Summary
Vi demonstrera metalation, rening och karakterisering av lantanider komplex. Det komplex som beskrivs här kan konjugerat till makromolekyler för att spåra dessa molekyler med magnetkamera.
Abstract
Polyaminopolycarboxylate-baserade ligander används ofta för att kelat lantanider joner, och de resulterande komplex är användbara som kontrastmedel för magnetisk resonanstomografi (MRT). Många kommersiellt tillgängliga ligander är särskilt användbara eftersom de innehåller funktionella grupper som möjliggör snabb, med hög renhet och högavkastande konjugering till makromolekyler och biomolekyler via amin-reaktiv aktiveras estrar och grupper isothiocyanat eller tiol-reaktiva maleimides. Medan metalation av dessa ligander anses allmänt känt i området bioconjugation kemi, subtila skillnader i metalation förfaranden måste beaktas vid val av metall utgångsmaterial. Dessutom beror flera alternativ för rening och finns karakterisering och urval av de mest effektivt förfarande delvis på valet av utgångsmaterial. Dessa subtila skillnader är ofta förbisedda i publicerade protokoll. Här är vårt mål att visa gemensamma metoder för metalation, rening och karakterisering av lantanider komplex som kan användas som kontrastmedel för MRT (Figur 1). Vi förväntar oss att denna publikation kommer att möjliggöra biomedicinska analytiker att införliva lantanider komplexbildningsjämvikter i deras repertoar av vanliga reaktioner genom att underlätta valet av utgångsmaterial och metoder rening.
Protocol
1. Metalation använda LnCl 3 salter
- Lös upp liganden i vatten till en lösning av 30-265 mM. Liganden 2 - (4-isothiocyanatobenzyl)-dietylentriamin pentaacetic syra (p-SCN-BN-DTPA) har använts i denna video vid en koncentration av 73 mm.
- Justera pH i lösningen av liganden till mellan 5,5 och 7,0 genom att tillsätta 1 M NH 4 OH. I den här filmen var 0,2 ml av 1 M NH 4 OH lösning som används.
- Lös upp 1-2 motsvarigheterna LnCl 3 i vatten till en lösning med en koncentration av 5-1000 mM. I den här filmen var EuCl 3 och GdCl 3 användas i koncentrationer över 111 mm. Ett överskott av metall används ofta för att driva metalation till färdigställande och därmed förenkla rening.
- Tillsätt lösning LnCl 3 till lösningen av liganden under omrörning.
- Efter tillsats av LnCl 3, justera pH i den resulterande reaktionsblandningen till mellan 5,5 och 7,0 genom att lägga till 0,2 M NH 4 OH. Sammanlagt 0,5 ml av 0,2 M NH 4 OH-lösning har använts i denna video. Om din ligand innehåller känsliga för sura funktionella grupper, justera pH flera gånger under detta steg. VARNING - Om lösningen blir för grundläggande, någon bas känsliga funktionella grupper, som isotiocyanat kommer oanvändbar för konjugering.
- Övervaka reaktionen via pH-mätningar. Reaktionen är färdig när pH-värdet är konstant.
2. Att höja pH workup (ingår inte i denna video, men bra för ligander utan bas-känsliga funktionella grupper)
- Tillsätt koncentrerad NH 4 OH att reaktionsblandningen för att justera pH till ≥ 11. Detta steg kommer fälla några uncomplexed metall som olöslig hydroxid.
- Filtrera supernatanten genom ett 0,2 ìm filter. Om reaktionsblandningen träskor filter, centrifugering och dekantering innan filtrering rekommenderas.
- Om dialys inte kommer att utföras, ta bort lösningsmedel under reducerat tryck (roterande avdunstning eller frystorkning rekommenderas).
- Steg 2,1-2,3 kan upprepas om fri lantanider kvarstår.
3. Dialys workup
- Skär dialys slangen till en lämplig längd (följ tillverkarens anvisningar) för att hålla provvolym medan extra längd (ca 10% av provets volym). I den här filmen var en 100-500 Dalton molekylvikt cut-off (MWCO) membran används, men större MWCO slangar kan användas som lämpligt om konjugering sker före metalation. Dessutom kan dialys kassetter användas som ett alternativ till dialys slangen om så önskas.
- I förekommande fall baserat på tillverkarens anvisningar, blöt slangen skär dialys i vatten i 15 minuter vid rumstemperatur.
- Fyll en dialys reservoar (en 1 L bägare har använts i denna video) med vatten (dialysatet). Dialysatet volymen bör vara ca 100x som analysprovet.
- Vik ena änden av slangen två gånger och säkra den vikta delen på slangen med en dialys stängning klämma. Linda slutet av nedläggningen med ett gummiband så att det förblir stängd under dialys.
- Filtrera reaktionsblandningen genom ett 0,2 ìm filter, och ladda filtratet till den öppna änden av slangen försiktigt så att inte slita i slangen. Var noga med att lämna tillräckligt utrymme för huvudet för att stänga slangen.
- Vik de återstående öppna änden av slangen två gånger, säkert med en nedläggning, och linda stängningen med ett gummiband som i steg 3,4.
- Bifoga en glasflaska som innehåller luft till klämman på ena änden av dialys slangen med hjälp av ett gummiband. Bifoga en injektionsflaska med sand till den andra klämman. Dessa flaskor se till att slangen stannar nedsänkt i dialysatet.
- Placera hela slangen i dialys reservoar som innehåller dialysatet.
- Rör dialysatet med hjälp av en magnetisk omrörare platta vid en låg hastighet (ingen vortexa) vid rumstemperatur.
- Ändra dialysatet 3x under loppet av en dag (i denna video, var dialysatet ändras vid 2,5, 6,5 och 11,5 h), och sedan låta dialys för att fortsätta över natten (för sammanlagt 20-28 timmar av dialys).
- Ta bort dialys slangen från dialysatet och försiktigt öppna en stängning för att ta bort provet. Tvätta dialys slangen 3x med vatten och blanda sköljvätskan med provet.
- Ta bort vattnet under minskat tryck. Frystorkning används i denna video.
4. Bedömning av förekomsten av fria metall
- Lös upp metallen komplexa i acetatbuffert (buffert förberedelser: Lös 1,4 ml ättiksyra i 400 ml vatten, justera pH till 5,8 med 1 M NH 4 OH, och tillsätt vatten till en total volym av 500 ml) och tillsätt xylenol apelsin-indikatorn (16 mikrometer i pH 5,8 buffert). I denna video, var 0,3 mg av komplexa löst i 0,3 ml av buffert och 3 ml indikatorlösning lades.
- Upptäcka förekomsten av fria metall genom observation av en färgförändring av indikatorn från gult till violett.
- Om så önskas kan mängden ledigt metall kvantifieras genom att skapa en kalibreringskurva 1. Alternativt kan färgen arsenazo III användas i stället för xylenol apelsin 2. Om fri metall kvarstår, bör provet renas ytterligare med hjälp av dialys, en avsaltning kolumn eller högpresterande vätskekromatografi (HPLC) innan karakterisering.
5. Fastställande av vatten-samordningsnummer (q)
- Bered en lösning av Eu III-innehållande komplex (~ 1 mm) i H 2 O och en annan lösning av samma koncentration i D 2 O. Före analysen måste D 2 O lösningen indunstas och löses upp i D 2 O tre gånger för att avlägsna rester av H 2 O.
- Tillsätt vatten lösning till en ren kyvett, och placera kyvetten i en spectrofluorometer.
- Utför excitation och utsläpp skannar för att bestämma gränsen för varje (~ 395 nm och ~ 595 nm, respektive).
- Gör en fosforescens tid förfall experiment med hjälp av följande parametrar: excitation och våglängder utsläpp bestäms från steg 5,3, excitation och utsläpp bredder slits (5 nm), Flash räkna (100), inledande förseningen (0,01 ms), maximal fördröjning (13 ms) och fördröjning ökning (0,1 ms). Dessa villkor är lämpliga för de flesta komplex, men maximala fördröjningstiden och värden steg kan ökas eller minskas för arter med extremt långa eller extremt korta förfall gånger.
- Upprepa steg 5,4 med D 2 O lösning som framställts i steg 5,1.
- Från luminiscens-sönderfall data som erhållits i 5,4 och 5,5, plotta den naturliga logaritmen av intensitet som funktion av tiden. Lutningen på dessa linjer är dämpfaktorer (τ -1) (Figur 2). I den här filmen var Microsoft Excel 2007 används för att skapa den naturliga logaritmen tomterna från rådata. Använd dämpfaktorer i ekvationen utvecklats av Horrocks och medarbetare (EQ 1) 3. Om din ligand innehåller OH-eller NH grupper samordnas i metall, så ekvationen måste ändras före användning 3.
eq 1: 
6. Relaxiviteten mätningar
- Välj önskat program läget på avkoppling Time Analyzer: T 1 (längsgående avslappning tid) eller T 2 (tvärgående avkoppling tid).
- Bered en serie prover som innehåller olika koncentrationer av Gd III-innehållande komplex i ett vattenbaserade lösningsmedel. I den här filmen var vatten används som lösningsmedel och lösningar på 10,0, 5,00, 2,50, 1,25, 0,625 och 0 mm har upprättats. Andra vattenhaltiga lösningsmedel eller buffertar kan användas, men det är viktigt att använda lösningsmedel som tomt. Den slutliga provets volym är specifik för det instrument som används.
- Placera ett prov i instrumentet och låt det sitta i 5 min till jämvikt till den temperatur som instrumentet (37 ° C i denna video).
- Bestäm avkoppling tid (i enheter av er) genom att justera parametrar i programvaran för att få en smidig exponentiell kurva för T 1 och T 2 (representant kurvor för T 1 och T 2 visas i figur 3).
- Upprepa steg 6,3 och 6,4 för samtliga prov, inklusive tomt.
- Beräkna inversen av uppmätta T 1 eller T 2 värden i enheter s -1.
- Plot T 1 -1 eller T 2 -1 värden kontra Gd III koncentration (i enheter om mM). På grund av den hygroskopiska natur Gd III-innehållande komplex, bekräftar koncentration av Gd III med atomabsorptionsspektrofotometri eller induktivt kopplad plasma masspektrometri. Montera tomt med en rak linje. En representant tomt visas i Figur 4.
- Lutningen på monterade linjen är relaxiviteten (R 1 eller r 2 för T 1 och T 2, respektive) och har enheter av mM -1 s -1.
7. Representativa resultat
Representativa data för steg i detta protokoll har ingått i tabeller och figurer avsnitt. Förutom vatten-samordningsnummer och relaxiviteten karakterisering beskrivs i protokollet, är det viktigt att karakterisera slutprodukterna med vanliga kemiska metoder. Identiteten av föreningen kan erhållas med hjälp av masspektrometri, och representativa masspektra visar den diagnostiska isotopen mönster för Gd III - och Eu III-innehållande komplex visas i Figur 5. Dessutom för icke-gd III
Figur 1 Allmänt system för metalation och rening:. Scheme skildrar den allmänna proceduren för metalation och skäl att välja olika rening rutter.
Figur 2 Luminescence intensitet Handling:. Representant handlingen i den naturliga logaritmen av intensitet som funktion av tiden från avsnitt 5. Sluttningarna av de linjer som genereras från liknande kurvor förvärvats för vatten-och D 2 O-lösningar används med eq 1 att karakterisera vatten-samordning antal EU-III-innehållande komplex.
Figur 3 Avkoppling Utsvängningstid kurvor:. Representativa uppgifter för (vänster) T 1 och (höger) T 2 förvärvet. Avvikelser från dessa kurva former skulle ge otillförlitliga uppgifter.
Figur 4 Relaxivitet bestämning:. En representant tomt på 1 / T 1 kontra koncentration av Gd III. Lutningen på monterade raden är relaxiviteten och har enheter av mM -1 s -1.
Figur 5 masspektra:. Representant masspektra visar den diagnostiska isotopen mönster (till vänster) Gd III innehåller komplex och (höger) EU III innehåller komplex. Den svarta Gaussisk topparna representerar den teoretiska isotopen distribution och de röda linjerna är de faktiska uppgifterna.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Med tanke på det ökande antalet publikationer som inkluderar lantanider-baserade kontrastmedel 4-14, är det viktigt att man är försiktig för att förbereda, rening, samt beskriva produkter för att säkerställa att reproducerbara och jämförbara resultat. Dessa komplex anses ofta utmanande för att rena och karakterisera i förhållande till organiska molekyler på grund av deras paramagnetiska natur och känslighet några funktionella grupper som kan användas för bioconjugation. Vi har beskrivit gemensamma metoder för syntes, rening och karakterisering av lantanider komplex. Men när du väljer en av dessa metoder är det viktigt att beakta det specifika system som studeras.
I komplexbildningsjämvikter kan en mängd olika metallsalter som finns kommersiellt tillgänglig att användas, och valet av salt beror på målet med studien. Till exempel är en fördel med att använda den klorid (eller triflate eller nitrat) salter som relativt lindriga villkor krävs med hänsyn till temperaturen. Men dessa metoder kräver noggrann övervakning av pH och producerar salter som biprodukt. Om systemet som studeras är särskilt känsliga för förändringar i pH, därefter noggrann övervakning och kontroll av pH måste utföras. Även om saltet biprodukter skulle vara till skada för systemet som studeras, måste de tas bort eller alternativ syntes bör användas. Med lantanider hydroxid (eller oxid) utgångsmaterial, måste högre temperaturer användas på grund av den låga lösligheten av dessa arter, men det enda biprodukt av metalation är vatten. Den här metoden är idealisk för reaktioner som skulle vara svårt att AVSALTA, men det skulle inte fungera för temperaturkänsliga system. Det är också värt att nämna att dessa metalation reaktioner är extremt robust med avseende på halterna av metall och ligand. Koncentrationen varierar förtecknas i del ett spann de koncentrationsintervall som vi kunde hitta i litteraturen.
Förutom genomtänkta val av metall utgångsmaterial, är det viktigt att betona att både metall och liganden sannolikt nära har tillhörande vatten och molekylerna i en lösning, även om de verkar vara torr. Dessa extra molekyler är ofta tillräckligt för att kraftigt förvränga stökiometri av en reaktion. Därför är det bra att ha väl karakteriserade utgångsmaterial (grundämnesanalys) så att exakta mängder av dessa material används i reaktionen.
I denna artikel betonar vi vikten av att upprätthålla pH-värdet i reaktionsblandningen. Denna pH-kontroll är kritisk på grund av flera aspekter av den reaktion som kan misslyckas om pH är tillåtet att avvika från nära neutralt. För metalation reaktion inträffar måste karboxylsyror på ligand vara deprotonated (nära neutralt eller högre pH) medan lantanider jon måste stanna lösliga (nära neutralt eller lägre pH). Om pH-värdet är för högt, kommer olösliga natriumhydroxid komplex av lantanider jon fällning och stoppa reaktionen. Alternativt, om pH-värdet är för lågt, kommer karboxylsyror kvar protonerade och liganden kommer inte att samordna till metall. Vidare vid extrema pH-värden, kommer reaktiva funktionella grupper bryts ner och göra de komplexa inert mot efterföljande bioconjugation reaktioner. För att ytterligare komplicera saken, eftersom metalation reaktion inträffar, är pH i reaktionsblandningen sänks eftersom karboxylsyror deprotonated. Medan pH balansgång för metalation kan förefalla komplexa, kan det vara lätt kontrolleras med försiktig tillsats av bas.
Det finns många strategier för metalation med subtila skillnader. I denna artikel valde vi att beskriva användningen av överskjutande metall. Det är också acceptabelt att använda överskott ligand eller motsvarande mängd ligand och metall (baserat på elementär analys av utgångsmaterial). Det finns fördelar och begränsningar av varje rutt. Den främsta fördelen med att använda överskott metall är att liganden är ofta det dyraste utgångsmaterial, och denna metod kan spara pengar. Men när metall används i överskott, är att avlägsna överskottet metall av avgörande betydelse eftersom någon fri metall kan dramatiskt påverka viktiga egenskaper, inklusive relaxiviteten och toxicitet. Om dialys mot vatten är otillräcklig för att avlägsna överflödig metall, dialys mot citratbuffert kan utföras följt av dialys med vatten för att avlägsna citratbuffert. Alternativt kan en avsaltning kolumn eller HPLC kan användas så länge vården är man se till att pH-neutralitet mobil fas används. När ligand används i överskott, finns det inte längre det stora behovet att avlägsna överskott av metall och överskott liganden kommer troligen inte att påverka relaxiviteten, men kommer fri ligand kvar. För efterföljande bioconjugation reaktioner, kan detta överskott ligand vara problematisk och resulterar i inhomogena konjugat som är svåra att separera. För att åtgärda detta problem, metall komplexes kan utlösas från vattenfri dietyleter eller HPLC kan användas för att separera metallen komplex från överskott ligand. Helst skulle ligand och metall användas i förhållandet 1:1 vilket resulterar i något metall-eller ligand baserad biprodukter. Det är dock grundämnesanalys för både utgångsmaterial som behövs före varje reaktion, och om det finns en liten avvikelse från en 1:1 ligand-mot-metall-tal, då reaktionen kommer att falla i antingen ligand-i-över-eller metall- i-över kategorier, vilket resulterar i behovet av rening.
Vi har visat metalation där den resulterande komplexet är klar för bioconjugation 15-17. Ett alternativ till denna strategi är konjugering av ligand och biomolekyler först, följt av metalation 18,19. Med denna konjugat-därefter-metalate strategi, samma faktorer måste beaktas när beslut fattas om en metalation rutt (pH-känslighet och temperatur känslighet biomolekyler samt förmågan att rena produkten från salter).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Vi erkänner tacksamt start fonder från Wayne State University (MJA), ett bidrag från den amerikanska stiftelsen för Aging Research (SMV), och en väg till Independence karriär övergång Award (R00EB007129) från National Institute of Biomedical Imaging och bioteknik av National Institutes of Health (MJA).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EuCl3∙6H2O | Sigma-Aldrich | 203254-5G | |
| p-SCN-Bn-DTPA | Macrocyclics | B-305 | |
| ammonium hydroxide | EMD Millipore | AX1303-3 | |
| Spectra/Por Biotech Cellulose Ester (CE) Dialysis Membrane - 500 D MWCO | Fisher Scientific | 68-671-24 | |
| Millipore IC Millex-LG Filter Units | Fisher Scientific | SLLG C13 NL | |
| xylenol orange tetrasodium salt | Alfa Aesar | 41379 | |
| acetic acid | Fluka | 49199 | |
| D2O | Cambridge Isotope Laboratories | DLM-4-25 | |
| water purifier | ELGA | Purelab Ultra | |
| high performance liquid chromatography and mass spectrometry | Shimadzu Corporation | LCMS-2010EV | |
| relaxation time analyzer | Bruker Corporation | mq60 minispec | |
| UV-vis spectrophotometer | Fisher Scientific | 20-624-00092 | |
| freeze dryer | Fisher Scientific | 10-030-133 | |
| pH meter | Hanna Instruments | HI 221 | |
| spectrofluorometer | Horiba Instruments Inc | Fluoromax-4 | |
| Molecular Weight Calculator version 6.46 by Matthew Monr–, downloaded October 17, 2009 |  http://ncrr.pnl.gov/software/ |
Molecular Weight Calculator |
References
- Barge, A., Cravotto, G., Gianolio, E., Fedeli, F. How to determine free Gd and free ligand in solution of Gd chelates. A technical note. Contrast Med. Mol. Imaging. 1, 184-188 (2006).
- Nagaraja, T. N., Croxen, R. L., Panda, S., Knight, R. A., Keenan, K. A., Brown, S. L., Fenstermacher, J. D., Ewing, J. R. Application of arsenazo III in the preparation and characterization of an albumin-linked, gadolinium-based macromolecular magnetic resonance contrast agent. J. Neurosci. Methods. 157, 238-245 (2006).
- Supkowski, R. M., Horrocks, W. D. On the determination of the number of water molecules, q, coordinated to europium(III) ions in solution from luminescence decay lifetimes. Inorg. Chim. Acta. 340, 44-48 (2002).
- Menjoge, A. R., Kannan, R. M., Tomalia, D. A. Dendrimer-based drug and imaging conjugates: design considerations for nanomedical applications. Drug Discovery Today. 15, 171-185 (2010).
- Que, E. L., Chang, C. J. Responsive magnetic resonance imaging contrast agents as chemical sensors for metals in biology and medicine. Chem. Soc. Rev. 39, 51-60 (2010).
- Uppal, R., Caravan, P. Targeted probes for cardiovascular MR imaging. Future Med. Chem. 2, 451-470 (2010).
- Major, J. L., Meade, T. J. Bioresponsive, cell-penetrating, and multimeric MR contrast agents. Acc. Chem. Res. 42, 893-903 (2009).
- Datta, A., Raymond, K. N. Gd-hydroxypyridinone (HOPO)-based high-relaxivity magnetic resonance imaging (MRI) contrast agents. Acc. Chem. Res. 42, 938-947 (2009).
- León-Rodríguez, L. M. D., Lubag, A. J. M., Malloy, C. R., Martinez, G. V., Gillies, R. J., Sherry, A. D. Responsive MRI agents for sensing metabolism in vivo. Acc. Chem. Res. 42, 948-957 (2009).
- Castelli, D. D., Gianolio, E., Crich, S. G., Terreno, E., Aime, S. Metal containing nanosized systems for MR-molecular imaging applications. Coord. Chem. Rev. 252, 2424-2443 (2008).
- Caravan, P., Ellison, J. J., McMurry, T. J., Lauffer, R. B. Gadolinium(III) chelates as MRI contrast agents: structure, dynamics, and applications. Chem. Rev. 99, 2293-2352 (1999).
- Lauffer, R. B. Paramagnetic metal complexes as water proton relaxation agents for NMR imaging: theory and design. Chem. Rev. 87, 901-927 (1987).
- Yoo, B., Pagel, An overview of responsive MRI contrast agents for molecular imaging. Front. Biosci. 13, 1733-1752 (2008).
- Pandya, S., Yu, J., Parker, D. Engineering emissive europium and terbium complexes for molecular imaging and sensing. Dalton Trans. 23, 2757-2766 (2006).
- Nwe, K., Xu, H., Regino, C. A. S., Bernardo, M., Ileva, L., Riffle, L., Wong, K. J., Brechbiel, M. W. A new approach in the preparation of dendrimer-based bifunctional diethylenetriaminepentaacetic acid MR contrast agent derivatives. Bioconjugate Chem. 20, 1412-1418 (2009).
- Nwe, K., Bernardo, M., Regino, C. A. S., Williams, M., Brechbiel, M. W. Comparison of MRI properties between derivatized DTPA and DOTA gadolinium-dendrimer conjugates. Bioorg. Med. Chem. 18, 5925-5931 (2010).
- Caravan, P., Das, B., Deng, Q., Dumas, S., Jacques, V., Koerner, S. K., Kolodziej, A., Looby, R. J., Sun, W. -C., Zhang, Z. A lysine walk to high relaxivity collagen-targeted MRI contrast agents. Chem. Commun. , 430-432 (2009).
- León-Rodríguez, L. M. D., Kovacs, Z. The synthesis and chelation chemistry of DOTA-peptide conjugates. Bioconjugate Chem. 19, 391-402 (2008).
- Boswell, C. A., Eck, P. K., Regino, C. A. S., Bernardo, M., Wong, K. J., Milenic, D. E., Choyke, P. L., Brechbiel, M. W. Synthesis, characterization, and biological evaluation of integrin αVβ3-targeted PAMAM dendrimers. Mol. Pharm. 5, 527-539 (2008).
