살아있는 세포의 플라즈마 막의 형광 단백질 지질 뗏목의 파티션을 알아내기 위해 기술이 설명되어 있습니다. 그것은 지질 보트 내부 또는 외부에있는 단백질의 확산시기에 불균형을 이용합니다. 취득이 통제 조건이나 약물 이외 후에 동적으로 수행할 수 있습니다.
이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.
방법 논문
지질 뗏목의 결정은 형광 상관 분광학 (FCS)에 의해 살아있는 세포에서 Fluorescently 태그가 추가된 프로브의 파티션
이 논문에서
요약
초록
한 것 같아요 년 동안 세포 점막이 동질하지 않습니다 그들의 기능을 발휘하기 위해 microdomains에 의존하는 개념이 널리 인정되고있다. 지질 보트는 콜레스테롤과 sphingolipids에 풍부한 멤브레인 microdomains입니다. 그들은 같은 신호 전달과 같은 셀룰러 생리적 과정에 역할을하고, 인신 매매 1,2뿐만 아니라 바이러스성 또는 세균성 감염과 neurodegenerative 질병 셋 등 여러 질병의 주요 선수가 될 것으로 생각됩니다.
그러나 그들의 존재는 아직 논란 4,5의 문제입니다. 사실, 지질 뗏목 크기 때문에 그들의 직접적인 이미지를 precluding, 지금까지 기존의 현미경 (200 nm의 정도)의 해상도 제한을, 약 20 nm의 6 것으로 추정되었습니다. 지금까지 지질 보트 내부에 관심 단백질의 파티션을 평가하는 데 사용되는 주요 기술은 세제 강한 세포막 (DRMs) 항체와 고립과 공동 패치했다. 비록 널리 사용 베카자신보다는 쉬운 구현의 사용,이 기술은 유물하는 경향이 있었다 그래서 7,8를 비난했다. 기술 개선 따라서 이러한 유물을 극복하는 생활 세포에 지질 보트 파티션을 알아내기 수있을 필요가 있었다.
여기에서 우리는 살아있는 세포의 플라즈마 막의 fluorescently 태그가 추가된 단백질 또는 lipids의 지질 보트 파티션의 민감한 분석 방법을 제시한다. 이 방법은, 형광 상관 분광학 (FCS) 되나, 지질 보트 내부 또는 외부에있는 형광 프로브의 확산 시간의 차이에 의존합니다. 사실, 같은 인공 세포막과 세포 배양 모두에서 입증, 프로브는 훨씬 빠르게 외부 조밀한 지질 보트 9,10 내부보다는을 무마 것이다. 확산 시간을 확인하려면, 분 형광 변화는 (그림 공촛점 현미경으로 세포의 플라즈마 막에 위치, 초점 부피 (약 1 femtoliter)에서 시간의 함수로 측정1). 자기 상관 곡선 그러면 이러한 변화에서 그려진하고 적절한 수학적 확산 모델 11가 장착되어 수 있습니다.
FCS는 그들이 fluorescently 태그만큼 다양한 프로브의 파티션 지질 뗏목을 결정하는 데 사용할 수 있습니다. 형광 태그는 형광등 융합 단백질의 표현이나 형광 리간드의 바인딩에 의해 형성될 수 있습니다. 또한, FCS는 등 최근 12 설명된 인공 세포막과 세포 라인에서뿐만 아니라 차 문화에서뿐만 아니라 사용할 수 있습니다. 또한 약물 외에이나 멤브레인 지질 조성의 변화 12 이후 지질 뗏목 파티션의 역학을 수행하는 데 사용할 수 있습니다.
프로토콜
1. FCS 설치의 보정
- 공촛점 현미경, 레이저, 컴퓨터, 온도에 대한 보육 및 CO 2 제어를 시작합니다.
- SPAD는 (단일 광자의 애벌 란시 다이오드)에 있고 SPAD 내부의 형광 필터가 잘 샘플에 적합되어 있는지 확인하십시오. SPAD는 시간에 동기화되었는지 확인합니다. 당신의 SPAD 설정이 인수 준비에 한번에만 FCS 소프트웨어를 시작합니다 조심하십시오.
- 1 μg / ML (17.5 NM)의 농도에 도달하기 위해 PBS에 희석 콜레라 독소-Alexa488의 새로운 솔루션을 준비합니다.
- 현미경의 내부 검색을 사용하여 솔루션의 공촛점 이미징을 최적화합니다.
- 스캔 모드를 가리 키와 솔루션 예제에서 지점을 선택하여 전환합니다. 레이저 조명의 기간은 (> 5 분)하여 FCS의 인수를 수행할 충분히 있는지 확인하십시오.
- SPAD에 의한 외부 감지와 FCS 소프트웨어로 전환합니다. 당신의 형광 신호를 모니터링하고 잘 수이인지 확인SPAD에 테드 (충분한 신호 그런데 채도, 10 50 000 카운트로 000 / s는 상관 없습니다.) 필요한 경우, Z 위치, 이득 및 / 또는 정확한 형광 신호를 달성하기위한 레이저 전원을 수정합니다.
- 삼십초 측정의 1....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
토론
FCS 메서드는 여기에 제시된 것은 살아있는 세포에 대한 관심의 형광 프로브의 지질 뗏목 파티션의 민감하고 빠른 분석을 가능하게합니다. FCS는 단일 광자 계수 장치의 감도와 공촛점 현미경의 국산화에의 정확성을 결합한 제품입니다. FCS 및 표준 생화 학적 기법의 주요 차이점은 DRMs 절연 또는 공동 패치의 경우는 같이 FCS가 대상의 지질 보트 파티션이 아닌 상대적인 파티션의 절대적인 판단을 가능하게한다는 것입니다.
FCS 데이터의 수집은 각 샘플에 대해 약 5 분 (30 초 10 인수) 소요되며 일상 생화 학적 기법에 비해 따라서 상당히 빠른 속도이다. 이 급속도는 가능한 시간에 약물뿐만 아니라 인해 발생할 수있는 지질 뗏목 파티션의 섭동를 따릅니다 수 있습니다. 피팅에 대한 서로 다른 모델을 결정 훑어해야 그러나 상관 곡선의 분석은 조금 까다롭습 될 수 있습니다가장 정확한 하나. 또한, 수집하는 동안 photobleaching 것은이 유물을 초래할 수 있으므로 피해야한.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
공개 사항
관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.
감사의 글
이 작품은 회사 직원 Nationale 드 라 공들인 (ChoAD)에서 교부금에 의해 지원되었다. 우리는 또한 그들의 재정 지원을위한 Fondation ICM (Institut 뒤 Cerveau 동부 표준시 드 라 Moelle)에 감사를드립니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 시약의 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
| 콜레라 독소의 subunit B-알렉사 488 | Invitrogen | C-34775 | MW (pentamer) = 57kg / 몰 |
| 공촛점 현미경 | Leica | SP5 | |
| 온도 및 CO 2 제어를위한 인큐베이터 | 생활 이미징 서비스 | 큐브와 상자 | |
| SPAD (단일 광자의 애벌 란시 다이오드) | MPD (마이크로 광자 장치) | PDM 세리 (100 μm의 민감한 영역) | |
| 하이 패스 488 nm의 필터 | Semrock | 에지 BrightLine 긴 패스 필터를 차단하는 488 nm의 부품 #ails.aspx? ID = FF01-488/LP-25 "대상 ="_blank "> FF01-488/LP-25 | |
| FCS 검출 장치 | Picoquant | Picoharp 300 모듈 | |
| 수집 및 자동 상관 관계 소프트웨어 | Picoquant | SymPhoTime | |
| 피팅 소프트웨어 | OriginLab | OriginPro8 |
참고문헌
- Brown, D. A., London, E. Functions of lipid rafts in biological membranes. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 14, 111-136 (1998).
- Simons, K., Gerl, M. J. Revitalizing membrane rafts: new tools and insights. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 11, 688-699 (2010).
- Simons,....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재인쇄 및 허가
