Summary
इस प्रोटोकॉल के लिए एक कृत्रिम tRNA सब्सट्रेट की तैयारी का वर्णन
Abstract
प्रोटोजोआ परजीवी amebiasis, जो एक परजीवी रोग से तीन सबसे आम मृत्यु के कारणों की है सहित रोगों की एक किस्म के लिए जिम्मेदार इंसानों की सबसे विनाशकारी संक्रामक एजेंटों के बीच हैं. amebiasis के एजेंट अमीबा परजीवी एटामोइबा हिस्टोलिटिका कि दो चरणों के तहत मौजूद है: संक्रामक पुटी भोजन या पानी आंत में और आक्रामक trophozoite रहने वाले में पाया . स्पर्शोन्मुख जा रहा से बृहदांत्रशोथ, पेचिश, या जिगर फोड़े amebiasis रेंज के नैदानिक अभिव्यक्तियाँ ई. . हिस्टोलिटिका 5 मिथाइलसिटोसाइन (5mC) के साथ अपने जीनोम में एक दुर्लभ कोशिकीय परजीवी के 1, 2. इसमें एक मिथाइल डीएनए, Ehmeth, कि Dnmt2 परिवार के लिए है. 2 Dnmt2 के लिए दोहराए तत्वों के नियंत्रण में एक भूमिका है ई. में स्थापित किया गया हिस्टोलिटिका, 3 Dictyostelium discoideum 4,5 और ड्रोसोफिला. 6 हमारी हाल ही में काम दिखाया गया है कि Ehmeth methylates tRNA Asp, और इस खोज इंगित करता है कि यह एंजाइम एक दोहरी / डीएनए tRNA Asp मिथाइल गतिविधि है. 7 इस अवलोकन दोहरी गतिविधि के साथ समझौते में है कि डी. के लिए सूचित किया गया है discoideum और डी. मेलानोगास्टर. 8 की विशिष्टता Dnmt2 एंजाइमों डीएनए / tRNA के कार्यात्मक महत्व अभी भी अज्ञात है है . इस सवाल का पता करने के लिए, विधि Dnmt2 प्रोटीन tRNA मिथाइल गतिविधि निर्धारित स्थापित किया गया था. इस वीडियो में, हम एक सरल Dnmt2 के लिए एक पर्याप्त tRNA सब्सट्रेट तैयार दृष्टिकोण और अपने tRNA मिथाइल गतिविधि को मापने की विधि का वर्णन.
Protocol
प्रयोग की शुरुआत से पहले शर्त:
- RNase मुक्त पानी प्रयोगशाला में शाही सेना के निपटने में प्रयोग किया जाता है आरएनए RNases द्वारा अपमानित होने के जोखिम को कम. इस प्रयोजन के लिए, पानी आम तौर पर कम से कम 1 घंटे के लिए 0.1% v / v diethylpyrocarbonate (DEPC) के साथ 37 पर इलाज डिग्री सेल्सियस और फिर (कम से कम 15 मिनट) autoclaved DEPC के निशान की निष्क्रिय कर सकते हैं.
- Pipetman pipettes उपयोग से पहले एक RNase परिशोधन समाधान (RNase तबाह करनेवाला, जैविक उद्योग बीट Haemek) के साथ साफ कर रहे हैं.
- Eppendorf ट्यूबों और सुझावों DNase और RNase के मुक्त नमूना अखंडता बनाए रखने प्रमाणित होना चाहिए.
1. tRNA Asp तैयारी
यह प्रक्रिया इन विट्रो प्रतिलेखन चलाने के बंद जो किसी भी tRNA के संश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है में एक का वर्णन करता है . यह प्रक्रिया ribozyme पहले प्रकाशित विधि का एक रूपांतर है इस उद्देश्य के एक टेम्पलेट T7 प्रमोटर और एक आत्म cleaving हथौड़ा का सिरा ribozyme और आवश्यक tRNA के पूरक दृश्यों के मिलकर तैयार किया गया था 9. एक उत्पाद में इस टेम्पलेट परिणामों के ट्रांसक्रिप्शन ही एक तरह से 5 `अंत है कि पूर्ण लंबाई tRNA के साथ प्राप्त की है पर cleaving एक 5`-OH बजाय एक phosphorylated 5 `अंत. पूर्ण लंबाई tRNA यूरिया - PAGE द्वारा cleaved हथौड़ा का सिरा ribozyme और uncleaved उत्पादों से शुद्ध किया जा सकता है है.
- पीसीआर प्राइमर और टेम्पलेट डिज़ाइन:
T7 शाही सेना पोलीमरेज़ इन विट्रो प्रतिलेखन में मध्यस्थता के लिए आदेश में एक कुशल टेम्पलेट प्राप्त करने के लिए तीन आवश्यकताओं को पूरा होना है .- T7 प्रमोटर अनुक्रम (5 `` - TAATACGACTCACTATA 3) टेम्पलेट में फंसा हो गया है.
- प्रतिलेखन दक्षता बढ़ाने के लिए, लिखित शाही सेना के पहले तीन nucleotides ग्वानोसिन होना चाहिए.
- विशिष्ट tRNA सही पूरक अनुक्रम की जरूरत है.
- पीसीआर
टेम्पलेट डीएनए का प्रवर्धन के लिए, हम 50 μL के अंतिम मात्रा में एक मानक पीसीआर प्रतिक्रिया इस्तेमाल किया. तालिका 1 अंतिम सांद्रता (बर्फ पर तैयार प्रतिक्रिया) और पीसीआर के लिए कार्यक्रम का विवरण. कम annealing प्रारंभिक केवल आगे प्राइमर के आंशिक डीएनए टेम्पलेट के लिए बाध्य के लिए 10 चक्र खातों के दौरान इस्तेमाल तापमान. Unspecific कम annealing तापमान बंधन 25 प्रवर्धन चक्र के लिए आगे बढ़ा दिया गया था.
टेम्पलेट प्रवर्धन की सफलता के एक 1.3% agarose जेल 1X GelRed समाधान (चित्रा 2) के साथ prestained द्वारा परीक्षण किया गया था. - प्रतिलिपि
- T7 premix तैयार किया जा सकता 5X केंद्रित (200 मिमी Tris - एचसीएल, 8.1 पीएच, 30 मिमी 2 MgCl, 1 मिमी Spermidine, 5 मिमी डीटीटी, 2 μg / एमएल BSA और 0.01% X-100 ट्राइटन) और कम से कम एक के लिए इस्तेमाल किया गया था सप्ताह या पांच फ्रीज पिघलना चक्र.
- प्रतिलेखन मिश्रण करने के लिए कमरे के तापमान पर तैयार हो गया है.
- ट्रांसक्रिप्शन प्रतिक्रियाओं 80 μL T7 premix, 80 μL पीसीआर उत्पाद, 80 μL एनटीपी मिश्रण (25 मिमी) का उपयोग कर तैयार किए गए और MilliQ पानी के साथ 385 μL करने के लिए समायोजित. 15 (1.34 मिलीग्राम / एमएल) μL T7 शाही सेना पोलीमरेज़ (अंतिम .05 μg / μL एकाग्रता) की प्रतिक्रिया शुरू करने के लिए जोड़ रहे हैं.
- प्रतिक्रिया 4 घंटे के लिए बाहर किया गया था पर 37 डिग्री सेल्सियस पाइरोफॉस्फेट के सफेद वेग सफल प्रतिलेखन इंगित करता है.
- शोधन
- पाइरोफॉस्फेट 1 मिनट के लिए नीचे 10,000 rpm पर काता था.
- Supernatants एक मात्रा formamid डाई लोड हो रहा है और एक 12% यूरिया पृष्ठ पर शुद्ध का उपयोग कर के साथ आपूर्ति की गई2 घंटे के लिए 20 डब्ल्यू. जेल उतरना और यह सरन लपेटो पर जगह.
- 3XGelRed 20 मिनट के लिए 0.1 एम NaCl के साथ पूरक समाधान के साथ जेल दाग. यूवी उत्तेजना पर, लेबल बाद छांटना के लिए एक स्थायी मार्कर के साथ सरन लपेटो पर tRNA बैंड. वैकल्पिक रूप से, अगर उम्मीद की उपज 50 μg बैंड के ऊपर है यूवी ग्रहण द्वारा देखा जा सकता है है. यूवी ग्रहण के लिए, एक फ्लोरोसेंट क्रोमैटोग्राफी पतली परत प्लेट पर जेल जगह है और ऊपर से एक यूवी हाथ दीपक के साथ रोशन. लेबल बैंड, जो जेल में गैर फ्लोरोसेंट छाया (चित्रा 3) के बाद छांटना के लिए, के रूप में दिखाई देते हैं.
- tRNA बैंड एक स्केलपेल के साथ excised थे और 1.5 एमएल Eppendorf कप में डाल दिया.
- 0.5m एनएच 4 OAC नमूने के 450 μL के अलावा के बाद -80 पर जमे हुए हैं सी 2 घंटे के लिए और बाद में 20 में incubated डिग्री सेल्सियस, रात से अधिक 550 rpm के एक Eppendorf Thermoshaker पर के साथ मिलाते हुए . 6. चरण 5 से सतह पर तैरनेवाला एनएच 4 OAC समाधान Nanosep ट्यूबों (0.45 सुक्ष्ममापी) के साथ फ़िल्टर्ड रहे हैं, 8500 के लिए पृष्ठ मलबा हटाने rpm पर 90 सेकंड के लिए कताई.
- Eluted tRNAs की वर्षा -80 के 2.5 मात्रा डिग्री सेल्सियस शुद्ध (देहात) -20 में, इथेनॉल का भंडारण ° सी रातोंरात और 2.5 4 घंटे centrifugation डिग्री सेल्सियस और १५५०० rpm. जोड़ने के द्वारा किया गया था
- हटाने के बाद सतह पर तैरनेवाला छर्रों SpeedVac में सूख गया और MilliQ पानी में resuspended.
- सांद्रता Nanodrop - ND1000 का उपयोग कर निर्धारित किया गया है. एक 400 μL प्रतिलेखन की उपज 80-100 बारे μg था.
समस्या निवारण:
- कोई पीसीआर उत्पाद. → प्राइमरों और संगत प्रपत्र टेम्पलेट के अनुक्रम और प्रतिक्रिया मिश्रण के अंदर सभी घटक हैं?
- प्रतिलेखन उत्पाद. → पीसीआर असफल रहा हो सकता है. सही अनुक्रम T7 प्रमोटर. प्रतिक्रिया की तैयारी करते समय भी ठंडा समाधान. T7 बहुत पुराना Premix.
- जेल पर उत्पाद, लेकिन कोई eluted उत्पाद. → वर्षा के लिए इथेनॉल ठंड, नहीं पर्याप्त नहीं शुद्ध, सही मात्रा नहीं.
2. अभिव्यक्ति और पुनः संयोजक ई. के शोधन ई. हिस्टोलिटिका Dnmt2 प्रोटीन (Ehmeth) BL21 कोलाई
इस प्रोटोकॉल भी 10 मानव और ड्रोसोफिला से Dnmt2 प्रोटीन की तैयारी के लिए उपयुक्त है 11 .
- ई. हिस्टोलिटिका Ehmeth जीन पीसीआर द्वारा परिलक्षित किया गया था, pGEX 4NT1 (जीई लाइफ साइंसेज) में क्लोन और अनुक्रमण के साथ सत्यापित
- रीकॉम्बीनैंट प्लाज्मिड ई. में तब्दील किया गया था कोली (BL21) पुनः संयोजक प्रोटीन की अभिव्यक्ति के लिए .
- तब्दील बैक्टीरिया Luria - Bertani (पौंड) अगर एम्पीसिलीन मध्यम (100 μg / एमएल) पर चयन किया गया था. चार से पांच कालोनियों ऊपर उठाया गया था और लेग मीडिया के 5 एमएल में inoculated उपयुक्त चयनात्मक मार्कर के साथ (100 μg / एमएल एम्पीसिलीन) और एक कक्षीय प्रकार के बरतन में रात 37 में incubated डिग्री सेल्सियस
- रातोंरात बड़े हो संस्कृति 2X खमीर निकालें Tryptone मध्यम (2XYT) के 500 एमएल में 100 μg / एमएल एम्पीसिलीन के साथ inoculated किया गया था, और 37 में एक कक्षीय प्रकार के बरतन में incubated डिग्री सेल्सियस 600 आयुध डिपो की संस्कृति तक 0.8 पर पहुंच गया.
- Dnmt2 पुनः संयोजक प्रोटीन की अभिव्यक्ति 0.5 मिमी की एक अंतिम एकाग्रता पर isopropyl बीटा डी thiogalactopyranoside (IPTG) संस्कृति को जोड़ने के द्वारा प्रेरित किया गया था. संस्कृति और 16 घंटे के लिए एक कक्षीय प्रकार के बरतन में 24 डिग्री सेल्सियस पर incubated ऊष्मायन के समय तापमान शामिल किए जाने निकायों के गठन से बचने के अनुकूलित किया गया है.
- संस्कृति 4 पर centrifuged किया गया था डिग्री सेल्सियस, 200 एमएल Nalgene ट्यूबों में 6000, 15 मिनट के लिए rpm. सतह पर तैरनेवाला खारिज कर दिया था और गोली -70 ° सी में कम से कम 1 घंटे के लिए जमे हुए किया गया था. यह ठंड कदम बैक्टीरिया के lysis में सुधार.
- गोली lysis बफर (100 मिमी KCl, 1mm डीटीटी, 1mm PMSF, 100 μg / एमएल Lysozyme और 100 Leupeptine फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) में μg / एमएल) के 30 एमएल में काटा गया था. इस बिंदु से, यह बर्फ पर lysate रखने के लिए पुनः संयोजक प्रोटीन की निष्क्रियता को रोकने के लिए महत्वपूर्ण था. lysate कोई सेटिंग पर बर्फ के पानी में स्नान sonicated था. 4 के एक MSE (लंदन, यूनाइटेड किंगडम) sonifier (शक्ति उच्च, 5 आयाम, 30 सेकंड पल्स, 5 मिनट के लिए 30 सेकंड बाकी). बैक्टीरियल डीएनए कि Ehmeth करने के लिए संलग्न किया जा सकता है Benzonase Nuclease (Novagen) (5 यू / sonicated lysate की एमएल) बर्फ पर 30 मिनट के लिए उपचार, के साथ हटा दिया गया था. lysis BugBuster प्रोटीन निष्कर्षण अभिकर्मक (Novagen) के 300 μL पर 30 मिनट के लिए इसके अलावा के द्वारा पूरा किया गया था 4 डिग्री सेल्सियस एक कक्षीय हिलनेवाला (100 आरपीएम) पर कोमल आंदोलन के साथ है.
- पुनः संयोजक प्रोटीन जीएसटी - Ehmeth राल glutathione - agarose पर देशी शर्तों के तहत विनिर्माण निर्देश (सिग्मा) के अनुसार शुद्ध किया गया था. Lysate के 25 एमएल के लिए, गारा राल मोतियों की 500 μL जोडी थे और 24 में incubated डिग्री सेल्सियस 1 घंटे के लिए.
- मोती lysis बफर (मोतियों की मात्रा प्रति lysis बफर के 10 संस्करणों) और ठंड पीबीएस के साथ 6 बार के साथ दो बार धोया गया. ये व्यापक धोने कदम बीमा है कि वहाँ कोई elutio पहले था Benzonase के रहनेपता कदम.
- पुनः संयोजक Ehmeth प्रोटीन glutathione agarose मोतियों से glutathione elution बफर के 5 एमएल (Tris एचसीएल 50 मिमी 8.0 पीएच, glutathione (सिग्मा) 10 मिमी) 12 घंटे के लिए 4 ° सी कोमल रोटेशन के साथ साथ मोती incubating द्वारा eluted था. मोती centrifugation (2000 rpm, 5 मिनट) के द्वारा हटा दिया गया है और सतह पर तैरनेवाला एकत्र किया गया था.
- सतह पर तैरनेवाला में elution बफर भंडारण बफर (KCl 200 मिमी, 10 मिमी EDTA, 0.1 मिमी डीटीटी, ग्लिसरॉल पीबीएस में 60%) द्वारा प्रतिस्थापित किया गया था. इस प्रयोजन के लिए, सतह पर तैरनेवाला 5 एमएल एक Millipore Microcon YM-30 सी. केन्द्रापसारक फिल्टर उपकरणों (30 केडीए के स्तंभ से कटौती) और centrifuged 4 में 8000 rpm पर 20 मिनट के लिए ° शीर्ष पर लोड किया गया था ध्यान केंद्रित प्रोटीन का भंडारण बफर (5 एमएल) में पतला था और फिल्टर डिवाइस पर पुनः लोड है. उसी प्रक्रिया में कम से कम 3 बार दोहराया जाना चाहिए भंडारण बफर द्वारा elution बफर की पूरी प्रतिस्थापन बीमा. अंत में केंद्रित प्रोटीन भंडारण बफर के लगभग 300 μL में पतला होना चाहिए.
- पुनः संयोजक प्रोटीन की एकाग्रता एक ब्रैडफोर्ड प्रोटीन परख द्वारा मापा गया था. रीकॉम्बीनैंट एंजाइम तैयारी -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया गया था एंजाइम की अंतिम एकाग्रता 3 / मेथिलिकरण परख के लिए एक उपयुक्त एकाग्रता के रूप में μg μL से कम नहीं होनी चाहिए.
- प्रोटीन तैयारी एसडीएस - PAGE द्वारा जाँच की थी.
सूचना: एक सक्रिय एंजाइम की तैयारी बीमा, सभी शुद्धि चरणों बर्फ पर किया जाना चाहिए और डीटीटी हौसले और तैयार किया जाना चाहिए भंडारण बफर करने के लिए जोड़ा. यह 6 महीने के लिए एक सक्रिय एंजाइम सुनिश्चित.
3. इन विट्रो tRNA मेथिलिकरण परख
समाधान और अभिकर्मकों कि तैयार किया जाना चाहिए:
- 1 tris aminomethane (hydroxymethyl) के एम समाधान. केंद्रित हाइड्रोक्लोरिक एसिड (एचसीएल) के साथ 8.0 के समाधान के पीएच को समायोजित करें.
- 5X मेथिलिकरण बफर (MB): 100 मिमी Tris 8.0 पीएच, 100mm राष्ट्रीय राजमार्ग OAC 4, 0.1 मिमी EDTA, 10 मिमी 2 MgCl. एमबी अग्रिम में तैयार किया जा सकता है है और dithiothreitol (डीटीटी) के बिना -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत.
- Unlabeled adenosylmethionine-एस (AdoMet) शेयर (अंतिम एकाग्रता 1.5 मिमी) आसुत जल के 101.67 एमएल के साथ 5 μL AdoMet (न्यू इंग्लैंड Biolabs, 32 मिमी एकाग्रता) के मिश्रण से तैयार करें.
- 5% Trichloroacetic एसिड समाधान (TCA)
- 100% इथेनॉल
- जगमगाहट नमूना शीशी तरल प्रति 3 एमएल.
परख:
- एक pipeting योजना (तालिका 2) एक 40 मेथिलिकरण परख की μL अंतिम मात्रा के लिए तैयार है.
- एक 1.5 एमएल Eppendorf ट्यूब में, tRNA DEPC इलाज पानी के साथ 5 सुक्ष्ममापी के अंतिम एकाग्रता (1μg tRNA 40 pmol के बराबर है) के लिए पतला किया गया था
- डीटीटी के 4 μL (स्टॉक समाधान की एकाग्रता) 5XMB समाधान के 8 μL जोड़ा गया.
- tRNA समाधान 85 incubated ° 2 मिनट और चरण 3 में तैयार समाधान के लिए सी तुरंत इसे करने के लिए जोड़ा गया था. मिश्रण 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर नीचे tRNA गुना सही ढंग से दो शांत करने के लिए अनुमति दी गई थी.
- AdoMet मिश्रण (अंतिम एकाग्रता सुक्ष्ममापी 200) unlabeled AdoMet के 150 सुक्ष्ममापी के साथ लेबल AdoMet के 50 सुक्ष्ममापी (250 μCi, 10.0 Ci / mmol, PerkinElmer) के मिश्रण से तैयार किया गया था. एक AdoMet 10 लेबलिंग प्रतिक्रियाओं के लिए उपयुक्त मिश्रण के लिए, हम 5.2 unlabeled AdoMet μL (पतला समाधान से), लेबल AdoMet के 29 μL और 5.8 आसुत पानी की μL मिश्रित.
- AdoMet ऊपर तैयार मिश्रण के 4 μL tRNA समाधान के लिए जोड़ा गया है और 37 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट के लिए incubated
- tRNA मिथाइल Ehmeth (1-10 सुक्ष्ममापी अंतिम एकाग्रता) tRNA सब्सट्रेट और लेबल - unlabeled AdoMet cofactor युक्त समाधान के लिए जोड़ा गया है. मिश्रण 3 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर incubated था ट्यूबों नियमित रूप से ऊष्मायन समय के दौरान धीरे उन्हें flipping द्वारा मिलाया गया. Enzymatic प्रतिक्रिया का एक गतिज वक्र हर 20 मिनट में तीन घंटे की अवधि में प्रतिक्रिया मिश्रण से एक नमूना (8 μL) लेने के द्वारा बनाया गया था.
- प्रत्येक नमूना तुरंत एक वाटमान फिल्टर (0.5 सेमी व्यास) के केंद्र पर देखा गया था और फिल्टर एक 5% TCA समाधान में भिगो गया था और 10 मिनट के लिए बर्फ पर उत्तेजित (छोड़कर AdoMet नमूना, तालिका स्तंभ 2 ई है कि नहीं होना चाहिए के लिए ) धोए. 5% TCA समाधान के साथ धोने कदम दो से अधिक बार दोहराया गया था
- फिल्टर 10 मिनट के लिए बर्फ पर 100% इथेनॉल के साथ धुल गया था.
- फिल्टर 20 मिनट की एक न्यूनतम के लिए हवा - सूखे.
- प्रत्येक सूखे फिल्टर (विनिर्देशन) ट्यूब है कि पहले जगमगाहट तरल के 3 एमएल (CytoScint) से भर गया था में रखा गया था
- tRNA में शामिल रेडियोधर्मिता जगमगाहट काउंटर (काउंटर बीटा 2100TR त्रिकोणीय Carb) का उपयोग कर रहा था.
4. समस्या निवारण
- स्तंभ में उच्च मानों के एक या बी (3 टेबल), नियंत्रण नमूना मान स्तंभ सी या डी में मेथिलिकरण रिएक्शन (3 टेबल) → फिल्टर ठीक से नहीं धोया गया से उम्मीद उन लोगों के लिए समान थे.
- स्तंभ सी या डी (3 टेबल) में कम मूल्यों, मेथिलिकरण प्रयोगों स्तंभ में नियंत्रण प्रतिक्रिया के लिए समान मूल्यों की थी एक या बी एंजाइम (तालिका 3) सही ढंग से तैयार नहीं था, जिसका अर्थ है कि वहाँ कोई Adomet समावेश था →. एक अन्य विकल्प है कि tRNA अपमानित किया गया था और एंजाइम के लिए एक उपयुक्त सब्सट्रेट नहीं था, इस tRNA नमूना यूरिया acrylamide जेल पर चल रहा है (1.2 देखें) और ethidium ब्रोमाइड के साथ जेल धुंधला tRNA की अखंडता की जांच के द्वारा जाँच की जा सकती .
- स्तंभ विकास में निम्न मानों (तालिका 3) → Ehmeth की गतिविधि के बाद से तो कमजोर है hDnmt2 एंजाइम प्रदर्शन भंडारण बफर में डीटीटी एकाग्रता में वृद्धि (1 के बीच 10 मिमी रेंज कर सकते हैं हैं) या करने के लिए एंजाइम एकाग्रता में वृद्धि करके सुधार किया जा सकता है एंजाइम की खराब गुणवत्ता ख़ामोश रहना.
- स्तंभ ई में निम्न मानों (तालिका 3) → इस स्तंभ लेबल AdoMet मूल्य (100% के रूप में निर्दिष्ट) के कुल रेडियोधर्मिता का प्रतिनिधित्व करता है, अगर इस स्तंभ में मूल्य कम है यह मतलब है कि AdoMet अब सक्रिय नहीं है और इसकी खो है रेडियोधर्मिता.
5. प्रतिनिधि परिणाम
| अभिकर्मक | अंतिम एकाग्रता | पीसीआर - कार्यक्रम | |||||
| Gentherm पीसीआर बफर | 1X | 1. | 90 ° C | 2 मिनट | |||
| 2 MgCl | 3.0 मिमी | ------------------------------ | ------------------------------ | ||||
| dNTP मिश्रण | 1.2 मिमी | 2. | 90 ° C | 30 एस | 5. | 90 ° C | 30 एस |
| टेम्पलेट डीएनए | 15.0 एनएम | 3. | 54 ° C | 30 एस | 6. | 60 डिग्री सेंटीग्रेड | 30 एस |
| फॉरवर्ड प्राइमर | 3.0 सुक्ष्ममापी | 4. | 72 ° C | 45 एस | 7. | 72 ° C | 45 एस |
| रिवर्स प्राइमर | 3.0 सुक्ष्ममापी | 2. 4. 10 चक्रों | 5.--7. 25 चक्रों | ||||
| Taq पोलीमरेज़ | 0.1 यू / μl | ------------------------------ | ------------------------------ | ||||
| एच 2 हे | 50 μl विज्ञापन | 95 ढक्कन डिग्री सेल्सियस | 8. | 72 ° C | 3 मिनट | ||
तालिका 1: पिपेट पीसीआर पीसीआर और कार्यक्रम के लिए योजना .
| एक नकारात्मक नियंत्रण (केवल Ehmeth) | बी नकारात्मक नियंत्रण (केवल tRNA) | सी मानव Dnmt2 के साथ सकारात्मक नियंत्रण | डी मानक रिएक्शन (Enz + Subst + COF) | ई फ़िल्टर पर AdoMet का कुल मूल्य | |
| tRNA | - | (3 μg) | (3 μg) | (3 μg) | - |
| hDnmt2 | - | (2.48 μg) | - | ||
| Ehmeth | (2.48 μg) | (2.48 μg) | |||
| एमबी | 8 | 8 | 8 | 8 | - |
| डीटीटी | 4 | 4 | 4 | 4 | - |
| AdoMet | 4 | 4 | 4 | 4 | 1 |
| DDW | - | ||||
| कुल | 40 μL | 40 μL | 40 μL | 40 μL | 1 μL |
तालिका 2: योजना pipeting का उदाहरण योजना में प्रत्येक स्तंभ का एक नमूना का प्रतिनिधित्व करता है .
* दोनों Ehmeth और hDnmt2 62 केडीए के एक अनुमान के अनुसार प्रोटीन के आकार के साथ एक टैग जीएसटी के लिए जुड़े हुए थे.
एक नकारात्मक नियंत्रण कि Ehmeth केवल शामिल हैं.
बी नकारात्मक नियंत्रण है कि tRNA केवल शामिल हैं.
सी सकारात्मक मानव Dnmt2 के साथ नियंत्रण. इस एंजाइम Ehmeth की तुलना में दस समय अधिक गतिविधि है
डी मानक प्रतिक्रिया है कि एंजाइम, सब्सट्रेट और cofactor शामिल
फिल्टर पर AdoMet की ई - कुल मूल्य. इस मूल्य का प्रतिशत मिथाइल समूह शामिल की गणना के लिए प्रयोग किया जाता है.
| एक नकारात्मक नियंत्रण (केवल Ehmeth) | बी नकारात्मक नियंत्रण (केवल tRNA) | सी मानव Dnmt2 के साथ सकारात्मक नियंत्रण | डी मानक रिएक्शन (Enz + Subst + COF) | ई फ़िल्टर पर AdoMet का कुल मूल्य | |
| सीपीएम | 200 | 300 | 6700 | 1284 | 51653 |
तालिका 3: जगमगाहट काउंटर द्वारा पढ़ा मूल्यों का उदाहरण इस योजना में प्रत्येक स्तंभ तालिका 1 से एक नमूना का प्रतिनिधित्व करता है.
चित्रा 1: (ए) T7 प्रतिलेखन टेम्पलेट और के लिए इन विट्रो प्रतिलेखन में प्राइमरों. सभी दृश्यों 5 ओरिएंटेशन '3' में लिखा जाता है. Colorcode: पाठ देख. (बी) प्रतिलेखन के दौरान उत्पाद के गठन की योजना है. शाही सेना प्रतिलेख T7 शाही सेना पोलीमरेज़ द्वारा संश्लेषित है. हथौड़ा ribozyme और उनके संबंधित 2D संरचनाओं और ribozyme में tRNA गुना ही उनके अंत 5'(9 से अनुकूलित) में हाइड्रॉक्सिल समूह छोड़ने tRNA के cleaves.
चित्रा 2: पीसीआर एक 1.3% agarose जेल 1X GelRed दो अलग टेम्पलेट्स पर पीसीआर प्रतिक्रियाओं के साथ prestained पर प्रतिक्रिया को नियंत्रित एक 100 basepairs प्लस सीढ़ी के बगल में दिखाए जाते हैं. नियंत्रण एक "केवल टेम्पलेट" लेन और प्रतिक्रियाओं जिसमें रिवर्स प्राइमर लोप किया गया था शामिल हैं.
चित्रा 3: यूवी ग्रहण दो प्रतिलेखन मिश्रण का एक पन्ना जुदाई दिखाया गया है. अग्रदूत टेप के बैंड (दरार से पहले), पूर्ण लंबाई tRNA और हथौड़ा का सिरा ribozyme छाया के रूप में दिखाई देने लगते हैं क्योंकि वे फ्लोरोसेंट टीएलसी थाली तक पहुँचने से पराबैंगनी प्रकाश को रोकने के. ई. से कुल tRNA कोलाई आकार मार्कर के रूप में प्रयोग किया जाता है.
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Discussion
इस प्रस्तुति में, हम सचित्र ई. के tRNA मिथाइल गतिविधि के उपाय के लिए सक्रिय घटकों को कैसे तैयार करने के लिए हिस्टोलिटिका Ehmeth एंजाइम. इस प्रक्रिया के एक प्रारंभिक बिंदु के रूप में सेवा और अन्य tRNA methyltransferases के उपाय के लिए आसानी से अनुकूलित कर सकते हैं. यह महत्वपूर्ण है प्रक्रियाओं है कि अखंडता और tRNA सब्सट्रेट और tRNA मिथाइल प्रोटीन की गुणवत्ता बनाए रखने के लिए enzymatic गतिविधि के एक इष्टतम उपाय बीमा का पालन करें.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
इस अध्ययन इसराइल विज्ञान फाउंडेशन और चिकित्सा विज्ञान में अनुसंधान के लिए Rappaport परिवार संस्थान, और ड्यूश Forschungsgemeinschaft (DFG) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Taq Polymerase (5 U/μl) | Rapidozym, Berlin | GEN-003-1000 | |
| 10X Gentherm PCR Buffer | Rapidozym, Berlin | With GEN-003-1000 | |
| MgCl2 (50 mM) | Rapidozym, Berlin | With GEN-003-1000 | |
| dNTP mix (10 mM) | Fermentas | R0191 | |
| Oligo nucleotides | IBA, Göttingen | Customized | |
| NTP mix (25mM) | Fermentas | R0481 | |
| GelRed Nucleic Acid Stain 3X in water | Biotium, Inc. | 41001 | |
| Dithiotreitol | Fermentas | R0861 | |
| Spermidine | Sigma-Aldrich | S0266 | |
| Pall Nanosep 0.45 μm | Sigma-Aldrich | Z722014 | |
| Dichlorodimethylsilane | Sigma-Aldrich | 40140 | |
| Ethanol (Ph. Eur.) | Carl Roth Gmbh | 5054.3 | |
| Tris HCl | Carl Roth Gmbh | 9090.3 | |
| Tris | Carl Roth Gmbh | AE15.1 | |
| BSA | Fermentas | B14 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| TEMED | Carl Roth Gmbh | 2367.1 | |
| Ammonium Peroxodisulfate | Carl Roth Gmbh | 9592.2 | |
| Rotiphorese Sequencing gel concentrate | Carl Roth Gmbh | 3043.1 | |
| Rotiphorese Sequencing gel diluent | Carl Roth Gmbh | 3047.1 | |
| Rotiphorese Sequencing gel buffer concentrate | Carl Roth Gmbh | 3050.1 | |
| Rotiphorese 10X TBE-buffer | Carl Roth Gmbh | 3061.2 | |
| DEPC | Sigma-Aldrich | D5758 | |
| RNAse ExTERMINATOR | Biological Industries | 01-895-1B | |
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | A0166 | |
| IPTG | Sigma-Aldrich | I6758 | |
| PMSF | Sigma-Aldrich | P7626 | |
| Lysozyme | Sigma-Aldrich | L7651 | |
| Leupeptine | Sigma-Aldrich | L2884 | |
| Benzonase Nuclease | Novagen, EMD Millipore | 70746-3 | |
| BugBuster protein extraction reagent | Novagen, EMD Millipore | 70921-3 | |
| Glutathione-agarose resin | Sigma-Aldrich | G4510 | |
| L-glutathione reduced | Sigma-Aldrich | G4251 | |
| AdoMet | New England Biolabs | B9003 | |
| AdoMet 3H | PerkinElmer, Inc. | NET155250UC | |
| Scintillation Cocktail | CytoScint | 882453 |
References
- Banerjee, S., Fisher, O., Lohia, A., Ankri, S. Entamoeba histolytica DNA methyltransferase (Ehmeth) is a nuclear matrix protein that binds EhMRS2, a DNA that includes a scaffold/matrix attachment region (S/MAR). Mol Biochem Parasitol. 139, 91-97 (2005).
- Fisher, O., Siman-Tov, R., Ankri, S. Characterization of cytosine methylated regions and 5-cytosine DNA methyltransferase (Ehmeth) in the protozoan parasite Entamoeba histolytica. Nucleic Acids Res. 32, 287-297 (2004).
- Harony, H., Bernes, S., Siman-Tov, R., Ankri, S. DNA methylation and targeting of LINE retrotransposons in Entamoeba histolytica and Entamoeba invadens. Mol Biochem Parasitol. 147, 55-63 (2006).
- Kuhlmann, M. Silencing of retrotransposons in Dictyostelium by DNA methylation and RNAi. Nucleic Acids Res. 33, 6405-6417 (2005).
- Katoh, M. Developmentally regulated DNA methylation in Dictyostelium discoideum. Eukaryot Cell. 5, 18-25 (2006).
- Phalke, S. Retrotransposon silencing and telomere integrity in somatic cells of Drosophila depends on the cytosine-5 methyltransferase DNMT2. Nat Genet. 41, 696-702 (2009).
- Tovy, A., Siman Tov, R., Gaentzsch, R., Helm, M., Ankri, S. A new nuclear function of the Entamoeba histolytica glycolytic enzyme enolase: the metabolic regulation of cytosine-5 methyltransferase 2 (Dnmt2) activity. PLoS Pathog. 6, e1000775-e1000775 (2010).
- Jeltsch, A., Nellen, W., Lyko, F. Two substrates are better than one: dual specificities for Dnmt2 methyltransferases. Trends Biochem Sci. 31, 306-308 (2006).
- Fechter, P., Rudinger, J., Giege, R., Theobald-Dietrich, A. Ribozyme processed tRNA transcripts with unfriendly internal promoter for T7 RNA polymerase: production and activity. FEBS Lett. 436, 99-103 (1998).
- Hermann, A., Schmitt, S., Jeltsch, A. The human Dnmt2 has residual DNA-(Cytosine-C5)-methyltransferase activity. J Biol Chem. 278, 31717-31721 (2003).
- Narsa Reddy, M., Tang, L. Y., Lee, T. L., &, T. L., James Shen, C. K. A candidate gene for Drosophila genome methylation. Oncogene. 22, 6301-6303 (2003).
