissu, ou par ml.
IV. Les résultats représentatifs
Figure 1. Méat urétral (sombre tissu rose) exposées par la levée capuchon du clitoris céphalique avec une pince (au-delà haut de la photo)
Figure 2. Cathétérisés urètre. Le clitoris bifide peut être vu juste au-dessus du cathéter.
Vessie Figure 3. Ufc compte 2 jours après l'infection transurétrale de 8 semaines vieilles femelles souris CBA / J avec uropathogènes E. coli. Vessies ont été homogénéisés et ufc / ml déterminée par dilution et étalement sur gélose MacConkey série. Diamants indiquent ufc / ml pour chaque souris, la barre horizontale indique médiane ufc / ml.
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Discussion
L'induction d'infection des voies urinaires de la souris par inoculation transurétrale de bactéries est une procédure établie de longue date, mais techniquement exigeante 11. Hung et Hultgren récemment publié une excellente analyse des techniques d'infection des voies transurétrale de souris urinaires 13. Dans ce papier, nous tentons d'illustrer davantage les subtilités de cette approche expérimentale.
Les novices peuvent pratiquer leur technique en réalisant une laparotomie médiane pour exposer la vessie, l'injection d'une solution diluée d'encre de Chine (1% dans PBS), et en observant pour la coloration bleue de la vessie. Nous avons constaté que la vessie est pleine est l'un des problèmes les plus difficiles à traiter pendant l'injection de la souris de l'urètre, et il vaut mieux prévenir par la privation d'eau et les stratégies de pré-anesthésie annulation décrites ci-dessus. Dans nos mains, <10% des souris présentent de trop-plein d'urine pendant l'injection urétrale. Une autre pierre d'achoppement potentielle est cathétérisme traumatique, qui peut conduire à une perforation de l'urètre, des doses d'inoculum incorrecte de la vessie, et même la mort des animaux. Technique douce et de la patience sont les clés pendant un cathétérisme; cathétérisme succès ne devrait jamais exiger forçant le cathéter dans la vessie.
Enfin, certains laboratoires ne souhaitent pas utiliser une puce Blender homogénéisateur ou d'autres «moyen débit» homogénéisateur, soit en raison d'un nombre d'échantillons est faible ou les considérations de coût. Une solution intermédiaire est d'utiliser un homogénéisateur standard et nettoyer l'appareil entre chaque échantillon. La solution la plus économique est l'utilisation du verre meuleuses, que nous avons utilisé avec succès avant de passer à la Bullet Blender homogénéisateur. Indépendamment de la méthode d'homogénéisation des tissus utilisés, méticuleux, d'asepsie, et cohérents sont essentiels pour obtenir des résultats reproductibles.
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Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Les auteurs tiennent à remercier Shelly Xie et Jennifer Payne pour leur assistance technique d'experts. Ce travail a été rendu possible grâce à des subventions de la Société d'urologie pédiatrique et le Fonds de recherche de Stanford en pédiatrie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cryovial tubes, 2.0 ml polypropylene (no caps) | E&K Scientific | 640201 | |
| Caps for cryovial tubes, with ’O’ ring | E&K Scientific | 440011-N | |
| Bullet Blender | Next Advance | BBX24 | |
| Zirconium Oxide Beads (0.5mm) | Next Advance | ZROB05 | |
| Stainless Steel Beads (1.6mm) | Next Advance | SSB16 | |
| Stainless Steel Bead Blend (0.9-2.0mm) | Next Advance | SSB14B | |
| CBA/J Mice, 8-12 week old female | Jackson Laboratory | 000656 | |
| Phosphate Buffered Saline (NaCl 137mM, KCl 2.7mM, Na2HPO4 4.3mM, KH2PO4 1.4mM) | EMD Millipore | EM-SX0420-13 (NaCl) EM-PX1405-1 (KCl) EM1.06585.0 (Na2HPO4) EM-5108-1 (KH2PO4) | |
| LB agar | |||
| LB broth | EMD Millipore | 1.10285.0500 | |
| Isoflurane (Aerrane) | Baxter Internationl Inc. | NDC 10019-773-60 | |
| Inoculating loops | Fisher Scientific | 22-363-601 | |
| Eosin-methylene blue (EMB) agar powder | Himedia Laboratories | MM022-500G | |
| MacConkey agar powder | Difco Laboratories | 212123 | |
| LB agar powder | Difco Laboratories | 244520 | |
| Intramedic non-radiopaque polyethylene tubing, PE10 [inner dimension 0.28 mm (0.011 inch); outer dimension 0.61 mm (0.024 inch)] | BD Biosciences | 427401 | |
| 30 gauge needles, 1/2 inch | BD Biosciences | 305106 | |
| 1 ml tuberculin Slip-Tip syringe | BD Biosciences | 309602 | |
| 3 ml Luer-Lock syringe | BD Biosciences | 309585 |
References
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