Summary
Использование Xmap микросфер Luminex корпорации технологии, мы разработали Мультиплексированный Флуорометрический иммуноферментного анализа (MFIA) для серологического различных видов лабораторных животных. MFIA представляет собой суспензию микрочипов, где антиген, управление ткани или иммуноглобулины, которые ковалентно связаны с цветными полистирольных микросфер. Метод MFIA тестирования, а также различные важные темы рассматриваются.
Abstract
Для обеспечения качества животной модели, используемые в биомедицинских исследований мы разработали ряд диагностических стратегий тестирования и методов, чтобы определить, если животные были подвержены случайным инфекционные агенты (вирусы, микоплазмы и других прихотливых микроорганизмов). Инфекции иммунокомпетентных животных, как правило, преходяще, но сыворотке антител к инфекции часто могут быть обнаружены в течение нескольких дней до нескольких недель и сохраняется на протяжении всей жизни хозяина. Серология является основной диагностической методологии лабораторных животных, которые контролируются. Исторически косвенные иммуноферментного анализа (ИФА) была основным методом скрининга для серологического. ELISA выполняется как singleplex, в которых один микробной реакции антиген-антитело измеряется на лунку. По сравнению MFIA выполняется как мультиплексированных анализа. Поскольку микросферы пришел в 100 различных наборов цветов, целых 100 различных анализов могут быть выполнены Simultaneously в одну лунку. Это новшество уменьшает количество сыворотки, реагенты и расходные материалы необходимые для рутинного тестирования в то время как увеличение количества информации, полученной от одного теста хорошо. Кроме того, мы можем включить несколько внутренних бисером контроля для проверки образца и пригодности системы и тем самым обеспечить точность результатов. Они включают в себя управление ткани и IgG анти-тест сывороточных иммуноглобулинов видов (αIg) покрытием борта наборы для оценки пригодности образца. Как и в ИФА и РИФ, ткани управления обнаруживает неспецифического связывания сывороточных иммуноглобулинов. Контроль αIg (контроль сыворотки) подтверждает, что сыворотка была добавлена и содержит достаточной концентрации иммуноглобулинов IgG, в то время как контроль шарик (контроль пригодности системы), покрытые сывороточных иммуноглобулинов видов, показывает, что меченые реагенты и Luminex читателя функционируют должным образом.
Protocol
1. Объяснение процедуры MFIA (рис. 1)
- MFIA требует Charles River в антигенным покрытием полистирольных микросфер (бисер), тест сыворотки, обозначенные реагентов (BAG, SPE) и буферы (первичный разбавитель, анализа буфера).
- Реагенты добавляются поэтапно в лунки 96-луночных фильтр нижней пластин микротитрования.
- MFIA выполнена в виде гетерогенных инкубации смысл теста следуют фильтр промывания для удаления несвязанных компонентов сыворотки или маркированы реагентов. Промывочный раствор добавляют к пластине скважины удаляют отсасыванием через фильтр а-клеш, которые сохраняют бисера.
- MFIA анализы проводили при комнатной температуре (27 ° C + / -2 ° C).
- Комплексы антиген-антитело образуются в ходе испытания сыворотки стадии инкубации обнаруживаются инкубации с биотинилированного козьего анти-вид конъюгатов (BAG), а затем R-фикоэритрин-меченым стрептавидином (SPE).
- В анализе читатель, бисер проходят по одному черезДетектор, где они подвергаются воздействию двух лазеров. Один лазерный возбуждает внутренние красители, которые определяют набор цветов шарик, который соответствует анализа, другой возбуждает фикоэритрин красителя репортера, захваченных во время анализа. Заданное количество бусин читается в анализе и интенсивность флуоресценции фикоэритрин сообщается как о Медиана индекса флуоресценции (MFI).
Рисунок 1. MFIA процедуры. Xmap основе MFIA представляет собой суспензию микрочип, который использует цветной полистирол 5,6 микрона бисером которые антигенов (или контроля) ковалентно связаны. С бисером приходят в 100 различных наборов цветов, целых 100 различных анализов могут быть выполнены в одном и шаги Анализ проводится в фильтре нижней пластин микротитрования так, что бисер можно мыть стремление на вакуумном многообразии. Реакция читаются с Luminex Xmap 100 флуорометре. Интенсивность phycoerytГРИН флуоресценции сообщается как средний индекс флуоресценции (MFI)
2. Перед началом установки обратите внимание на следующее:
- MFIA бисер светочувствительных
- Ограничение количества прямого воздействия света имеет решающее значение. Нормальное количество освещенности, которое происходит во время рутинного тестирования является приемлемым, но длительное воздействие может привести к фотообесцвечивания из бусин, которые делают их чтения в Пробирной читателя.
- Это имеет решающее значение для успеха анализа, что MFIA бисер всегда встряхивают в подвеску, а затем обрабатывали ультразвуком (10-30 секунд) до использования.
- Анализ читатель получает информацию от одного только бисера. Сводные борта кластеров может привести к увеличению читал раза.
- Будьте уверены, чтобы сохранить испытательной пластины покрыты пластины крышкой в течение всего инкубационного шаги, чтобы избежать испарения анализа решений.
- Средства индивидуальной защиты необходимы: Лаборатория пальто, GLoves и защиты глаз следует носить все время при работе в лабораторных условиях.
3. Реагенты
- Таблица 1 включает в себя большую часть материалов, необходимых для создания в доме MFIA лаборатории. Дополнительная или повторяющиеся элементы могут быть необходимы в зависимости от ваших конкретных потребностей. Обратите внимание, что этот перечень не включает реагенты приобретены у Charles River (MFIA бисера, контроль и дополнительные реагенты). Несколько коммерческих источников биотинилированных конъюгатов и стрептавидин отмеченных фикоэритрин имеются. Однако реагенты доступны из Charles River были титровать для получения оптимального сигнала к шуму счеты с нашими реагентами, использование альтернативных поставщиков или реагента много не рекомендуется.
Таблица 1. CR-RADS использует Биоплексы чтения массива Отстранение от BioRad и автоматизированная машина планшет от BioTek. Эквивалентная приборов можно получить альтернативный поставщиков.
Пункт Продавец Номер в каталоге Оборудование Читатель Подвеска массива * BioRad 171-000205 96-луночных микропланшетов шайбы BioTek ELX50/8FMW Ультразвуковой очиститель / ванной Cole Palmer EW0884900 Аналоговый микшер вихревой VWR 58816-121 -20 ° C морозильнике Различный 4 ° C холодильнике Различный 12-канальная пипетка, 20-200 мкл VWR 83009-718 Орбитальный шейкер VWR / Lab-Line 57019-600 Одноканальные пипетки, 20-200 мкл с наконечниками VWR 83009-732 Одноканальные пипетки, 2-20 мкл, с советами VWR 83009-726 Одноканальные пипетки, 100-1000 мл, с советами VWR 83009-736 Vacushield вентиляционные устройства VWR 55095-006 Вакуумный насос давления VWR 54908-037 Вакуумная система отходами водохранилище VWR 80200-640 Одноразовые 96-а polystryrene пластины Fisher Scientific 14-245-145 MultiScreen HTS-BV пластины, 1.2μm фильтр, стирола Millipore MSBV N12 50 15 мл конических пробирок (полипропилен) Sarstedt 62554.002 50 мл конических труб (полипропилен) Sarstedt 62547.004 Сыворотка флаконах Sarstedt 72694.007 Алюминиевая фольга VWR 89079-068 1L бутылки, стерильный VWR 28199-246 0.22μm бутылочных фильтры VWR 28199-307 Реагент водоемов (100 мл) VWR 82026-356 5 мл, 10 мл, 25 мл пипетки для дозирования жидких реагентов VWR Реагенты PBS, рН 7,4 1 BSA, порошок (пакеты) Сигма P3813 ProClin 300 Sigma / Supelco 48912-U Без покрытия микросфер Luminex варьироваться в зависимости от типа
4. Подготовка реагентов
- Два буфера, необходимых для процедуры MFIA. Первичный Разбавитель доступна реки Чарльз и содержит конфиденциальную блокаторы для уменьшения неспецифических взаимодействий белков. Анализ буфера Wash сделан на вашем предприятии с помощью коммерчески доступных реагентов.
- Анализ промывочного буфера: PBS / 1% BSA рН 7,4 выпускается в виде порошка от Sigma-Aldrich.
- Удаление твердых частиц путем фильтрации имеет решающее значение, поскольку эти частицы могут привести к засорению в анализе читателя. Фильтр буфера через 0.2micron бутылку-топ фильтр в стерильные, маркированные контейнеры.
- Сумки и SPE разводят их 2X рабочей концентрации в буфере для анализа Wash. Примечание: SPE является светочувствительным и шульд имеют ограниченный освещенности.
5. Подготовка проб
- Соберите тестирования материалов, реагентов и расходных материалов.
- Multi-и одноканальные пипетки и советы
- 96-а низкое связывание белка микротитровальных пластинах (сыворотка разведения) и фильтр-нижней пластины (MFIA анализ)
- Соберите образцы крови в соответствии с вашими стандартная процедура. Разрешить образцы крови к свертыванию полностью, удерживая их при комнатной температуре в течение по крайней мере 30 минут до центрифугирования и удаления сыворотки. Undilute сыворотки следует перемешать кратко смешать компонентов сыворотки до отбора проб.
- Конечное разведение тестирование на MFIA это 1/50. Это необходимо сделать 2X (1/25) образец тестовой сыворотки для анализа. Развести неразбавленном сыворотки теста, добавляя 1 часть сыворотки до 24 частей MFIA первичного разведения. Организация тестовой сыворотки в 96-луночный планшет значительно сокращает время передачи ваших образцов для ТЭСт плиты и настоятельно рекомендуется.
6. Подготовка испытательной пластины
- Предварительное смачивание 96-а тест пластины, необходимые для обеспечения правильной, даже хорошо эвакуации. Даже если вся пластинка не будет использоваться этот шаг изначально необходимо, вам не придется добавлять реагент или последующее мытье буфера в пустых скважин.
- Некоторые лаборатории работать меньше, чем полный 96-луночный планшет, закрыв неиспользованных скважин на тарелку испытаний и план повторное использование этих скважин на более поздний срок. Мы не рекомендуем использовать этот метод, так как это может повлиять на надлежащее фильтрации тест пластины.
- Правильное стремление пластины теста имеет решающее значение для успеха анализа MFIA. Эвакуация образца скважины займет около 5-10 секунд. Аспирационные а содержание слишком быстро может привести к борту агрегации и медленно прочитал раз в конце анализа.
- Пятно нижней пластины теста с бумажным полотенцем после каждых Wзолы шагом для обеспечения слива жидкости остановился. Невыполнение промокните испытательной пластины может привести к жидкими реагентами влагу из скважины во время инкубации и в результате отсутствии козьего анти-видов и / или видов IgG борта баллов. Эти шарики предназначены для оценки в течение заранее определенного диапазона MFI, когда соответствующее количество первичных сыворотки и надписью реагенты добавляют в каждую лунку.
7. MFIA бисера приготовления суспензии
- Это имеет решающее значение для успеха анализа, что шарики всегда встряхивают и обрабатывают ультразвуком до использования. Анализ читатель получает информацию от одного только бисера, бисер агрегатов или сгустки могут привести к увеличению читал раза.
- Vortex фондовом связанных шарик подвески (обычно 10 ± 5 секунд)
- Ресуспендируют бисером следуют ультразвуком в ванне ультразвуком в течение 10-20 секунд.
- Развести 20-кратный запас подвески 2X рабочего борта подвески в начальной разведения. Внесите 50 мкл 2X шарик подвескидля каждого анализа и предварительного мокрого теста плиты.
8. Добавление Sera испытаний и управления в испытательной пластины
- Внесите 50 мкл каждого 2X и контрольной сыворотки для теста плиты на основе ваших предопределенных карте пластины. Безопасная крышка к пластине с резинкой или алюминиевую фольгу и выдержать тест Пластина для 60 минут на орбитальном шейкере, в темноте при комнатной температуре.
- Скорость шейкере должно быть больше 400, но меньше, чем 700rpm. Очень важно, чтобы бусины иметь в подвеску, чтобы сывороточных антител доступ ко всем поверхностям связанных антигенов. Неспособность сохранить бисера приостановлено приведет низкие показатели IgG борта контроля и анализа должны быть повторены.
9. Стиральные испытательной пластины
- Аспирируйте а содержимое с помощью вакуумного коллектора. Эвакуация образца скважины займет около 5-10 секунд.
- Пятно нижней части испытательной пластины с ПапеГ полотенца после каждого для обеспечения слива жидкости остановился.
- Ресуспендируют бусины в 50 мкл буфера для анализа Wash. Важно, чтобы шарики не высыхать во время теста процесс.
10. Добавление сумку и SPE на испытательной пластины
- Внесите 50 мкл 2X рабочем разведении мешок, чтобы все лунки, содержащие MFIA бисера. Закрепите крышку к пластине с резинкой или алюминиевой фольгой. Инкубируйте пластины теста в течение 30 минут при встряхивании, как указано выше, в темноте при комнатной температуре.
- После этой инкубации промыть испытательной пластины и ресуспендируют бусины с анализа буфера Wash, как описано ранее после того сыворотки.
- Внесите 50 мкл 2X рабочем разведении SPE для всех лунках, содержащих MFIA бисера. Закрепите крышку к пластине с резинкой или алюминиевой фольгой. Инкубируйте пластины теста в течение 30 минут при встряхивании, как указано выше, в темноте при комнатной температуре.
- После этого инкубаторывозмущений мыть испытательной пластины и ресуспендируют бусины с 125 мкл буфера для анализа Wash и встряхните пластину для ~ две минуты, чтобы ресуспендируйте бисер перед помещением в анализе читателя.
11. Чтение тест плиты
- Поместите тест-пластины в анализе читатель в течение 10 минут ресуспендированием бисера. В случае сбоя питания или других инцидентов, тест плиты можно хранить при комнатной температуре в темноте до 12 часов, пока не готова для чтения.
- Соблюдайте первого образца хорошо, чтобы убедиться, что выбранный шарик панели соответствует борта профиль в поисковых скважин. Если есть бисер, выходящие за «шарик регионе их назначенным на дисплее протокол, неправильный выбор профиля была сделана.
- Если бусины были должным образом ресуспендировали они должны заполнить свои указанного «регионы», указанные в программном обеспечении читателя анализом.
- Если бисер агрегируются они заполнят в своих регионах в медленномставки. Вы можете удалить испытательной пластины от читателя и вручную ресуспендируйте скважин. Растирают каждую лунку с многоканальной пипетки 3-4 раза, чтобы помочь при разгоне борта агрегатов. Заменить испытательной пластины в считывающее устройство и продолжить.
12. Представитель Результаты
- Минимальное количество бусин читается в анализе и интенсивность флуоресценции фикоэритрин сообщается как о Медиана индекса флуоресценции (MFI) в диапазоне от 0 до 32667. После сравнения пунктам 25, 50 или 100 бусин на лунку мы не видели никаких статистических различий и регулярно рассчитывать 25 бусин на агента по образцу хорошо. Проверьте результаты отчета за ошибки, такие как недостаточная борта считает или не IgG / анти-IgG борта баллов. Эти шарики предназначены для «оценки» в рамках заранее определенного диапазона MFI, когда соответствующее количество первичных сыворотки и надписью реагенты добавляют в каждую лунку. Пример скважин с ошибками, (низкий борт счета) или не IgG управления борта оценки должныбыть повторен для приобретения достоверных результатов.
- Экспорт результатов в листе Excel. Для нашей интерпретации данных каждого анализа присваивается:
- Ткань Control (TC) Тест: Для большинства анализов грызунов MFIA, ткани контроля экстракт дикого типа бакуловируса-инфицированных клетках насекомых.
- Анализ Cutoff: Это значение является минимальным флуоресценции ожидается и корректируется для каждого теста, чтобы максимизировать точность диагностики. Для большинства анализов, флуоресценция отсечки 3000.
- Чистая Медиана индекса флуоресценции (MFI) рассчитывается для каждого анализа (за исключением тканей и IgG контрольных испытаний) по следующей формуле. Иными словами, конкретный сигнал анализа является общая анализа МФО минус TC (фон) MFI Это значение затем делится на 1000, который просто устанавливает диапазон Чистая МФО между 0-32 вместо 0-32,667.
Чистая MFI = (MFI антител анализа - MFI ткани управления) / 1000
Небраскат МФО и TC МФО преобразуются в баллы по сравнению с анализа Cutoff специфических для каждого антигена.
Рисунок 2. Представитель MFIA данных для тестирования сывороток со всеми IgG контролирует прохождение.
- 12,4 MFIA Интерпретация
- Результаты тестов плиты должны быть интерпретированы только если система-пригодность контроль и контроль сыворотки (IgG / анти-IgG бисер) результаты отвечают критериям приемлемости, перечисленным в таблице 2. Отказ от этих двух бусин IgG управления можно указать несколько процедурных ошибок, таких как неправильное или недостаточное разведение сопряженных объеме или SPE, неправильный тест разведении сыворотки или использование сыворотки от immunocomprimised животных.
Таблица 2
Критерии приемки для пробирного управления Управление Приемлемого результата Счет Классификация Высокий уровень иммунной сыворотки ≥ 4,5 Положительный Низкий уровень иммунной сыворотки ≥ 1,5 ≥ Пограничное Номера для иммунной сыворотки <2,5 ≤ Пограничное Разбавитель <2,5 ≤ Пограничное Ig бисера Комплект * ≥ Cutoff/1000 Проходить * Бисера установлен покрытый видоспецифические анти-тест сывороточных иммуноглобулинов (Ig): отсутствие оценки для данного элемента управления пригодности образца могут возникнуть в результате того недостаточных образца, слишком высокие разведения образца, неправильный вид или тестирование сыворотки от иммунодефицитными хоул.
- Если какой-либо из тестов управления плиты анализа неудачу, за исключением High Range иммунной сыворотки, результаты не являются приемлемыми и должны быть повторены. Переходя Низкий диапазон Сыворотка оценки управления имеют решающее значение, поскольку она демонстрирует уровень обнаружения чувствительность теста пластины.
- Коза анти-IgG видов борта оценка основана на количестве первичных сыворотки добавлен в анализе. Если это не удается управления шарик, но вид IgG проходит (ну B1, рис.3), то это означает, что достаточно реагентов тестирования (BAG, SPE) были добавлены к тесту хорошо, и это сыворотке связанный с этим вопрос. Если количество испытаний реагентов является недостаточным в частности хорошо и IgG и анти-IgG бисером управления не удастся (ну E1, рис.3).
Рисунок 3. Представитель MFIA результатов теста с отказами (указано в оранжевый). Wells A1, C1, F1 указывают на ТС (ткань реактивной) недостаточностьгде оценка ТС представлен в скобках. Wells B1 и E1 иллюстрируют два типа IgG внутренние сбои управления, недостаточный тест на антитела (B1) или реагенты (E1) BAG / SPE соответственно.
- Если испытательная пластина результаты пробирного контроля являются удовлетворительными, индивидуальные показатели анализа классифицируются, как показано в таблице 3. Важно, чтобы подтвердить любые пограничные или положительное заключение по альтернативным методом испытания.
Таблица 3
MFIA Оценка классификация Счет Классификация TC Чистый TC + Net * ≥ 2 <0,5 <2,5 Отрицательные (-) ≥ 2,5 Реакция TC (T) <2 <1,5 - 1,5 ≤ X <2,5 Пограничные (B) ≥ 2,5 Положительные (+) * Классификация отрицательное все еще может быть определена с ненулевым TC балл, полученный TC + Чистая рейтинг (оценка = Ag) отрицательно
- Результаты тестов плиты должны быть интерпретированы только если система-пригодность контроль и контроль сыворотки (IgG / анти-IgG бисер) результаты отвечают критериям приемлемости, перечисленным в таблице 2. Отказ от этих двух бусин IgG управления можно указать несколько процедурных ошибок, таких как неправильное или недостаточное разведение сопряженных объеме или SPE, неправильный тест разведении сыворотки или использование сыворотки от immunocomprimised животных.
Discussion
Процесс тестирования MFIA очень эффективно, требуется меньше оборудования и меньшие объемы реагента и образца, чем традиционные тесты singleplex. Функциональность мультиплекс система дает пользователю возможность экране одновременно для нескольких штаммов или серотипов общих агентов в лабораторных грызунов (например, коронавирус, парвовирусов и т.д.). Это также позволяет нам проектировать настроенных борта панели на основе области интересов (т.е. конкретной семьи вируса) и адаптируется к скрининга других типов биомолекул, в том числе цитокинов и других биомаркеров. Кроме того, она позволяет включать несколько внутренних тестов контроля для проверки образца и пригодности системы и тем самым обеспечить точность результатов. Они включают в себя управление ткани и IgG анти-тест сывороточных иммуноглобулинов видов (αIg) покрытием борта наборы для оценки пригодности образца. Ткани контроля борта обнаруживает неспецифического связывания сывороточного иммуноглобулина и контроля αIg шарик подтверждает, что сыворотка была добавлена и содержит достаточной концентрации иммуноглобулина. Другой контроля шарик, покрытый сывороточных иммуноглобулинов видов, показывает, что меченые реагенты и анализа читатель функционируют должным образом. Другие коммерчески доступные мультиплекс формата серологические тесты (т.е. микрочипы, ИммуноКомб) не может предложить тот же уровень результатов подтверждения.
Возможность сузить круг возможных источников анализа отказа до повторного тестирования может помочь следователю сэкономить время и материалы. Критические аспекты MFIA должны быть подтверждены перед повторением неудачного образца. Так как анализ проводится при температуре окружающей среды следует убедиться в том, что лаборатория температура составляет около 27 ° C ± 2 ° C, более высокая температура может привести к снижению, чем ожидалось, показатели для контроля и образцов. Стиральные является, пожалуй, самым важным шагом в анализе. Страхование что тест пластины правильно мыть, уничтожил и ресуспендировали может устранитьПодавляющее большинство ошибок выборки в связи с низким количеством шарик (в связи с агрегированной бусины) или недостаточно того реагента (потеряли влагу из теста пластины фильтра внизу). Мы регулярно рассчитывать 25 бусин в анализе (агент) и не обнаружили статистической разницы в результатах, считая большее количество шариков, которые также могут привести к более длительному времени для чтения пластины.
Мы провели комплексные исследования проверки MFIA на несколько видов наиболее часто используемых лабораторных животных (мыши, крысы, хомяка, морской свинки и кролика), чтобы продемонстрировать диагностическую точность, воспроизводимость и надежность путем тестирования большого числа известных положительных и отрицательных образцах сыворотки и сравнивая их ELISA, IFA и MFIA результаты. Предел обнаружения (например, стандартные иммунной сыворотки концов титрование) из MFIA были сопоставимы, а в некоторых случаях превзошли те, соответствующего ELISA. Диагностическая специфичность, измеренная с SPF грызунов сыворотки, превысила 99%, общая betwee соответствияп ИФА и MFIA осуществляется на известные положительные и отрицательные сыворотки известные было больше, чем 95%. В целом, эти результаты доказали, что мультиплекс MFIA является хорошим заместителя singleplex ELISA, и пригоден для использования по назначению, т.е. в обычной серологического колоний лабораторных животных.
Disclosures
Все авторы работы Charles River рад, основным поставщиком животных серологические тестирования и реагентов.
Acknowledgments
Исследования, представленные здесь была поддержана Charles River.
References
- MFIA Rodent Methods Manual [Internet]. , Charles River. Available from: http://www.criver.com/SiteCollectionDocuments/rm_ld_r_MFIA Rodent_Methods_Manual.pdf (2011).
- Rodent MFIA Validation Summary Report [Internet]. , Charles River. Available from: http://www.criver.com/SiteCollectionDocuments/rm_ld_r_MFIA _summary_report.pdf (2007).
- Jacobson, R. H., et al. Principles of validation of diagnostic assays for infectious diseases. Manual of Standards for Diagnostic Tests and Vaccines. , Office International des Epizooties (OIE). France. 8-15 (1996).
- Wright, P. F. International standards for test methods and reference sera for diagnostic tests for antibody detection. Rev. sci. tech. Off. int. Epiz. 17 (2), Office International des Epizooties (OIE). France. 527-533 (1998).
- Pepe, M. S. The Statistical Evaluation of Medical Tests for Classification and Prediction. , Oxford University Press. Oxford, New York. (2003).
- Barr, M. C., et al. Comparison and interpretation of diagnostic tests for feline immunodeficiency virus infection. J. Am. Vet. Med. Assoc. 199, 1377-1381 (1991).
