Seksuelle kors og isolering av rekombinant avkom er viktige forskningsverktøy for trådformede sopp,<em> Fusarium graminearum</em>, Teknikkene nødvendige vellykket gjennomføre disse prosessene blir presentert.
Fusarium graminearum har blitt en modell for studier i utvikling og patogenitet av filamentøse sopp. F. graminearum lettest produserer fruiting organer, kalt perithecia, på gulrot agar. Perithecia inneholde mange typer vev, produsert på bestemte stadier av perithecium utvikling. Disse omfatter (i rekkefølgen) dannelse av perithecium initialer (som gir opphav til ascogenous hyfer), den ytre vegg, paraphyses (sterilt mycelia som okkuperer midten av perithecium til ASCI utvikle), den ASCI, og ascospores innenfor ASCI 14. Utviklingen av hver av disse vev er atskilt med ca 24 timer, og har vært grunnlaget for transcriptomic studier ved seksuell utvikling 12,8. Referer til Hallen et al. (2007) for en mer grundig beskrivelse av utviklingen, herunder fotografier av hver etappe. Her presenterer vi de metoder for generering og høsting synkronly utvikling plener perithecia for timelige studier av genregulering, utvikling og fysiologiske prosesser. Selv om disse metodene er skrevet spesielt for å brukes med F. graminearum, kan teknikkene brukes til en rekke andre sopp, forutsatt at fruiting kan induseres i kultur og det er litt synkronisering til utvikling. Vi har nylig tilpasset denne protokollen for å studere seksuell utvikling av F. verticillioides. Selv om enkelte perithecia må håndplukket i denne arten, fordi en plen for å utvikle perithecia ikke kunne induseres, fungerte den prosessen godt for å studere utvikling (Sikhakolli og Trail, upublisert).
Den viktigste funksjonen av sopp fruiting kropper er spredning av sporer. I mange av de artene av Ascomycota (ascus produserer sopp), er sporer høyrebenet fra ascus, på grunn av produksjon av turgor trykk i ascus, kjøring utskyting av sporer (og epiplasmic væske) gjennompore i ascus spissen 2,7. Våre studier av tvungen ascospore utslipp har resultert i utviklingen av en "Spore utslipp assay", som vi bruker for å skjerme for mutasjoner i prosessen. Her presenterer vi de detaljene i denne analysen.
F. graminearum er homothallic, og dermed kan danne fruiting organer i fravær av en kompatibel partner. Fordelen med homothallism er at krysset ikke er nødvendig å generere avkom homozygot for en bestemt egenskap, en fasett som har muliggjort studier av seksuell utvikling i denne arten 14,7. Imidlertid har heterothallic stammer blitt generert som kan brukes for kryssing 5,9. Det er også mulig å krysse homothallic stammer å få mutantene til flere gener i en stamme en. Dette gjøres ved coinoculating en petriskål med 2 stammer. Langs møtested, vil flertallet av perithecia være rekombinant (forutsatt en mutasjon i ett av de overordnede stammer ikke hemmeroutcrossing). Som perithecia alder, utstråler de ascospores hopetall i stedet for med makt å fjerne dem. Den resulterende spore sårvæske (kalt en cirrhus) sitter på tuppen av perithecium og kan enkelt fjernes for gjenvinning av enkelte sporer. Her presenterer vi en protokoll for å lette identifiseringen av rekombinant perithecia og utvinning av rekombinant avkom.
F. graminearum er spesielt godt tilpasset studiet av fruiting kroppen utvikling på grunn av tilgjengeligheten av et godt annotert genom ( mips.helmholtz-muenchen.de/genre/proj/FGDB / , 4), og tilgjengeligheten av en Affymetrix- basert microarray 6. Dette har bidratt til evnen til å identifisere gener som er viktige for ascospore utslipp 7,11,3. Metodene som presenteres her vil tillate forskeren å fokusere på et avgrenset sett av utviklingsstadier og funksjoner for genetisk analyse av fruiting likene av F. graminearum. Metodene er også lett tilpasses relaterte sopp som kan induseres til frukt i kultur, og kan brukes som en standard for utvikling i en rekke andre sopp fruiting typer kroppen.
Evnen til å vurdere en spore avfyring fenotype kan være subtile i arter der sporer er små og vanskelig å se, for eksempel <em> F. graminearum. Samlingen av sporer på en ren lysbilde forenkler både visuell vurdering, og kvantitativ vurdering, som sporer kan vaskes av raset og quantitated. Noen sopparter produserer en mucilage som omgir deres Spore og sporene kan ikke skylles av, men må regnes mikroskopisk som de forblir på lysbildet. Vi har funnet dette å være tilfelle for Sclerotinia sclerotiorum.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av et stipend fra National Science Foundation (MCB-0923794 til FT).
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
Fusarium graminearum strain PH-1 | Fungal Genetics Stock Center, Kansas | FGSC 9075 |
Tween 60 | Sigma-Aldrich | P1629 |
Czapek’s Dox Agar | Difco, Becton Dickinson | 233810 |
Potassium Chlorate | Sigma-Aldrich | 255572 |