Sexuella kors och isolering av rekombinant avkomma är viktiga forskningsverktyg för fintrådiga svamp,<em> Fusarium graminearum</em> De tekniker som krävs utför framgång genomfört dessa processer presenteras.
Fusarium graminearum har blivit ett modellsystem för studier i utvecklingen och patogenicitet av trådformiga svampar. F. graminearum lättast producerar fruktkroppar, så kallade perithecia på morot agar. Perithecia innehåller många vävnadstyper, som produceras vid specifika stadier av perithecium utveckling. Dessa inkluderar (i ordning utseende) bildning av perithecium initialer (som ger upphov till ascogenous hyfer), den yttre väggen, Parafyserna (sterilt mycel som upptar mitten av perithecium tills ASCI utvecklas), den Ascl, och ascosporer inom asci 14. Utvecklingen av var och en av dessa vävnader separeras med ca 24 timmar och har legat till grund för transcriptomic studier under sexuell utveckling 12,8. Se Hallen et al. (2007) för en mer ingående beskrivning av utvecklingen, inklusive fotografier av varje steg. Här presenterar vi de metoder för att generera och skörd synkronaly utveckla gräsmattor perithecia för temporära studier av genreglering, utveckling och fysiologiska processer. Även om dessa metoder är skrivna specifikt för användning med F. graminearum, kan tekniker användas för en mängd olika andra svampar, förutsatt att fruktkropp kan induceras i kultur och det finns vissa synkront till utveckling. Vi har nyligen anpassat detta protokoll för att studera sexuella utvecklingen av F. verticillioides. Även om enskilda perithecia måste handplockade i denna art, eftersom en gräsmatta att utveckla perithecia inte kunde induceras fungerade processen bra för att studera utveckling (Sikhakolli och Trail, opublicerad).
Den viktigaste funktionen av svamp fruktkroppar är spridning av sporer. I många av de arter av Ascomycota (ascus producera svampar), är sporer skott från ascus, på grund av generering av saftspänningen i ascus, kör utdrivning av sporer (och epiplasmic vätska) genompor i ascus spetsen 2,7. Våra studier av påtvingat ascospore urladdning har resulterat i utvecklingen av en "spor urladdning assay", som vi använder för att screena med avseende på mutationer i processen. Här presenterar vi detaljerna i denna analys.
F. graminearum är homothallic, och därmed kan bilda fruktkroppar i avsaknad av en kompatibel partner. Fördelen med homothallism är att korsningen inte är nödvändigt att ta fram avkomma homozygot för en viss egenskap, en aspekt som har underlättat studier av sexuella utveckling i denna art 14,7. Emellertid har heterothallic stammar tagits fram som kan användas för passage 5,9. Det är också möjligt att korsa homothallic stammar för att erhålla mutanter av flera gener i en stam 1. Detta görs genom att coinoculating en Petri-skål med 2-stammar. Längs mötesplats, kommer majoriteten av perithecia vara rekombinant (förutsatt en mutation i en av de moderstammar inte hämmarkorsningspotential). Som perithecia ålder utstrålar de ascosporer en masse i stället för att med våld urladdning dem. Den resulterande sporer exsudat (kallas cirrhus) sitter i spetsen av perithecium och kan lätt tas bort för återvinning av enskilda sporer. Här presenterar vi ett protokoll för att underlätta identifieringen av rekombinant perithecia och återvinning av rekombinant avkomma.
F. graminearum är särskilt väl anpassad till studiet av fruktkroppen utveckling på grund av tillgången till en väl kommenterad genomet ( mips.helmholtz-muenchen.de/genre/proj/FGDB / , 4), och tillgång till en Affymetrix- baserat mikromatris 6. Detta har underlättat möjligheten att identifiera gener som är viktiga för ascospore urladdning 7,11,3. De metoder som presenteras här gör det möjligt för forskare att fokusera på en diskret uppsättning utvecklingsstadier och funktioner för genetisk analys av fruktkroppar av F. graminearum. Metoderna är också lätt anpassas till relaterade svampar som kan induceras att frukten i odling, och kan användas som en standard för utveckling i en mångfald andra fungala typer fruktkropp.
Förmågan att bedöma ett spor bränning fenotyp kan vara subtil i arter där sporer är små och svåra att se, till exempel <em> F. graminearum. Samlingen av sporer på ett rent objektglas underlättar både visuell bedömning och kvantitativ bedömning, som sporer kan tvättas bort från bilden och kvantifieras. Vissa svamparter producerar ett slem som omger deras spore och sporerna inte kan sköljas bort, utan måste räknas i mikroskop som de är på bilden. Vi har funnit att detta är sant för Sclerotinia sclerotiorum.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av ett bidrag från National Science Foundation (MCB-0.923.794 FT).
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
Fusarium graminearum strain PH-1 | Fungal Genetics Stock Center, Kansas | FGSC 9075 |
Tween 60 | Sigma-Aldrich | P1629 |
Czapek’s Dox Agar | Difco, Becton Dickinson | 233810 |
Potassium Chlorate | Sigma-Aldrich | 255572 |