प्रौढ़ की तैयारी ड्रोसोफिला आंखें पतली सेक्शनिंग और सूक्ष्म विश्लेषण के लिए

Published: August 27, 2011 doi: 10.3791/2959

Andreas Jenny¹

¹Department of Developmental and Molecular Biology, Albert Einstein College of Medicine

Summary

वयस्क तैयार करने के लिए एक मानक दृष्टिकोण

Protocol

1. सिर विच्छेदन फ्लाई

सुनिश्चित करें कि आप हाथ में सभी सामग्री (जिलेटिन लेपित स्लाइड्स सहित). Glutaraldehyde और आज़मियम fixatives (नीचे देखें) तैयार है. एम्बेड करते हैं, बर्फ पर 1.5 मिलीलीटर ट्यूबों में जीनोटाइप और विभाज्य 200μl glutaraldehyde तय समाधान के प्रति.
सीओ ₂ पैड (हम आम तौर पर सात मक्खी जीनोटाइप प्रति मामले में छह एम्बेड सिर काटना एक सिर प्रक्रिया के दौरान नष्ट हो जाता है) पर मक्खियों anesthetize.
पकड़ो और थोड़ा ऊपर उड़, पृष्ठीय पक्ष की छाती प्रेस, चिमटी के साथ और एक तेज स्केलपेल का उपयोग करने के लिए बंद सिर काट.
चिमटी के साथ गर्दन को छू द्वारा मक्खी सिर स्थिर और ध्यान से एक आंख का एक छोटा सा हिस्सा टुकड़ा. यह लगानेवाला (अगर आप प्रतिरूप विश्लेषण के लिए अपनी आँख वर्गों का उपयोग करने का इरादा नहीं या छोटे क्लोन के साथ आंख में कटौती) की पहुंच को बढ़ाता है. छू और बरकरार आँख है कि बाद में sectioned जाएगा हानिकारक से बचें.
आंख बंद कटौती की सतह पर चिमटी या स्केलपेल के साथ सिर टच और glutaraldehyde / फॉस्फेट लगानेवाला में बर्फ पर सिर हस्तांतरण (अक्सर सिर लगानेवाला के शीर्ष पर फ्लोट) dissected सिर glutaraldehyde तय करने में अब के लिए नहीं रखा जाना चाहिए 15 मिनट आज़मियम के अलावा पहले की तुलना में. इसी जीनोटाइप के अन्य मक्खियों के साथ 1.2 1.5 चरणों को दोहराएँ.

2. फिक्सेशन और एम्बेडिंग (सभी चरणों के लिए दस्ताने का उपयोग करें!)

Eppendorf अपकेंद्रित्र में flyheads 10,000 rpm पर 1 मिनट के लिए स्पिन. अगर सिर सिंक नहीं भी जारी रखें.
Oso ₄ समाधान के 200μl जोड़ें और कम से कम 30 मिनट और बर्फ पर 1 घंटे के लिए ठीक है.
एक पाश्चर विंदुक का प्रयोग, समाधान / glutaraldehyde आज़मियम (उचित अपशिष्ट निपटान प्रक्रियाओं का उपयोग करने के लिए सुनिश्चित करें!) को हटाने और 200μl आज़मियम समाधान के साथ बदलें. बर्फ पर 1-6 बजे के लिए सेते हैं. हमेशा यह सुनिश्चित सिर पूरी तरह से तरल के साथ कवर कर रहे हैं और दूर के रूप में सिर या आँखें पतन हो सकता है कभी नहीं समाधान के सभी!
एक पाश्चर विंदुक का प्रयोग, लगानेवाला त्यागें, बर्फ पर कम से कम 5 मिनट के लिए 0.5-1ml 30% इथेनॉल और सेते जोड़ने (उचित अपशिष्ट निपटान प्रक्रियाओं का उपयोग करें के बाद से इथेनॉल अब आज़मियम शामिल करने के लिए सुनिश्चित करें!).
50%, 70% (80%), 90% और दो बार 100% इथेनॉल के साथ उपरोक्त कदम दोहराएँ. इलेक्ट्रॉन सूक्ष्म विश्लेषण के लिए आंखों का उपयोग कर यदि 80% इथेनॉल कदम शामिल है. 70% धोने कदम के बाद, नमूने बर्फ से हटाया जा सकता है है.
इथेनॉल propylene ऑक्साइड (अस्थिर, हुड में काम करने के लिए जारी रखने के) की एक समान मात्रा के साथ बदलें. कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए सेते हैं.
Propylene ऑक्साइड धोने दोहराएँ. अगर समानांतर में कई जीनोटाइप प्रसंस्करण propylene ऑक्साइड के वाष्पीकरण के कारण आँखों के collapsing से बचने के बैचों में कार्य.
Propylene ऑक्साइड के सबसे निकालें और एक प्लास्टिक हस्तांतरण विंदुक का उपयोग, 500μl एक 1:1 राल के बारे में जोड़ने के लिए: propylene ऑक्साइड समाधान. कमरे के तापमान पर रातोंरात संतुलित करना.

3. और molds में एम्बेड व्यवस्था

सुनिश्चित करें कि सभी molds करने के लिए अपने अलग जीनोटाइप का ट्रैक रखने के लिए चिह्नित कर रहे हैं, तो 100% राल के साथ molds भरें. (Molds के सतह पर कोई 'ऊंची पहाड़ियों जब सतह आचारण भर में सीधे देख) उमड़ाना मत करो. EM विश्लेषण के लिए कठिन राल का उपयोग करें.
एक हस्तांतरण विंदुक का प्रयोग, सिर से 50% राल निकालने के लिए, 100% राल के साथ की जगह है, और कमरे के तापमान पर 3-4 घंटे के लिए सेते हैं. के रूप में सिर राल के साथ घुसपैठ कर रहे हैं, वे ट्यूब के नीचे डूब जाएगी.
एक दन्तखुदनी कि एक कठिन सतह के लिए एक बार एक छोटे हुक बनाने पर मारा गया है का उपयोग करना, समय पर एक मोल्ड में एक सिर हस्तांतरण.
प्लेस अपने विदारक राल फैल के खिलाफ की रक्षा की गुंजाइश के क्षेत्र में काम कर रहे पर एल्यूमीनियम पन्नी.
एक विदारक सुई का प्रयोग और अपने दायरे, ज़ुल्फ़, हालांकि राल में सिर थोड़ा देख रहे हैं और ध्यान से यह आचारण के नीचे करने के लिए कदम बताया अंत के करीब.
ध्यान से बरकरार (!) (या अपने भविष्य सेक्शनिंग विमान अगर आप को पार वर्गों है चाहता हूँ) गर्दन आंख की सतह आचारण के सामने की दीवार के साथ संरेखित नीचे, आँख के स्पर्शरेखा सतह मोटे तौर पर एक आधा सिर रखना सुनिश्चित करें मोल्ड दीवार से दूर व्यास. दुर्लभ मामलों में, एक आँख गिर जो आंख की सतह और सिर छल्ली के बीच एक खाली जगह के रूप में देखा जा सकता है है. यदि आप एक ढह आँख है, यह 7 ^वें स्पेयर आँख के साथ की जगह.
सभी प्रमुखों के साथ दोहराएँ. एक बार सभी संरेखण के साथ किया है, सभी आँखें फिर से जाँच करने के लिए यकीन है कि वे जब आप राल की सुई निकाल दिया स्थानांतरित नहीं किया है.
यदि आप चलती आँखें जब आप विदारक सुई निकालने के साथ परेशानी है, आंख के रूप में वांछित की स्थिति, जल्दी से सुई सिर से थोड़ा दूर वापस लेना और फिर धीरे से सुई पूरी तरह से हटाने.
Molds 70 में रातोंरात सेंकना डिग्री सेल्सियस

4. ट्रिमिंग करने वाली और सेक्शनिंग

नए नए साँचे झुकने से molds से कठोर ब्लॉक निकालें, कश्मीरeeping ट्रैक जो की ब्लॉक मेल खाती है जो जीनोटाइप (छोटे जगमगाहट शीशियों में जैसे स्टोर).
Trimming के लिए, एक चक अपने सूक्ष्म तक्षणी कि चेहरा मुहिम शुरू की है Plexiglas या एल्यूमीनियम का एक ब्लॉक पर के लिए उपयुक्त का उपयोग करें. ब्लॉक के लिए ट्रिम, चक में आंख, माउंट.
के तहत एक Teflon लेपित रेजर का उपयोग कर विच्छेदन गुंजाइश बड़े, ध्यान केवल अपने ब्लॉक के ऊपर परत में कटौती. यह एक स्पष्ट सतह जो हालांकि आप आँख देख सकते हैं और इस प्रकार सेक्शनिंग के भविष्य के विमान की भविष्यवाणी कर सकते हैं चाहिए छोड़ देंगे. अपनी उंगलियों को काटने से बचें!
सिर के दोनों पक्षों पर और मोर्चे पर अतिरिक्त प्लास्टिक कट (यानी क्या आचारण के ऊपर हो सकता है जब आँखों aligning) जब तक सिर के चारों ओर प्लास्टिक की सबसे काट रहा है. यह सबसे अच्छा है धीरे धीरे बंद प्लास्टिक के कई पतली परत के काटने से सिर दृष्टिकोण.
एक साफ धार का प्रयोग, ध्यान से आँख के ऊपर से सही विमान के बाद अनुभाग (tangentially आमतौर पर आंख के लिए, मूल सतह आचारण के लिए एक मामूली कोण पर) के लिए इच्छित में पतली परत को हटाने.
जारी रखें जब तक तुम सिर्फ दूर आँख के बाहर की सतह में कटौती शुरू. सुनिश्चित करें कि आप ब्लेड के स्वच्छ क्षेत्रों का उपयोग करने के लिए एक चमकदार, पारदर्शी सतह है, जो सूक्ष्म तक्षणी आसान संरेखण बनाता प्राप्त.
रेज़र ब्लेड पर बचाने के लिए, कच्चे तेल ब्लॉक के किनारों के आसपास trimming के लिए पुराने ब्लेड का उपयोग करें और ठीक trimming (पहली कट और 4.6) के लिए एक ताजा ब्लेड का उपयोग करें. अंत में आप एक थोड़ा झुका, कट ऑफ है कि अपने भविष्य के अनुभाग विमान से मेल खाती शीर्ष के साथ एक तीन तरफा पिरामिड होगा.
सूक्ष्म तक्षणी में ब्लॉक पर्वत. वास्तविक सेक्शनिंग सूक्ष्म तक्षणी के प्रकार पर निर्भर भिन्न है और वर्णित नहीं होगा विस्तार में यहाँ होगा. हम एक histo गुणवत्ता वाले हीरे के लिए 0.5 के लिए 1μm वर्गों में कटौती चाकू के साथ एक MT5000 Sorvall का उपयोग करें. प्रकाश सूक्ष्म विश्लेषण के लिए, अनुभाग मोटाई में मामूली बदलाव की बात नहीं है. यदि सेक्शनिंग क्लोन + व्हाइट transgene, किसी अनुभाग द्वारा चिह्नित 1μm वर्गों को पर्याप्त वर्णक अनुभाग के प्रति rhabdomeres (छवि 2) के लिए आसन्न granules है सुनिश्चित करने के लिए.
धारा पानी पर तैरने लगते हैं. एक rotating आंदोलन में पानी की सतह के नीचे से एक लकड़ी के क्यू - टिप के अंत के साथ एक चपटी पहले 20-30 वर्गों लिफ्ट और पानी की एक बूंद में उन्हें एक जिलेटिन लेपित गिलास स्लाइड (डिग्री सेल्सियस के आसपास 100 एक गर्म थाली पर रखा पर स्थानांतरण ).
एक और 20-30 वर्गों के साथ दोहराएँ. रुको जब तक पानी सुखाया गया है और वर्गों स्लाइड करने के लिए छड़ी. आमतौर पर, 3 आँखों के वर्गों Twp पंक्तियों से तीन स्तंभों (तीन आँखें) (ऊपर / नीचे वर्गों) में व्यवस्था की एक स्लाइड पर अच्छी तरह से फिट है.

5. धुंधला और सूक्ष्म विश्लेषण

जब तक सेक्शनिंग क्लोन, दाग वर्गों. एक हीटिंग सेट ब्लॉक पर वर्गों के साथ 90 पर प्लेस स्लाइड डिग्री सेल्सियस एक 30 मिलीलीटर सिरिंज स्लाइड पर एक 0.22μm फिल्टर करने के लिए संलग्न से Toluidine नीले रंग धुंधला समाधान बांटना और 10 सेकंड के लिए दाग. तुरंत आसुत जल के साथ बड़े पैमाने पर कुल्ला. एयर सूखी.
एक प्लास्टिक हस्तांतरण विंदुक का उपयोग, DPX के 3 बूँदें स्लाइड पर मध्यम बढ़ते वितरित और एक coverslip साथ कवर. 3 ऑफ डाइम्स के साथ शीर्ष और बढ़ते मध्यम कठोर (जैसे कमरे के तापमान पर रातोंरात) चलो.
एक रोशनी खुर्दबीन के साथ छवि. एक अच्छा अनुभाग खोजने और तब विस्तृत विश्लेषण और photographing के लिए एक 63x तेल विसर्जन लेंस पर स्विच करने के एक 5x या 10x लेंस का प्रयोग करें. हम आम तौर पर चरण विपरीत सेटिंग्स का उपयोग करें, लेकिन darkfield प्रकाशिकी के रूप में अच्छी तरह से काम करते हैं.

6. प्रतिनिधि परिणाम:

सबसे अक्सर है, आँखों में बाहरी किसी न किसी आँख phenotypes एक आनुवंशिक स्क्रीन के भाग के रूप में या या तो सामान्य नेत्र संरचना या polarity को प्रभावित करने के लिए जाना जाता है जीन के साथ आनुवंशिक बातचीत के परीक्षण की प्रक्रिया में पता चला की एक विस्तृत विश्लेषण के लिए प्लास्टिक में एम्बेडेड रहे हैं. आँख वर्गों के विशिष्ट परिणाम 3 चित्र में दिखाया जाता है. जंगली प्रकार ommatidia (छवि 3A) पूर्ण फोटोरिसेप्टर रंगद्रव्य कोशिकाओं की एक जाली से घिरा हुआ पूरक दिखा. इसके विपरीत, एक उत्परिवर्ती (stbm, उर्फ ⁷ वैन - गाग) तिर्यकदृष्टि में, ommatidial polarity खो दिया है और है, भले ही पूरा फोटोरिसेप्टर पूरक मौजूद है, रोटेशन और दाहिनी ओर यादृच्छिक (3B छवि) कर रहे हैं. इसके अलावा, के बाद stbm sectioned एलील ओ में था ^- पृष्ठभूमि, वर्णक granules छवि में याद कर रहे हैं. 3B. चित्रा 3C एक प्रतिरूप विश्लेषण के एक उदाहरण से पता चलता है कि ड्रोसोफिला रो kinase (drok) ommatidial रोटेशन के लिए के रूप में के रूप ^में अच्छी तरह से 8 आँख के संरचनात्मक अखंडता के लिए आवश्यक है. जंगली में उत्परिवर्तन homozygous drok ² क्लोन रंगद्रव्य कोशिकाओं और rhabdomeres (आमतौर पर में वर्णक के अभाव से पहचाना जा सकता है, क्लोन अंधा FLP और एक जोरदार व्यक्त सफेद मार्कर एक पृष्ठभूमि w पूरक जीन के साथ एक पी - तत्व का उपयोग प्रेरित कर रहे हैं प्रकार और विषमयुग्मजी ऊतक). यह इस प्रकार वर्णक की कमी से उत्परिवर्ती क्षेत्रों की पहचान करने के लिए संभव है. सेल R-CE में pigmentation के स्वायत्तता के कारणऔर LLS पहले व्यक्ति आर कोशिकाओं के जीनोटाइप (चित्र 3C में arrowheads देखें) निर्धारित किया जा सकता है उल्लेख किया.

चित्रा 1 ड्रोसोफिला आँख जीव के लिए एक शानदार मॉडल के बाद से प्रणाली है, आँख जंगली प्रकार (ए) के चिकनी सतह के लिए इसके विपरीत में, एक उत्परिवर्ती आँख की सतह के बाहर अक्सर (बी) किसी न किसी प्रकार, अंतर्निहित आँख phenotypes के संकेत है . सभी आंकड़े में, पूर्वकाल छोड़ दिया करने के लिए है और पृष्ठीय ऊपर है. डॉ. जेनिफर Curtiss, NMSU, लास Cruces समुद्री मील दूर है, संयुक्त राज्य अमेरिका की छवियाँ शिष्टाचार.

चित्रा 2 एकल sectioned ommatidia की हल्की सूक्ष्म छवियों वर्णित विधि का उपयोग . Ommatidium प्रति एक समय में केवल सात आर कोशिकाओं दिखाई R8 के शीर्ष पर R7 झूठ के बाद से कर रहे हैं. (ए, ए ') (R7 के स्तर पर, R7 के सेल शरीर R1 और R6 एक में पीले तीर) के बीच पता चला है' . इसके विपरीत, R8 स्तर (बी) में, R8 के सेल शरीर R1 और R2 (बी में पीले तीर ') के बीच पता चला है . ब्लू arrowheads वर्णक granules कि एक वर्णक सेल स्वायत्त मार्कर के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है निशान.

चित्रा 3 जंगली प्रकार (ए) (बी) stbm और drok (सी) उत्परिवर्ती वयस्क ड्रोसोफिला आँखों के माध्यम से स्पर्शरेखा वर्गों. वर्गों नीचे Schematics ommatidia के polarity (तीर के लिए देख सकते हैं (ए)) से संकेत मिलता है. फोटोरिसेप्टर पूरक में दोष के साथ सर्किलों ommatidia प्रतिनिधित्व करते हैं. पीला लाइनों समरूपता के पृष्ठीय / वेंट्रल लाइन (भूमध्य रेखा) का प्रतिनिधित्व करते हैं. जंगली प्रकार (ए) के ommatidia अच्छी तरह से उन्मुख करने के लिए इसके विपरीत में, planar संगठन stbm उत्परिवर्ती (बी) में खो दिया है. ध्यान दें कि stbm उत्परिवर्ती के अनुभाग दिखाया उत्परिवर्ती पृष्ठभूमि ^- अपने w के कारण वर्णक का अभाव है. (सी) क्योंकि drok म्यूटेशनों घातक हैं, वे क्लोनों में विश्लेषण किया है. इस प्रकार, pigmented कोशिकाओं जंगली प्रकार या विषमयुग्मजी (भरे नीले arrowheads) हैं, जबकि आर कोशिकाओं की कमी वर्णक (खुला नीले arrowheads) homozygous उत्परिवर्ती हैं. रोटेशन दोषों के अलावा, drok म्यूटेंट भी आर कोशिकाओं के लापता या अधिक संख्या सहित संरचनात्मक दोषों दिखा. ध्यान दें कि प्रतिरूप विश्लेषण के लिए, वर्गों वर्णक granules obscuring से बचने के दाग नहीं हैं.

Discussion

मॉडल जीव, आनुवंशिक जीन सहित मानव उच्च eukaryotes में अत्यधिक संरक्षित संकेत दे रास्ते के अधिकांश के लिए आवश्यक परिवारों के संस्थापक सदस्यों में से कई की पहचान करने के लिए नेतृत्व स्क्रीन के रूप में ड्रोसोफिला का उपयोग करना. के बाद से, प्रयोगशाला परिस्थितियों में, अस्तित्व के लिए एक कार्यात्मक आँख नगण्य है, नेत्र उपन्यास जीन कार्यों की खोज और आनुवंशिक नेटवर्क के आकलन के लिए एक विशेष रूप से अच्छी तरह से अनुकूल ऊतक है. इस प्रकार वर्णित विधि का उपयोग कर उड़ आँख के Ultrastructural विश्लेषण मौलिक विकास और रोग के लिए प्रासंगिक खोजों के लिए नेतृत्व किया. प्रारंभ में, एकल कक्ष clonal विश्लेषण एक्स - रे प्रेरित ज्ञात बारीकी से जुड़े सेल स्वायत्त पीछे हटने का मार्कर के साथ संयुक्त क्लोन का उपयोग कर प्रदर्शन किया था. हाल ही में, FLP / FRT प्रणाली की उपलब्धता को क्लोन उत्पन्न बहुत आँख ^6,9 वर्गों में घातक परिवर्तन के प्ररूपी विश्लेषण में मदद की है.

आँख वर्गों के विश्लेषण स्पर्शरेखा यहाँ वर्णित वर्गों तक सीमित नहीं है. अगर वांछित, सिर molds में किसी भी अभिविन्यास में गठबंधन किया जा सकता है और अनुप्रस्थ वर्गों लामिना और मज्जा के रूप में इस तरह के सिर में गहरी परतों का अध्ययन करने के लिए प्राप्त किया जा सकता है. यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल इस तरह आंख और सिर संरचनाओं ड्रोसोफिला वयस्कों के विश्लेषण के लिए एक बहुमुखी विधि है.

Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

मैं छवि में चित्रों के लिए डॉ. जेनिफर Curtiss धन्यवाद देना चाहूंगा. 1 और जेरेमी Fagan और समीक्षकों पांडुलिपि पढ़ने के लिए डॉ. फ्लोरेंस मार्लो. हमारा काम NIH अनुदान 1R01GM088202 द्वारा समर्थित है.

Materials

General equipment:

For general fly husbandry see ¹⁰
Standard dissection microscope (e.g. Nikon SMZ-645 Stereo Zoom Microscope), preferably with a ring light source to prevent casting a shadow of your hands.
CO₂ Fly pad, covered with 3MM Whatman paper to provide protection against dirt during dissection.
Gelatin coated slides: dissolve 10g gelatin and 1g CrKSO₄x 12 H₂O in 1L water on a heating plate (bring almost to a boil, takes approximately 2 hrs). Dip well washed (soap) and rinsed (dH₂O) slides in holders into gelatin solution and air-dry covered with foil overnight.
Heating oven (70°C; old vacuum ovens that were used for nitrocellulose filter drying are well suited for this purpose).
Microtome capable of ultrathin sectioning (0.5-1 μm thick sections), e.g. those used by electron microscopy facilities. We use a Sorvall MT5000 Ultramicrotome with a Histo quality diamond knife. Glass knives also work.

Fixation solutions:

Prepare a stock solution of 0.2 M Sodium Phosphate buffer, pH 7.2.
Prepare 2% glutaraldehyde in 0.1M Sodium Phosphate buffer, pH 7.2 (can be stored at 4°C for 4 weeks). Make at least enough to have 200μl per genotype you want to embed. Keep on ice.
Osmium solution: 2% OsO₄ in 0.1M Sodium Phosphate buffer, pH 7.2. Make only enough to have 200μl per genotype you want to embed, since the solution cannot be stored. Keep on ice.

Glutaraldehyde and OsO₄ are highly toxic and should be handled with extreme care in a well-ventilated hood. Use filter tips when handling OsO₄ to prevent blackening of your pipette.

Dehydration: Make 30%, 50%, 70%, (80%), 90%, and 100% ethanol solutions. Preferably cool 30%, 50%, 70% ethanol on ice before use.

Staining solution:

1% Toluidine-blue in 1% Borax.

	Soft	Hard
Resin A	54g	50g
Hardener B	44.5g	50g
Accelerator C	2.5g	1.75g
Plasticizer D	10g	0.75g

Table 1. Resin preparation

To prepare the resin, carefully, but thoroughly mix all ingredients in a plastic beaker using a magnetic stirrer with a large stir bar. Avoid bubbles. After mixing, aliquot in standard scintillation vials or similar containers and freeze at -20°C. Use soft resin for all applications unless your EM facility asks for the harder formulation. Use gloves to handle resin (carcinogenic in its unpolymerized form). To polymerize resin on equipment and waste, bake at 70°C overnight. Waste may then be safely discarded and equipment cleaned and reused. Spilled unpolymerized resin can be cleaned with isopropanol.

Reagent	Supplier	Catalog number
Fly pad	e.g. Genesee	59-119
Glutaraldehyde	Sigma	G7526-10 X 10 ML
OsO₄	Polysciences,Inc.	0972A-20
Propyleneoxide	Fisher	04332-1
Scalpel handles, for #3	Fisher	22080046
Scalpel blades #11	Fisher	08-916-5B
Transfer pipettes	Fisher	13-711-7M
Durcupan (R) ACM resin	Sigma (Fluka)	44610-1EA
Steel dissecting needle	Fisher	S17346
BEEM flat embedding mold	Electron Microscopy Sci.	70904-12
Teflon coated razor blades	Electron Microscopy Sci.	71970
Q-tip (sterile swabs)	Fisher	14-959-81
Glass slides	Fisher	12-550-143
Cover slips No 1, 22X60 mm	Fisher	12-531K
Gelatin	Fisher	ICN96010280
Cr(III) K SO₄ dodecahydrate	Sigma	243361
Diamond Histo knife, 6mm	Diatome US	60-His
Toluidine Blue O	Fisher	BP107-10
Borax (Na-Tetraborate)	Fisher	AC20629-1000
DPX mounting medium	Sigma	44581-100ML