Summary
Trichuris infezione Muris è un modello di immunità intestinale Th2 dove topi resistenti generare una risposta protettiva Th2 e topi suscettibili generare una patologica risposta Th1.
Abstract
Trichuris Muris è un patogeno naturale di topi ed è biologicamente e antigenicamente simili alle specie di Trichuris che infettano gli esseri umani e animali 1. Uova infette sono dati mediante sonda gastrica, schiudono nel piccolo intestino distale, invadono le cellule epiteliali intestinali (IXC) che la linea di cripte del cieco e del colon prossimale e alla maturazione dei worm rilasciare le uova nell'ambiente 1. Questo modello è uno strumento potente per esaminare i fattori che controllo CD4 + T helper (Th) l'attivazione delle cellule così come i cambiamenti a livello dell'epitelio intestinale. La risposta immunitaria che si verifica in ceppi inbred, come C57BL / 6 e BALB / c, è caratterizzato da citochine Th2 polarizzata (IL-4, IL-5 e IL-13) e l'espulsione di vermi, mentre associata citochine Th1 (IL -12, IL-18, IFN-γ) promuovere le infezioni croniche in AKR geneticamente suscettibili / topi J 2-6. Citochine Th2 promuovere cambiamenti fisiologici nel microambiente intestinale compreso rapido turnover di IXC, la differenziazione delle cellule caliciformi, di reclutamento e cambiamenti della permeabilità epiteliale e la contrazione della muscolatura liscia, che sono stati implicati in espulsione verme 7-15. Qui dettaglio un protocollo per la propagazione Trichuris uova Muris, che possono essere utilizzati in esperimenti successivi. Forniamo anche un raccolto sperimentale campione con suggerimenti per l'analisi post-infezione. Nel complesso, questo protocollo fornirà ai ricercatori gli strumenti di base per eseguire un mouse Trichuris Muris modello di infezione che può essere utilizzata per affrontare questioni relative alla propensione Th nel tratto gastrointestinale e immunitario funzioni effettrici delle IXC.
Protocol
1. Moltiplicazione Trichuris uova Muris
- Per generare nuovi lotti di uova di Trichuris Muris, infettare 20-30 topi immunodeficienti (es. NOD.Cg-Prkdc scid Il2rg tm1Wjl / SzJ (NSG) o 129S6/SvEvTac-Rag2 tm1Fwa (RAG2 - / -)) o topi geneticamente suscettibili ( ad es. AKR / J), che sono 6-8 settimane di età con circa 300 uova di Trichuris Muris mediante sonda gastrica.
- Dopo 32-35 giorni sacrificare i topi da CO 2 asfissia.
- Esporre la parte ventrale del mouse e bagnato l'addome con il 70% di etanolo.
- Utilizzando pinze afferrare la cute addominale e fare una piccola incisione con le forbici. Tagliare la pelle per esporre il contenuto addominale.
- Identificare il cieco e l'intestino prossimale di grandi dimensioni, e rimuoverli.
- Posizionare il cieco e colon prossimale in un piatto da 10 cm petri contenenti Dulbecco modificato (DMEM) con 500 U / ml penicillina e 500 mg / ml di streptomicina (P / S). Tagliare il cieco aperto per esporre il lume e il worm. Utilizzando posto forcipe cieco in un bicchiere di tampone fosfato (PBS) e agitare delicatamente per rimuovere le feci.
- Ritorna cieco a capsula di Petri e con pinze curve lisce (Roboz RS-5047) delicatamente estrarre vermi e metterli in un pozzetto di una piastra ben 6 contenente 5 ml di DMEM + P / S.
- Ripetere questo processo per tutti i topi.
- Mettere 6 pozzetti in un contenitore Tupperware con un tovagliolo di carta umido per mantenere l'umidità e incubare a 37 ° C per 4 ore.
- Dopo 4 ore rimuovere worm utilizza pinze curve lisce e dividerli in 2 nuovi pozzi della piastra 6 pozzetti contenenti 5 ml DMEM + P / S. Raccolto il contenuto del pozzo originario e porlo in una provetta da 15 ml falco. In provetta a 3000 giri e rimuovere e prenotare surnatante come antigene 4 ore (può essere utilizzato per restimolazione cellulare dopo PBS dialisi, dove i rendimenti delle proteine tipiche sono 10-20 mg per 20 topi) e risospendere uova contenenti pellet in acqua di rubinetto in autoclave.
- Mettete i 6 piastra ben indietro a 37 ° C durante la notte. Rimuovere e smaltire i vermi. Raccolto il contenuto dei pozzetti in un tubo falco e far girare a 3000 rpm per 5 min. Rimuovere il surnatante e riserva come antigene durante la notte (può essere utilizzato per Trichuris ELISA specifico anticorpo isotipo Ag dopo PBS dialisi, dove i rendimenti delle proteine tipiche sono 10-20 mg per 20 topi) e di uova contenenti risospendere pellet in acqua di rubinetto in autoclave.
- Combina 4 ore e uova notte e filtrare le uova attraverso il filtro 70μm di togliere qualunque vermi rimasto poi trasferire in un centimetro 75 2 pallone. Tenere pallone in un luogo buio coperto in lamina per 6 settimane a temperatura ambiente (RT).
- Lavare le uova in acqua di rubinetto in autoclave e risospendere a 50 uova vitali in 50 microlitri. Per fare questo, uova centrifuga a 3000 rpm per 5 minuti e risospendere in ~ 50ml acqua sterile. Togliere 50 microlitri uova e posto su un vetrino. Utilizzando l'ingrandimento 40x contare il numero di valide uova embrionate in microlitri 50. Diluire le uova per dare 50 uova vitali in 50 microlitri. Per le immagini di uova vitali si veda lo studio di Kopper e Mansfield 16.
2. Infezione acuta dei topi sperimentali con Trichuris Muris uova (200 uova / mouse)
- Risospendere completamente le uova e rimuovere il volume sufficiente per trattare il numero di topi X 2 (es. per 10 topi prendere 200 x 10 microlitri topi x 2 = 4 ml di uova) e metterli in un tubo 14 ml tappo a scatto.
- Invertire il tubo a scatto 14 ml tappo a mescolare. Portate fino a 200 ml di uova in siringa da 1 ml su un ago appropriato alimentazione dimensioni (per i mouse peso di 25 grammi abbiamo utilizzato 18 gauge 1 1 / 2 "aghi). Collottola In una mano il mouse e utilizzando invece amministrare uova mediante sonda gastrica .
- Aspettare 21 giorni.
3. Vendemmia sperimentale
- Il giorno 21 sacrificare i topi utilizzando CO 2.
- Raccogliere il sangue dai topi da puntura cardiaca, in modo non eparinizzata siringa, e conservare a 4 ° C. Il giorno seguente isolare siero e congelare a -20 ° C. Siero può essere utilizzato per il rilevamento di Trichuris-IgG e IgE specifiche con il metodo ELISA.
- Esporre la parte ventrale del mouse e bagnato l'addome con il 70% di etanolo.
- Utilizzando pinze afferrare la cute addominale e fare una piccola incisione con le forbici. Tagliare la pelle e membrana sottostante per esporre il contenuto addominale.
- Identificare il piccolo intestino, cieco e del colon. Afferra il cieco con una pinza e tirare fuori della cavità addominale. Con un altro paio di pinze spingere tenue verso destra esporre i linfonodi mesenterici (mln). Rimuovere la mln facendo attenzione a non tagliare negli intestini e posto in un falcon da 15 ml contenente 2 ml di media. Se lo si desidera possono essere elaborati e restimolati in vitro (4x10 6 / ml a 1 ml in 24 piastre con 1 mg / ml o con αCD3/CD28 50μg/ml 4h Trichuris Ag) per 72 ore per l'analisi di citochine da parte ELISA ed f intracellularecitometria basso.
- Tagliare il cieco e del colon.
- Utilizzando pinze, spingere fuori pellet fecali da colon distale e posto in un tubo da 2 ml Axygen. Congelare a -20 ° C. Pellet fecali possono essere analizzati mediante western blot per l'espressione di resistina-come molecola-β (RELM-β).
- Rimuovere la punta del cieco (~ 0.5 cm). Per rimuovere le feci tenere punta cieco con una pinza e filo con PBS usando una siringa da 3 ml e 22-gauge in una capsula di Petri. Mettere in fresco paraformaldeide 4% in una provetta da 5 ml tappo a scatto Falcon. Conservare a 4 ° C. Questi possono essere inclusi in paraffina, sezionati e montati su vetrini per l'analisi istologica.
- Rimuovere un pezzo di colon prossimale (~ 1 cm) per RNA. Mettere campione in 2 ml di tubo Axygen RNAlater con 500 microlitri. Conservare a 4 ° C. Questi campioni possono essere analizzati per l'espressione di mRNA da qPCR.
- Mettere il resto del cieco in una capsula di Petri etichettati e congelare a -20 ° C.
4. Enumerazione di Trichuris vermi Muris nel cieco
- Rimuovere cieco dal freezer e metterlo in una capsula di Petri contenente ~ 5 ml di acqua.
- Utilizzando le forbici, tagliare aperto cieco per esporre il lume.
- Tenere il cieco con una pinza e scuotere vigorosamente il cieco per rimuovere la maggior parte delle feci.
- Trasferimento ad un altro cieco capsula di Petri contenente acqua e usando liscia pinze curve dolcemente raschiare il IXC il tessuto sottostante.
- Trasferimento cieco per un nuovo piatto di Petri contenente acqua e vigorosamente raschiare restante tessuto con una pinza, strappa il tessuto in piccoli pezzi.
- Utilizzare un microscopio da dissezione per contare tutti i vermi in tutti e 3 i piatti di Petri. Come si trova un verme rimuoverlo dal piatto per assicurare il worm stesso non viene contato due volte. Se vermi sono danneggiato (rotto a metà) contare solo finisce spesso o sottile per ottenere un conteggio accurato.
5. Rappresentante Risultati
L'infezione Trichuris Muris modello permette ai ricercatori di quantificare carico parassita e risposta immunitaria sistemica, come pure per esaminare istologicamente la risposta infiammatoria all'interno del cieco distale. Quando il lume del cieco raccolto è esposto, worm Trichuris possono essere enumerati utilizzando un microscopio da dissezione (Figura 1A-B). Parametri di immunità ai Trichuris anche isotipo anticorpale passaggio a IgG1 (associata con l'immunità di tipo Th2) negli animali resistenti e IgG2a (associata a immunità di tipo Th1) di animali sensibili (Figura 1C). Espressione del calice cellule specifiche proteine-resistina come molecola-β (RELM-β) è associato con una clearance di Trichuris ed è rilevabile dall'analisi Western blot (Figura 2). La porzione distale del cieco possono essere colorati con acido periodico di Schiff (PAS) per valutare le risposte delle cellule caliciformi e il grado di infiammazione intestinale in risposta alle infezioni (Figura 3).
Figura 1. Quantificazione di immunità ai Trichuris Muris. (A) Resistente (B6) topi espellere Muris Trichuris dopo 21 giorni post-infezione. Al contrario, suscettibile (AKR / J) i topi diventano con infezione cronica da Trichuris, con conseguente istituzione parassita. Ogni barra rappresenta la media ± SEM di 4-8 animali per ciascun gruppo. (B) Worms vengono conteggiati utilizzando un microscopio da dissezione. Pannello superiore mostra i vermi in isolamento, pannello inferiore mostra i vermi in presenza di IXC e le feci. (C) Trichuris specifici titoli IgG2a sono determinati da ELISA di siero diluito (1:2 di diluizione, a partire dalla diluizione 1:20 e termina a 1:2560) su piastre rivestite di antigene escretorio Trichuris (O / N Ag, 5 mg / ml). Suscettibili AKR / J topi hanno livelli notevolmente superiori di Trichuris specifici IgG2a siero di topi resistenti B6.
Figura 2. Liquidazione di Trichuris Muris è associata con l'espressione del calice cellule specifiche proteine RELM β-7. RELM-β di produzione possono essere rilevati da pellet fecali da Trichuris infetti resistenti (B6), ma non sensibili (AKR / J) nei topi mediante analisi Western Blot. Ogni corsia è rappresentativo di un animale unico, (N) = Naive, (Tm) = 21 giorni Trichuris topi infettati.
Figura 3. L'esame istologico della distale infezione Trichuris cieco segue. Micron sezioni 5-7 della distale cieco macchiato di PAS. Iperplasia delle cellule caliciformi e la produzione di muco sono evidenti in resistente (B6), ma non sensibili (AKR / J) nei topi dopo l'infezione Trichuris.
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Discussion
Questo protocollo dettagli di un elevato standard dose acuta di infezione Trichuris Muris, che può essere modificato come richiesto dallo sperimentatore. Per esempio, i topi possono essere sacrificati e tessuti raccolti in giorni diversi. Per determinare che i topi hanno stabilito con successo pieno carico vermi possono essere sacrificati al giorno 14, momento in cui tutti i mouse dovrebbe portare un peso di circa 200 vermi. I topi possono anche essere infettati per 32 giorni in cui ogni verme rilevato avrà raggiunto la maturità e sarebbe rimasto con ospite per tutta la durata della sua vita. Inoltre, il protocollo può essere adattato a modello di infezione cronica Trichuris Muris. Per farlo, la dose somministrata uovo può essere regolata ad una infezione bassa dose (circa 30 uova). A questa dose, normalmente i topi resistenti non riescono a indurre una risposta protettiva Th2, ma generare una risposta Th1 e mantenere un peso di circa 20 vermi 17.
Uno dei vantaggi del modello di infezione Trichuris Muris rispetto ai modelli altra infezione è che in generale i topi infetti non mostra alcuna morbilità o la mortalità. Ci sono tuttavia fattori che possono influenzare risultato sperimentale che i ricercatori devono essere consapevoli. Il primo fattore è la tensione di fondo dei topi. Come indicato nei risultati, i topi C57BL / 6 sono resistenti e AKR / J topi sono suscettibili, e, allo stesso modo, altri ceppi inbred può avere una infezione profili diversi. Perciò è importante che il ricercatore essere consapevoli del ceppo sfondo di topi e il loro utilizzo topi di controllo appropriato. Inoltre, ci possono essere topo-to-mouse variazione nella clearance dei parassiti quindi non c'è bisogno di preoccuparsi se alcuni topi di controllo sono normalmente resistenti fino a 30 vermi a 21 giorni dall'infezione. Inoltre, i topi sensibili non sempre mantenere un pieno di 200 contare fardello verme, ma può variare da circa 75-200 vermi per cieco. Questa variazione può anche essere rappresentato da una variazione naturale flora intestinale di topi alloggiati in strutture diverse.
Un fattore che incide negativamente Trichuris infezione Muris è la presenza di ossiuri. Ossiuri infettare stesso sito anatomico di Trichuris e indurre una risposta immunitaria che può confondere l'interpretazione degli studi Trichuris. Inoltre, pinworm trattamento (albendazolo, fenbendazolo) uccide anche Trichuris. In questa procedura sperimentale, usiamo i topi che sono mantenuti in condizioni di libero-specifici patogeni, ed è fondamentale che i topi sperimentali essere tenuti ossiuri liberi prima e durante l'infezione Trichuris Muris.
Alcuni ricercatori minori punti devono essere consapevoli di:
- Le uova devono essere mantenuti in acqua, non PBS.
- Le uova sono molto pesanti e pertanto deve essere risospeso prima della consegna ad ogni mouse. Inoltre, il carico solo il volume sufficiente di uova per infettare un topo in un momento, come si depositerà nella siringa.
- Alcuni ceppi rari mostrano differenze di sesso in infettività ma nella maggior parte dei casi, maschi o femmine possono essere usati per infezioni Trichuris Muris.
- Topi ingenui possono essere alloggiati nella stessa gabbia di topi infettati quanto non vi è alcuna preoccupazione di trasferimento orizzontale di infezione da questo modello.
Nel complesso, Trichuris infezione Muris è una procedura semplice da eseguire che Th2-dipendente modelli immunità e possono essere adattati alle singole esigenze dei ricercatori.
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Disclosures
Gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti secondo le linee guida e regolamenti stabiliti da The University of British Columbia.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dal Canadian Institutes of Health Research (MSH-95368, 89773 e-MOP MOP-106623 a CZ) e la Fondazione canadese per l'innovazione. SCM è il destinatario di un CIHR / Canadian Association of Gastroenterology borsa post-dottorato. CZ è un investigatore CIHR Nuovo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animal Feeding Needles (18 x 1½") | Popper & Sons, Inc. | 7912 | |
| Smooth curved Forceps | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5047 | |
| DMEM | GIBCO, by Life Technologies | 11965 | |
| NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) | Jackson Laboratory | 005557 | These are the mice we used, however, any immunodeficient mice or susceptible strain should work. |
| RNAlater | Qiagen | 76104 | |
| 2 ml tubes | Axygen Scientific | MCT-200-C | |
| 15 ml tubes | Falcon BD | 352096 | |
| 6 well plates | Falcon BD | 353046 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| α-RELMβ antibody | PeproTech Inc | 0694270Rb |
References
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