Summary
Цистометрия является эффективным методом для оценки функции мочевого пузыря мелких животных
Abstract
Protocol
1. Лабораторных животных
- Животных (мышей, крыс) размещаются в специализированном лечебном учреждении животных с 12-час цикле свет-темнота и вволю доступ к воде и стандартных гранул пищи. Оба пола и возраста животных являются важными параметрами, которые должны быть стандартизированы в соответствии с потребностями. Мы обычно выполняют цистометрии в 10 - 12 недельных самок 5,6.
- Все эксперименты на животных проводятся в соответствии с Европейским Союзом принципы сообщества совета и одобрен местным комитетом по этике.
2. Анестезия
- Isoflurane анестезии используется для выполнения небольших хирургических процедур, так как он легко дозы в связи с его коротким периодом полураспада. Соответствующие очистки отходящих газов необходимо при использовании изофлурана.
- Животных помещают в фургон, газом изофлураном 5% в чистом кислороде (1 л / мин).
- После индукции анестезии при соответствующем лEvel поддерживается небольшой маски (разрез 10 мл шприц) на 0,8 - 1 л / мин кислорода с 1 - 1,5% изофлурана.
- Для мышей, уретановые анестезия применяется при функциональных записи (ср. ниже). Уретановые анестезия применяется при функциональных записей, потому что, в отличие от большинства других анестетиков, рефлекс мочеиспускания не подавляется этого анестетика 4. Уретановые 1,2 г / кг массы тела вводят подкожно (п) 60 мин до начала записи. При необходимости дозу уретана, необходимых для получения надлежащей анестезии можно титровать путем введения дополнительных доз (0,1 г / кг) подкожно. Следует отметить, однако, что дополнительная анестезия может изменить мочеиспускания эффективности и, следовательно, частоты мочеиспускания 7,8. Таким образом, цистометрической записи необходимо внимательно следить и отбрасываются, когда значительные отклонения от контроля поведения не наблюдается. Анестезия не следует назначать в то время как тестсоединения применяются, чтобы избежать неправильного толкования данных.
3. Хирургическая процедура - мочевой пузырь катетер Имплантация
- Хирургические инструменты стерилизуются в автоклаве перед использованием. Бритье живота животных, дезинфицируют спиртом 70% и выполняют лапаротомию низкой средней линии, чтобы разоблачить мочевого пузыря.
- Под операционным микроскопом, поместить кисетный шов в мочевой пузырь купола используется не рассасывающиеся, мононить шва (размер 6-0).
- Выполните небольшое цистостомии (мы преимущественно использовать иглу 18 G) внутри кошелька строку и вставьте PE 50 полиэтиленовый катетер, с небольшим манжеты на конце (получено тщательно нагрева трубы) через это отверстие. В наши руки, тонкие трубы (ПЭ 10) имеют более высокие и переменного сопротивления. Трубка может быть вылечен, поместив ее в этанол 70% раствора или стерилизовать в автоклаве. Перед имплантацией, трубы следует промыть раствором.
- Закрепите кошелек улING вокруг трубы с узлом хирурга. Вытяните катетер осторожно наружу, пока колоколообразной конец находится прямо под шов. Нажмите кусок катетера 18 G к швом, чтобы предотвратить утечку.
- Настаивать небольшой объем физиологического раствора (100 - 200 мкл) осторожно, чтобы проверить на герметичность. Если утечка присутствует, дополнительный шов должен быть помещен.
- Закрыть мышцы живота использовании мононити швы, оставляя проход для катетера в верхней части разреза.
- Туннель трубку к межлопаточной области использования полых металлический стержень, тем самым предотвращая животные кусают трубки во время эксперимента.
- Кожа закрывается с помощью нерассасывающийся, швы мононити. Имплантирован катетер промывается физиологическим раствором, чтобы проверить его проницаемость.
- Перед животные пробуждаются, анальгетики подкожно (бупренорфин, 0,05 мг / кг).
4. Установка и Цистометрия
- В зависимости от экспериментальной Questiна (и видов, используемых) цистометрии выполняется в бодрствования (ограничения или необузданность) или уретана анестезии животных. В то время как цистометрии вполне возможно в сознании крыс, которые имеют тенденцию оставаться спокойным в сдержанной окружающей среды, мы обычно выполняют цистометрии под уретана анестезии (1,2 мг / кг, подкожно) при использовании мыши 3,5,6,9.
- В наркозом мышей, температура тела постоянно контролируется и поддерживается на 36,5 ° C ± 0,2 ° C с помощью датчиков температуры и нагрева лампы.
- Настройки калибруется перед каждым экспериментом в соответствии с инструкциями производителя.
- Имплантирован катетер связано с тем, Luer заглушки для 3-х ходовой кран, который подключается к датчику давления (Edwards Lifesciences) с одной стороны и инфузионного насоса на другой (Harvard Apparatus). Датчик давления подключен через усилитель (78534c монитор, Hewlett Packard) к системе сбора данных (DI-730-USB, Dataq инструментов) и сотрудничествоmputer. Windaq / Lite программное обеспечение можно использовать для записи.
- Настой насос, что позволит вливание физиологического раствора или в PBS, например, 100 мкл / мин (у крыс) или 20 мкл / мин (у мышей). В таких мочевого пузыря будет заполнена с постоянной скоростью, в то время внутрипузырного давления записывается.
- На рисунке 5 показаны типичные следы давления: во время инфузии жидкости, происходит медленное наращивание давления в мочевом пузыре, пока определенный объем / давление будет достигнуто, мочеиспускание порог. Как только этот порог будет достигнут, мочевого пузыря, будет сжиматься, а затем сфинктера откроется, позволяя прохождение мочи через мочеиспускательный канал. Таким образом, мочевой пузырь опорожняется, сокращение остановится, и давление упадет еще раз, чтобы "базальных" уровне.
- Как крыс помещали в метаболические клетки и выше цифровые баланса, объема мочеиспускания могут быть измерены одновременно, давая информацию о объема мочеиспускания. Из-за небольших объемов аннулирована в мисе, она может быть очень сложным использованием этой системы. Таким образом, объема мочеиспускания определяется с помощью небольшого фильтровальной бумаги взвешиваться до и после мочеиспускания.
- Как правило, мы позволяем системе равновесия в течение 30 мин, после чего запись в течение 30 мин. Тогда, наркотики можно вводить системно или внутрипузырно и еще 30 мин записываются.
- Записанные данные могут быть экспортированы в. CSV-файлов, которые можно импортировать в специализированное программное обеспечение для количественного анализа. Обычно мы используем происхождения (OriginLab корпорации, штат Массачусетс, США).
- После экспериментов животных умерщвляют путем смещения шейных позвонков (мышей) или CO 2 интоксикации (крысы).
5. Представитель Результаты
Рисунок 1. Лапаротомия обзор. А) Поместите крысу в положении лежа на спине. B) бритья и стерильно готовить хирургическое сайта. C) разрез кожи. D) Разрез оF мышцы живота и мочевого пузыря экспозиции.
Рисунок 2. Кисетный шов.
Рисунок 3. Катетер имплантации.
Рисунок 4. Туннелирование катетер.
Примеры измерения давления, полученные в ходе внутрипузырного перфузии физиологического раствора в сознательном крыс и мышей под наркозом показано на рисунке 5. Несколько параметров можно извлечь из сигнала давления (например, intercontractile интервал, базовый давления и порог давления). Для всестороннего описания этих параметров см. Andersson и соавт. (Ссылка 4) и Yoshiyama и соавт. ( Ref 10).
Недавно мы использовали цистометрии для идентификации молекулярных мишеней горчичное масло (MO), высокой реакционной способностью соединения, которое уже давно используется в экспериментальных моделей воспаления и гипералгезии внутренних органов, таких как мочевой пузырь 11,12. Внутрипузырная инфузии 10 ммоль MO вызывали сильное увеличение частоты мочеиспускания (снижение intercontractile интервала) у мышей дикого типа (рис. 6а, б) и уменьшение объема мочеиспускания 6. Интересно, MO индуцированных подобных изменений у мышей, дефицитных по рецептору MO TRPA1. В отличие, MO индуцированных гораздо слабее изменений в цистометрической параметров в TRPV1 мышей KO, чем в WT мышей и был без эффекта в Trpa1/Trpv1 мышей KO. Вместе с измерениями выпуска геном кальцитонина пептид, связанный с (CGRP) 6, эти данные показывают, показывают, что TRPV1 может играть ключевую роль в висцеральной раздражение индуцированных МО.
ve_content ">
Рисунок 5. Представитель следы внутрипузырного давления, записанные в сознательном самок крыс (А) и в анестезии женщина мыши (B). Самое низкое давление определяется как "базовый давления" (красные стрелки). Давление в конце фазы заполнения отмечены синими стрелками. Объем введенной жидкости между этими точками, деленной на разность давлений, позволяет рассчитать соответствие стенки мочевого пузыря (соблюдение = придают объем / (пороговое давление -. Базового давления) "intercontractile интервал" (ICI) это время между два мочеиспускания сокращений.
Рисунок 6. Эффекты внутрипузырного применения горчичного масла на цистометрии картины в дикого типа и мышей TRPA1, TRPV1 и Trpa1/Trpv1 нокаутом.(A) Характерные примеры внутрипузырного изменения давления, записанные в WT, TRPA1 KO, KO TRPV1 и Trpa1/Trpv1 KO мышей в ответ на вливание физиологического раствора и 10 мМ МО. (B) Время курса средней мгновенной частоты мочеиспускания до и во время внутрипузырного вливания МО. Для всех мышей, данные были нормированы на средней частоты, полученные в ходе вливание физиологического раствора. Эти данные адаптированы из Everaerts и соавт. (Ссылка 6), с разрешения Elsevier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Цистометрии техники, представленные здесь позволяет проводить в естественных условиях измерения функции мочевого пузыря на животных моделях. Крысы являются, вероятно, наиболее часто используемые модели на животных. Мыши сложнее в использовании, но имеют преимущество использования генетически модифицированных животных. Из-за технических трудностей использования сознательного мышей, которые, как правило, очень активны в результате ослабления имплантировали катетер и изменения в внутрибрюшное давление, что может повлиять на внутрипузырного давления, мы рекомендуем, чтобы держать их под наркозом с уретановой в течение всего цистометрии протокол. Конечно, преимущества наличия седативных мышей, должны быть взвешены против воздействия анестетиков. Таким образом, уретана может оказать существенное влияние на пост-мочеиспускания остаточный объем 7,8. Поэтому мы ждать, пока у нас есть стабильный уровень наркоза, прежде чем мы начнем нашу записях и выступлениях.
Исследователи должны рассмотреть тОн различий между мужским и женским грызунов мочеиспускание 13. Кроме того, возраст животных имеет большое значение. Мы выполняем цистометрии у животных, которые в 10 - 12 недель. Все эксперименты следует проводить в спокойной обстановке, особенно при использовании сознательного животных. Число инфузии были описаны для наших животных моделях. Обычно мы используем инфузии 20 мкл / мин для мышей и 100 мкл / мин для крыс.
Как упоминалось выше, мочеиспускания у человека и грызунов существенно различаются. Например, АТФ является одной из основных причин детрузора у мышей и крыс, в то время как у людей, мочевого пузыря сокращения, в физиологических условиях в основном опосредован ацетилхолина 4. Однако возможности для выполнения инвазивных измерений, которые, как правило, запретительные в клинических условиях и использовании генетически модифицированных животных, позволяют изучать текущие границы мочевого пузыря патофизиологииг фармакологии. В связи с этим, значительные успехи были недавно получены в выяснении роли мускариновых 14, 15 и простагландина адренорецепторов 16, нейропептиды 17, Ca 2 +-активированных K + каналы 18 и TRP каналы 3,5,6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана грантами от бельгийского федерального правительства (IUAP P6/28), Научно-исследовательский фонд Фландрии (FWO) (G.0565.07 и G.0686.09), Astellas Европейский фонд Award 2009 и Научно-исследовательского совета KU Leuven (GOA 2009/07, EF/95/010 и PFV/10/006). PU и мы научных сотрудников научно-исследовательского фонда Фландрии (FWO). MB является членом Марии Кюри. DDR фундаментальных клинических сотрудник FWO.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| urethane | Urethane, Sigma-Aldrich | 315419 | group 2B carcinogen |
| isoflurane | Isoba, Schering-Plough Animal Health | ||
| polyethylene catheter | Intramedic Polyethylene tubing PE50, Becton Dickinson | 427411 | |
| surgical microscope | Op-Mi 6, Carl Zeiss | Op-Mi 6 | |
| purse-string suture | Prolene 6/0, Ethicon | 8610H | |
| fascia and skin suture | Ethilon 4/0 or 5/0, Ethicon | 662G or 661G | |
| postoperative analgesics | Temgesic, Schering-Plough Animal Health | dosage for rats: 0.05 mg/kg | |
| amplifier | 78534c monitor, Hewlett Packard | ||
| analytical balances and balance data acquisition software | FZ 300i, A&D | FZ-300i | |
| infusion pumps | pump 33, Harvard apparatus | HA33 | |
| cystometry recording system | Dataq instruments, DI-730 series and Windaq/Lite | DI-730-USB Windaq/Lite | |
| temperature registration | Fluke 52 KJ thermometer | 52 KJ | |
| pressure transducers | Edwards Lifesciences, pressure monitoring set | T322247A |
References
- Everaerts, W., Gevaert, T., Nilius, B., De Ridder, D. On the origin of bladder sensing: Tr(i)ps in urology. Neurourol. Urodyn. 27, 264-2673 (2008).
- Fry, C. H. Animal models and their use in understanding lower urinary tract dysfunction. Neurourol. Urodyn. 29, 603-608 (2010).
- Gevaert, T. Deletion of the transient receptor potential cation channel TRPV4 impairs murine bladder voiding. J. Clin. Invest. 117, 3453-3462 (2007).
- Andersson, K. E., Soler, R., Fullhase, C. Rodent models for urodynamic investigation. Neurourol. Urodyn. 30, 636-646 (2011).
- Everaerts, W. Inhibition of the cation channel TRPV4 improves bladder function in mice and rats with cyclophosphamide-induced cystitis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 19084-19089 (2010).
- Everaerts, W. The capsaicin receptor TRPV1 is a crucial mediator of the noxious effects of mustard oil. Curr. Biol. 21, 316-321 (2011).
- Yoshiyama, M., Roppolo, J. R., Thor, K. B., de Groat, W. C. Effects of LY274614, a competitive NMDA receptor antagonist, on the micturition reflex in the urethane-anaesthetized rat. Br. J. Pharmacol. 110, 77-86 (1993).
- Yoshiyama, M., Roppolo, J. R., de Groat, W. C. Effects of MK-801 on the micturition reflex in the rat--possible sites of action. J. Pharmacol. Exp. Ther. 265, 844-850 (1993).
- Boudes, M. Functional Characterization of a Chronic Cyclophosphamide-Induced Overactive Bladder Model in mice. Neurourol. Urodyn. , (2011).
- Yoshiyama, M. Sex-related differences in activity of lower urinary tract in response to intravesical acid irritation in decerebrate unanesthetized mice. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 295, R954-R960 (2008).
- McMahon, S. B., Abel, C. A model for the study of visceral pain states: chronic inflammation of the chronic decerebrate rat urinary bladder by irritant chemicals. Pain. 28, 109-127 (1987).
- Du, S., Araki, I., Yoshiyama, M., Nomura, T., Takeda, M. Transient receptor potential channel A1 involved in sensory transduction of rat urinary bladder through C-fiber pathway. Urology. 70, 826-831 (2007).
- Streng, T., Santti, R., Talo, A. Similarities and differences in female and male rat voiding. Neurourol. Urodyn. 21, 136-141 (2002).
- Igawa, Y. Cystometric findings in mice lacking muscarinic M2 or M3 receptors. J. Urol. 172, 2460-2464 (2004).
- Schroder, A., Newgreen, D., Andersson, K. E. Detrusor responses to prostaglandin E2 and bladder outlet obstruction in wild-type and Ep1 receptor knockout mice. J. Urol. 172, 1166-1170 (2004).
- Chen, Q. Function of the lower urinary tract in mice lacking alpha1d-adrenoceptor. J. Urol. 174, 370-374 (2005).
- May, V., Vizzard, M. A. Bladder dysfunction and altered somatic sensitivity in PACAP-/- mice. J. Urol. 183, 772-779 (2010).
- Thorneloe, K. S., Meredith, A. L., Knorn, A. M., Aldrich, R. W., Nelson, M. T. Urodynamic properties and neurotransmitter dependence of urinary bladder contractility in the BK channel deletion model of overactive bladder. Am. J. Physiol. Renal. Physiol. 289, 604-610 (2005).
