G 단백질 결합 수용체에 작용제 활동 Quantifying

요약

활성 상태 작용제의 친화력이 상수 계산하는 방법 ( K _{B) G 단백질 결합 수용체의이 설명되어 있습니다. 분석의 절대 또는 상대 조치를 제공합니다 K B 제정 수용체​​ 활성화는 측정 여부에 따라 다릅니다. 우리의 방법은 수용체 활성화 다양한 응답 스트림에 적용됩니다.}

초록

작용제는 G 단백질 결합 수용체 (GPCRs)의 인구를 활성화하면 세포 또는 조직의 반응에 culminates 신호 경로를 elicits. 이 과정은 하나의 수용체, 수용체의 인구, 또는 스트림 응답의 수준에서 분석할 수 있습니다. 여기 하나의 수용체의 활성 상태에 대한 지속적인 작용제 선호도의 추정치를 얻을 수있는 스트림 응답을 분석하는 방법을 설명합니다.

수용체는 quantal 스위치로 동작되는 활성 및 비활성 상태 (그림 1) 사이의 대체. 활성 상태가 특정 G 단백질 신호 또는 기타 파트너와 상호 작용합니다. 리간드의 부재에서 비활성 상태 predominates. 작용제의 바인딩은 활성 상태 (K _B)에 대한 상수의 친화력은 비활성 상태 (K)에 대한보다 훨씬 더 때문에 수용체가 활성 상태로 전환됩니다 그 확률을 증가시킵니다. 의 요약인구에있는 수용체의 모든 임의의 출력 시간 수용체 활성화의 일정 수준을 산출. 절반 최대한 수용체 활성을 도출 작용제의 농도의 상호는 관찰 친화 상수 (K _obs)에 해당되며, 활성 상태로 작용제 - 수용체 단지의 분율은 효능 (ε) (그림 2)로 정의됩니다.

GPCRs의 스트림 응답을 분석하는 방법은 K _obs 및 작용제의 ^1,2의 상대적 효능의 견적을 설정하는 것이 개발되었습니다. 이 보고서에서는, 우리는 다른 작용제의 상대 작용제 K _{B 값을} 추정이 분석을 수정하는 방법을 보여줍니다. 제정 활동을 전시 assays 위해, 우리는 M ^-1 절대 단위로 K _B를 추정하는 방법을 보여줍니다.

작용제 농도 - 반응 곡선 ^3,4을 분석 우리의 방법으로 구성되어 있습니다운영 모델 ^5를 사용하고 글로벌 비선형 회귀니다. 우리는 소프트웨어 응용 프로그램, 프리즘 (GraphPad 소프트웨어, 주식, 샌디에고, CA)을 사용하여 프로 시저를 설명합니다. 분석 K의 제품 _obs과 효능 (τ)에 비례 매개 변수 견적을 산출. 다른의에 의해 조각나 작용제의 τK _obs,의 추정치는 K _B의 상대 측정 (RA _I) ^6입니다. 제정 활동을 전시하는 수용체에 대한, 그것은 무료 수용체 복합의 효능 (τ _{치세요)에} 비례 매개 변수를 추정하는 것이 가능합니다. 이 경우, 작용제의 K _{B 값은} τK _obs / τ _치세요 ³ 동일합니다.

우리의 방법은 수용체 subtypes에 대한 작용제의 선택도를 결정하고 다른 G 단백질을 통해 작용제 - 수용체의 신호를 quantifying하는 데 유용합니다.

프로토콜

1. 작용제 농도 - 반응 곡선의 측정 : 없음 제정 활동

1. 상대 작용제 K _{B 값의} 추정 (RA _I)에 대한, 적어도 두 작용제 농도 - 반응 곡선의 연속이 필요합니다. GPCR의 기능 반응에 대한 시험 관내 분석의 모든이 작용제의 농도가 제어 및 수용체 mediates의 단일 유형의 응답 수를 제공 측정할 수 있습니다. 적합 셀 기반 assays 캠프 ^4,7의 측정 및 재조합 수용체를 표현하는 세포 라인 inositolphosphate 축적 ^8,9를 포함합니다. 전체 조직 assays의 예는 평활근 ¹⁰ M ₂ muscarinic 수용체와 아트리움 ¹¹ 왼쪽 필드 자극 쥐 수축에 β ₁ - adrenoceptor - 중재 변경 수축의 측정을 포함합니다.
2. 매우 효과 작용제를 포함하여 분석을 위해 agonists 일련의 선택(예 : 내생 리간드). 주어진 실험에서 각 작용제에 대한 전체 농도 - 반응 곡선을 측정합니다. agonists의 수가 한 실험에서 분석을 완료하려면 너무 큰 경우 subgroups, 하나의 실험 agonists의 관리 번호로 구성....

토론

RA _I (상대 K _{B 값)을} 계산하는 우리의 방법은 작용제 농도 - 반응 곡선의 측정을 필요로하기 때문에이 곡선이 측정 언제든지, 우리의 분석을 할 수 있습니다.

실험 준비 (예 : 세포 또는 조직)의 응답에 매일 변동이 큰 경우, 각각의 농도 - 반응 곡선의 응답 성능은의 표준 작용제의 "상위"추정 상대적 정상화 수있는 매일 매일의 실험. 상위 및 로그 EC ₅₀ 예상대로 섹션 2와 5에서 설명하는 회귀 분석에 의해 표준 작용제의 각 복제 농도 - 반응 곡선에 대한 추정된다. 주어진 하루에 작용제 농도 - 반응 곡선의 모든 응답 값이 그날의 표준 작용제의 상위 평가에 상대적으로 정상화됩니다. beginn 위에서 설명한대로 이러한 정규화된 데이터는 분석 아르제 3 ING.