צלבים מיניים ובידוד של הצאצאים רקומביננטי הם כלי מחקר חשובים פטריות פילמנטיות,<em> Fusarium graminearum</em>, הטכניקות הדרושות בהצלחה לבצע את התהליכים האלה מוצגים.
Fusarium graminearum הפכה מערכת מודל ללימודי פיתוח של פטריות פתוגניות פילמנטיות. פ graminearum בקלות מייצר גופי פרי, המכונים גופי פרי מיניים, על אגר גזר. גופי פרי מיניים מכילים מספר רב של סוגי רקמות, המיוצר בשלבים מסוימים של פיתוח perithecium. אלה כוללים (לפי סדר הופעתם) היווצרות התיבות perithecium (המעוררים העובש ascogenous), הקיר החיצוני, paraphyses (mycelia סטרילית אשר תופסים את מרכז perithecium עד asci לפתח), asci, ואת ascospores בתוך asci 14. ההתפתחות של כל אחד רקמות אלו מופרדים על ידי כ 24 שעות, כבר בסיס של מחקרים transcriptomic במהלך התפתחות מינית 12,8. עיין Hallen et al. (2007) לתיאור מעמיק יותר של ההתפתחות, כולל תמונות של כל שלב. כאן, אנו מציגים את שיטות להפקת והקציר סינכרוניLY פיתוח מדשאות גופי פרי מיניים ללימודי הזמני של ויסות הגנים, פיתוח תהליכים פיזיולוגיים. למרות השיטות האלה נכתבים במיוחד לשימוש עם פ graminearum, טכניקות ניתן להשתמש במגוון רחב של מחלות נוספות, ובלבד הפרי יכול להיגרם בתרבות ויש כמה בתיאום לפיתוח. יש לנו להתאים לאחרונה בפרוטוקול זה כדי ללמוד את ההתפתחות המינית של פ verticillioides. אמנם גופי פרי מיניים אדם יש הרים יד על מין זה, כי הדשא של פיתוח גופי פרי מיניים לא יכול היה להיגרם, התהליך עובד היטב לחקר ופיתוח (Sikhakolli ואת שביל, לא פורסם).
התפקיד החשוב ביותר של גופי פרי פטרייתי הוא פיזור נבגים. ברבות מיני Ascomycota (נאד לייצר פטריות), נבגים נורים מתוך נאד, עקב הדור של לחץ turgor בתוך נאד, נהיגה פליטה של נבגים (נוזל epiplasmic) דרךנקבובית עצה נאד 2,7. המחקרים שלנו של הפרשות ascospore בכוח גרמו לפיתוח של "assay הפרשות נבג", שבו אנו משתמשים כדי לסנן על מוטציות בתהליך. כאן אנו מציגים את פרטי assay זה.
פ graminearum הוא homothallic, וכך יכול להיווצר גופי פרי בהיעדר בן זוג תואם. היתרון של homothallism היא כי מעבר אין צורך לייצר צאצאים הומוזיגוטים עבור תכונה מסוימת, פן כי יש להקל את לימוד התפתחות מינית מין זה 14,7. עם זאת, זנים heterothallic נוצרו, שניתן להשתמש בהם עבור המעבר 5,9. אפשר גם לחצות זנים homothallic לקבל מוטנטים של גנים מספר 1 זן 1. הדבר נעשה על ידי coinoculating 1 צלחת פטרי עם 2 זנים. יחד לנקודת המפגש, רוב גופי פרי מיניים יהיו רקומביננטי (בתנאי מוטציה באחד הזנים ההורים לא לעכבoutcrossing). הגיל גופי פרי מיניים, הם להפריש ascospores בהמוניהם במקום בכוח למלא אותם. Exudate נבג שנוצר (המכונה cirrhus) יושב בקצה perithecium והוא יכול בקלות להסיר להתאוששות של נבגים בודדים. כאן אנו מציגים את הפרוטוקול כדי להקל על זיהוי רקומביננטי גופי פרי מיניים ואת ההתאוששות של הצאצאים רקומביננטי.
פ graminearum מותאם במיוחד ללימוד פיתוח גוף הפרי בשל הזמינות של הגנום היטב המבואר ( mips.helmholtz-muenchen.de/genre/proj/FGDB / : 4), ואת הזמינות של Affymetrix- מבוסס microarray 6. זו יש להקל את היכולת לזהות גנים חשובים להזרמת ascospore 7,11,3. השיטות שהוצגו כאן יאפשר החוקר להתמקד קבוצה בדידה של שלבים התפתחותיים ופונקציות לניתוח גנטי של גופי פרי של פ graminearum. השיטות גם להתאמה בקלות פטריות קשורות יכול להיגרם פירות בתרבות, והוא יכול לשמש כאמת מידה להתפתחות במגוון רחב של סוגים אחרים בגוף פטרייתיים הפרי.
היכולת להעריך את הפנוטיפ ירי נבג יכול להיות עדין מינים שבהם נבגים קטנים וקשה לראות, כגון <eמ> פ graminearum. אוסף של נבגים בשקופית נקי מאפשר גם הערכה חזותית, והערכה כמותית, כמו נבגים ניתן לשטוף שקופיות ונרשמת. כמה מינים פטרייתיים לייצר הרירית המקיף שלהם נבג נבגי לא ניתן שטפה, אבל יש מנה מיקרוסקופית כפי שהם יישארו בשקופית. מצאנו שזה נכון של Sclerotinia sclerotiorum.
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכה על ידי מענק מטעם הקרן הלאומית למדע (MCB-0923794 אל רגל).
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
Fusarium graminearum strain PH-1 | Fungal Genetics Stock Center, Kansas | FGSC 9075 |
Tween 60 | Sigma-Aldrich | P1629 |
Czapek’s Dox Agar | Difco, Becton Dickinson | 233810 |
Potassium Chlorate | Sigma-Aldrich | 255572 |