체외에서 신경 크레스트 줄기 세포 (NCSC)을 육성하기 위해 특수 매체 (NCSCM)가 필요합니다. NCSCM의 필수적인 부분은 여자의 배아 추출물 (시)입니다. 우리는 여기서 고립, 물에 담가서 부드럽게 함, 원심 분리 및 여과 공정과 같은 세부 사항을 포함하여 순수하고 고품질시의 최대 금액을 생산하는 정확한 방법을 설명합니다.
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방법 논문
Murine 신경 크레스트 줄기 세포의 배양 칙의 배아 추출 생산
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
신경 능선은 embryogenesis 동안 신경 ectoderm에서 발생에만 일시적으로 지속. 초기 실험은 이미 신경 문장 하나의 불가분의 일부로 pluripotent 전구 세포를 침대. Phenotypically, 신경 크레스트 줄기 세포 (NCSC)는 동시에 신경 문장 2,3,4,5으로부터 마이 그 레이션하는 동안 p75 (낮은 affine 신경 성장 인자 수용체, LNGFR)와 SOX10 표현에 의해 정의됩니다. 이러한 전구 세포는 평활근 세포, chromaffin 세포, 뉴런과 glial 세포뿐만 아니라, melanocytes, 연골과 뼈 6,7,8,9로 구별하실 수 있습니다. 시험 관내, 특별한 신경 크레스트 줄기 세포 매체 (NCSCM)에 NCSC를 육성하기 위해서는 10 필요합니다. NCSCM의 가장 복잡한 부분은 NCSC뿐만 아니라 신경 explants 다른 유형의 성장 요인의 필수 소스를 대표하는 여자는 배아 추출물 (시)의 준비입니다. 시 옆에 다른 NCSCM 재료는 상업적으로 사용할 수 있습니다. 그것은 고립, 물에 담가서 부드럽게 함, 원심 분리 및 여과 공정으로 도전하는 세부 사항에 대해 알고 높은 중요 CCE 사용하여 실험실 표준 장비를 생산. 이 프로토콜에서는 순수하고 고품질시의 최대 금액을 생산하는 정확한 방법을 설명합니다.
프로토콜
동물 실험 기관에 의해 규정된 동물 실험 절차와 규정에 대한 동물의 보호 및 사용에 관한 NIH의 지침에 따라, 유럽 커뮤니티 이사회 지침 (86/609/EEC)에 따라 수행다고 저자 상태 관리 및 뒤스부르크 - 에센 대학 (독일)에서위원회 (IACUC)를 사용합니다.
1 부 : (비디오에 표시되지 않음) 설정
(인큐베이터 밖으로 알을 복용하기 전에) 자료 및 솔루션 준비
- 계란은 37 11일위한 humidified 인큐베이터에 incubated해야 ° C (100 ° F).
- 70 % 에탄올 스프레이, 깨끗한 접시, 정밀 청소 집게, 4 ° C (40 ° F) 추운 살균 얼음 DMEM 60 ML 무균 주사기
- 50 ML 무균 코닝 튜브 ° C 감기 DMEM가 1시 1분의 비율 (DMEM 분해 질량)에서 분해 배아를 섞어 4 반 가득해야합니다. 즉시 계란이 여자는 태아의 인큐베이터의 해부 밖으로 가져옵니다 같은 것은 시작되어야한다.
- 압력솥이나 해부 당일 해부 도구를 소독, 20 분 70 %의 에탄올에있는 도구를 잠그다.
2 부 : 칙 태아의 해부 (비디오에서 보여....
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토론
이 프로토콜은 과거 10,11에서 설명했습니다 절차의 변경에 따라 달라집니다. 전 출판물 이외에도 우리는 여기 개별 서로 다른 프로세스의 단계 더 확장을 보여줍니다. 이것은 올바른 절차와 신뢰할 수있는 결과를 확보 중요한 세부 실험자을 지원합니다. 해부 과정시 추출의 필수적인 부분이므로 나아가, 우리는 모든 세부 사항에 노른자의 자루의 배아를 복용의 절차를 설명합니다. 아래의 논의로 참고하기 위해 몇 가지 중요한 포인트가 있습니다.
부화가 끝난 후 여자는 태아의 해부는 가능한 빨리 시작되어야합니다. 이전 해부 죽은되고 태아도 부정적인 결과에 영향을 미칠 수 효소 활성화 및 단백질 저하로이 프로토콜의 모든 단계를 사용하지 않아야합니다.
시작하기 전에 몇 가지 수작업에 대한 교육 신속하고 정확하게 실시해야 해부 프로세스의 모든 단계로 수행되어야합니다.을 그것은 부정적인 간섭 단백질의 주목할만한 양의 동행했다 .......
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공개 사항
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
감사의 글
마커스 Pajtler과 로버트 Bohrer의 지원과 조언이 프로토콜의 시각화를위한 귀중한되었습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 11일간 배양한 닭 달걀 | Sorries-Trockels Vermehrungszucht GmbH | ||
| 알코올 소독 스프레이 | Schülke Mayr GmbH | ||
| DMEMGlutamax | GIBCO, by Life Technologies | ||
| 멸균 주사기 (60 ml) | BD Biosciences | ||
| 멸균 튜브 (50; 15 ml) | Greiner Bio-One | ||
| 멸균 피펫 팁 | Starlab GmbH | ||
| Hyaluronidase typeIV-S | Sigma-Aldrich | ||
| Milipore stericups 멸균 필터 (0.45; 0.22 μl) | Fisher Scientific | ||
| 멸균 피펫 (25; 10; 5 ml) | Greiner Bio-One | ||
| 원심분리기 L5-50 | 로터 유형 Ti-45 |
참고문헌
- Bronner-Fraser, M., Fraser, S. E. Cell lineage analysis reveals multipotency of some avian neural crest cells. Nature. 335, 161-164 (1988).
- Stemple, D. L., Anderson, D. J. Isolation of a stem cell for neurons and glia from the mammalian neural crest. Cell. 7....
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재인쇄 및 허가
