Ortotopisk Aorta Transplantation i mus for Studiet af Vascular Disease

Summary

Vi beskriver en teknik, hvor en del af den abdominale aorta fra en mus transplanteres orthotopisk til lige under de renale arterier i en allogen eller syngeniske recipient. Denne teknik kan være nyttig i undersøgelser, hvor transplantation af store arterier af ensartet størrelse er fordelagtigt.

Abstract

Vaskulære procedurer involverer anastomoser i musen er generelt menes at være vanskeligt og afhænger i høj grad af dygtighed af den enkelte kirurg. Det er stort set sandt, men der er en række vigtige principper, som kan reducere problemerne med disse procedurer og forbedre reproducerbarheden. Orthotopisk aorta transplantation er en fremragende procedure til at lære disse principper, fordi det involverer kun to end-to-end anastomoser, men kræver god suturering teknik og håndtering af de fartøjer, for konsekvent succes. Denne procedure begynder med tilvejebringelse af en længde af abdominal aorta fra en donor dyr, efterfulgt af opdeling af den native aorta i modtageren. Den indkøbt aorta anbringes derefter mellem de opdelte ender af modtageren aorta og sutureres på plads med end-to-end-anastomose. For at opnå dette mål med succes kræver en høj grad af koncentration, gode værktøjer, en rolig hånd, og en vurdering af, hvor let detvaskulaturen af ​​en mus kan blive beskadiget, hvilket resulterer i thrombose. Læring disse vigtige principper er, hvad fylder det meste af nybegynder tid, når læring mikrokirurgi i små gnavere. I hele denne protokol henviser vi til disse vigtige punkter. Denne model kan anvendes til at studere vaskulær sygdom i en række forskellige eksperimentelle systemer ^1-8. I forbindelse vist her, er det oftest brugt til undersøgelse af efter transplantation vaskulær sygdom, en fælles langsigtet komplikation ved organtransplantation, hvor intimal hyperplasi forekommer i det transplanterede organ. Den primære fordel ved modellen er, at det letter kvantitative morfometriske analyser og det transplanterede fartøj ligger støder op til den endogene fartøj, der kan tjene som en yderligere kontrol ^9. Teknikken er vist her er der oftest bruges til mus, der vejede 18-25 gram. Vi har samlet det meste af vores erfaring med at bruge C57BL/6J, BALB / cJ og C3H/HeJ stammer.

Protocol

1. Presurgical Forberedelse

1. Kirurgiske procedurer, uanset hvor omhyggeligt udført, resulterer i betydelig stress. For at minimere virkningerne af en sådan stress og for at maksimere reserver, bør dyrene holdes i vivarium i mindst 72 timer før brug ^10,11.
2. Kirurgiske værktøjer, gaze, og renseservietter skal være sterilt. Det er ikke nødvendigt at anvende sterile handsker giver kun spidserne af de instrumenter touch-sutur eller den udløsende felt.
3. For hæmostase er det bydende nødvendigt, at spænde tryk er det nødvendige minimum. Skader på skibet på grund af overdreven pres eller hårdhændet behandling vil forårsage blodpropper, hvilket resulterer i hind-ben lammelse, tarm iskæmi og død inden for 24 timer. Det har vist sig, at med klemmer med et tryk på ikke mere end 2 g / cm ² fjerner problemet. Disse klemmer er angivet i Tabel 1.. Clamp pres er angivet i specifikationerne for klemmer foretaget af høj kvalitet kirurgiske instrumentalet producenter. Det har vist sig, at billige klemmer eller engangs klemmer universelt trykke for hårdt.
4. Placeringen af ​​de kollaterale kar og de relative placeringer af den abdominale aorta og inferior vena cava (IVC) er stammeafhængig. Du vil også finde små variationer mellem de enkelte mus, især i placeringen af ​​kollaterale kar.

2. Donor Operation

1. Mus kan være bedøvet med isofluran (1,5-2,5% induktion, 1,0% vedligeholdelse i luft) eller med pentobarbital (55-65 mg / kg). Pentobarbital pålægges en tidsbegrænsning (op til 1,5 timer), men giver kirurgen med mulighed for drejning af dyret for bedre adgang, hvis det ønskes. Anæstesi kan forlænges til op til 2 timer ved at anbringe 2-3 dråber af den anæstetiske når det er nødvendigt på tarmen eller leveren under operationen. Ketamin / xylazin (100 mg / kg legemsvægt for ketamin og 7 mg / kg for xylazin, i.p.) kan også anvendes af veluddannede kirurger, der can afslutte proceduren i 1-1,5 time, men det har en smallere sikker dosisområde. I USA er anvendelsen af ​​pentobarbital bliver mere problematisk i de senere år på grund af korte forsyninger. Det er bydende nødvendigt, at dybden af ​​bedøvelse overvåges for at være sikker på, at det er tilstrækkeligt. Den tå-pinch refleks er den bedste indikator for tilstrækkelig dybde, men man bør også bemærke respirationsfrekvens og andre bevægelser så godt.
2. Efter anæstesi induktion, skal du bruge en hårfjerningsmiddel gel eller en shaver til at fjerne hår på den ventrale abdomen.
3. Monter dyret på operationsbordet bord ved hjælp laboratorium tape til at holde det i et spread-eagled position. En metallisk drift board tillader anvendelsen af ​​en varmepude nedenunder at tilvejebringe temperaturen støtte under operationen. Vi manuelt styre temperaturen af ​​varmepuden, som er en forbruger-grade enhed til hjemmebrug. Temperaturen holdes mellem 35-38 °. Den metalliske drift bord er også let at sterilisere mellem procedurer.
4. Desinficere området med et desinfektionsmiddel som chlorhexidin, efterfulgt af en ethanol-vaskevæsken. Gentag denne procedure tre gange, for at sikre tilstrækkelig desinfektion. Dette vil også fjerne eventuelle rester af udskårne stykker af hår, hvis det findes.
5. Med en saks lave et snit gennem kropsvæggen for at blotlægge den abdominale indvolde.
6. Brug en vatpind, skubbe indvoldene ud til siden for at blotlægge de store kar i maven. Indvoldene er placeret på et stykke gaze, der er fugtet med varmt saltvand at holde den fugtig.
7. Anvendelse af stump dissektion, meget omhyggeligt dissekere den abdominale aorta bort fra det omgivende væv. Vær meget forsigtig med at dissekere fartøjet væk fra inferior vena cava. Der vil være en eller flere grene, såsom lænde arterie, der skal løftes forsigtigt og kauteriseret. Den del af dissekeret aorta bør være under de renale fartøjer og over forgreningen af ​​aorta til de femorale arterier. Dette afsnit kan tjene som donor materiale til så manges to modtagere, afhængigt af hvor mange forgrening fartøjer findes, og størrelsen af ​​donordyret.
8. Binde en sutur lige under de renale arterier, og en anden lige over bifurkationen. Med en saks opdele aorta, fuldt skylles transplantatet med saltvand indeholdende 200 U / ml heparin. Meget omhyggeligt holde den ene ende af beholderen og drypper saltvandsopløsningen så det kører gennem beholderen ved hjælp af tyngdekraften. Lad ikke luftbobler løber gennem beholderen. Håndtere enderne af beholderen så lidt som muligt ellers intima kan blive beskadiget resulterer i thrombose senere. Fjerne den fra felt og umiddelbart anbringes i en beholder med iskoldt saltvand. Tillad donordyret at exsanguinate.

3. Modtager Operation

1. Bedøve dyret som ovenfor og anvende en hårfjerningsmiddel gel eller bruge en shaver til at fjerne hår på maven. Lige før snittet vi administrere en dosis af buprenorphin subkutant ved 0,1 mg / kg til at etablere analgesi.
2. Mount dyret på operationsbordet feltet ved hjælp af laboratorie tape. Dyret skal monteres på en varm driftsfasen, der vil bidrage til at opretholde legemstemperatur under operationen.
3. Anvende gentamycin ophthalmisk salve til øjnene for at forhindre dem i at tørre ud.
4. Desinficere maven, efterfulgt af en ethanol-vaskevæsken. Gentag denne procedure tre gange, for at sikre tilstrækkelig desinfektion.
5. Kontroller tilstrækkeligheden af ​​anæstesi igen før man går videre til næste trin.
6. Lav en midtlinjeincision gennem huden og kroppen væggen i to etaper, og pas på ikke at kollidere med væv nedenunder.
7. Indsæt en spreder til at holde den abdominale indsnit åben. Punkt skrue-enheden mod den bagerste ende for at holde hovedparten af ​​klemmen af ​​vejen.
8. Fugt et kvadrat af steril gaze med saltvand og placer det over tarmene. Med fingeren forsigtigt på gaze, skal du indsætte en vatpind under tarmene og forsigtigt afspejle tarmene over til side, så de sidder på toppen af ​​gaze. Tag et stykke gaze, læg den på tarmene og våd det med saltvand.
9. Fjerne enhver fedtvævet dækker aorta og inferior vena cava (IVC). Vær blid. Det IVC er meget skrøbelig.
10. Forsigtigt med pincet for dissekere den infrarenale aorta fra IVC. Rydde et område stort nok til at tilvejebringe plads til to klemmer med tilstrækkelig fartøj mellem dem, således at når fordelt, vil der være tilstrækkelig fartøj, som transplantatet kan sutureres. Når dissekere, se efter kargrene. Om nødvendigt ætse dem med en lav temperatur cauterizer.
11. Indsæt en vaskulær klemme lige under nyrearterie og en anden lige over forgreningen.
12. Skær aorta. Enderne af aorta vil normalt oprulles, hvilket efterlader et mellemrum på omkring 5 mm. Check for hæmostase. Hvis klemmerne fungerer korrekt, bør kun en lille mængde blod flygte efter snittet. Hvis blødningen fortsætter, skal du kontrollere klemmer for at være sikker intet er interferensArbejde med dem. Bemærk, at ingen af ​​aorta fjernes. Det er blot delt.
13. Skyl de afskårne ender med hepariniseret saltopløsning (200 U / ml) og derefter fjerne den ekstra opløsning med en vatpind.
14. Tack implantatet på plads ved hjælp af tre diskontinuerlige suturer i hver ende. Bare sutur den ene side af anastomose i hver ende, og derefter udfylde resten med en kontinuerlig løbende sutur eller mere diskontinuerlige suturer. Syv til otte diskontinuerlige suturer er tilstrækkelig. Hvis du bruger en kørende sutur, skal du sørge for at karvæggene forblive afslappet, og at du ikke forårsager stenose ved anastomose.
15. Fjern forsigtigt klemmen ved kraniale ende og se efter utætheder på suturen linjer. En lille mængde udsivning er OK at give det stopper inden for ca et minut. Hvis der er mere end det, er det muligt at anvende en enkelt søm for at stoppe blødningen.
16. Tryk forsigtigt på aorta over anastomose site med en fugtet bomulds applikator, og derefter fjerne den anden klemme. Tryk forsigtigt ogfrigive et par gange og kontrollere, at aorta vises patentet. Transplantatet bliver perfunderes øjeblikkeligt og en impuls skal være synlig.
17. Fjern gaze dækker tarmene og flytte dem tilbage på plads. Undgå vrid i tarmen og opretholde en normal anatomiske orientering.
18. Luk muskellaget med 5-0 Vicryl.
19. Luk huden ved hjælp af 5-0 eller 6-0 prolene.
20. Behandl mus subkutant med carprophen ved 5 mg / kg at forøge analgesi før afslutning anæstesi.
21. Giv musen 0,5-0,8 ml saltvand subkutant.
22. Placer musen i en opvarmet bur at komme sig. Overvåge det nøje under restitution for at være sikker på, at det er i bedring normalt. 2-3 timer efter operationen, skal musen opføre sig relativt normalt. Ved 12 timer post-op, behandle dyret med buprenorphin subkutant ved 2 mg / kg for analgesi. Hvis det på noget tidspunkt er dyret bøjet, så støj eller udviser et begrænset bevægelsesområde, undersøge problemet. Hvisen endelig årsag ikke kan etableres og fast, bør dyret aflives pr institutionelle protokoller. Ved 24 hr dyret skal have en ny dosis af carprophen subkutant ved 5 mg / kg. Bagben lammelse indikerer et mislykket anastomose eller en trombe. I denne situation bør dyret aflives.

Representative Results

Figur 1 viser et aortaimplantatet. De hvide pile angiver suturen linjer. Et patent graft en synlig impuls. Figur 2 viser et typisk forsøg, hvor modtageren overlevelse blev fulgt i en periode på 56 dage. En gruppe bestod af vildtype (C57BL / 6 x FVB) modtagende mus transplanteret med BALB / c aorta. Den anden gruppe, betegnet "KO" består af modtagere (C57BL / 6 x FVB) deficiente i ekspression af hæm-oxygenase-1, hvilket resulterer i thrombose af transplantaterne inden for 24 timer. Især resulterer dette i død af alle modtagere, som vist i figuren. Figur 3 viser ekko målinger af IVC og abdominale aorta i et normalt dyr og i en transplantatmodtager. Bemærk, at implantatet er patentet og ligner den ikke-transplanterede aorta.

Figur 1.En visning af et transplanteret aorta. De hvide pile angiver suturen linjer.

Figur 2. Kaplan-Meier-afbildninger af overlevelse efter aorta transplantation i to grupper af mus transplanteret med aorta fra en BALB / c mus. "KO" betegner modtagere som mangler ekspressionen af ​​hæm-oxygenase-1, hvilket resulterer i thrombose af aorta transplantater inden for 24-48 timer. "WT" betegner vildtype-kuld. Gengivet fra: Kulilte redder hæm oxygenase-1-mangel mus fra arteriel trombose i allogen aorta transplantation, Chen B, Guo L, Fan C, Bolisetty S, Joseph R, Wright MM, Agarwal A, George JF. Am J Pathol. 2009 Jul; 175 (1) :422-9 med tilladelse fra Elsevier.

Figure 3. Echo billeddannelse af inferior vena cava (IVC) og abdominale aorta in vivo i en normal mus (venstre panel) og i en aorta transplantatmodtager (højre panel). Billederne blev fremstillet med en Visualsonics Vevo 660 instrument. Stjernerne angiver lumen af ​​skibene.

Discussion

Musemodeller for aorta transplantation giver en række fordele, fordi mus er meget veldefineret immunogenetically ^9,12,13, og de ​​let kan manipuleres til at ændre deres ekspression af specifikke gener, hvis det ønskes. Som nævnt i indledningen, karkirurgi i musen er sværere end de fleste modeller på grund af størrelsen af ​​beholderne. Selv de store arterier, såsom aorta er normalt ikke mere end 100-200 um i indre diameter, så at manipulere disse fartøjer kræver en betydelig mængde af færdigheder og fingerfærdighed ^8,14. Den mest almindelige komplikation observeret i denne operation af dem lige begyndt at implementere systemet er hind-ben lammelse, sædvanligvis forårsaget af trombose som følge af skade på intima ved hårdhændet håndtering eller fastspænding. De fleste af klemmerne markedsføres af firmaer, der sælger værktøjer passer til mikrokirurgi danner for meget tryk, der skal anvendes til mus, med tryk sædvanligvis større end 25 g / ^cm2. The CLAmps vi bruger, er glat, med et tryk på 2 g / cm ^2, et tryk, der er lige nok til at opnå hæmostase og ikke beskadige skibene. Nogle kirurger foretrækker at bruge suturen snarere end klemmer. Vi anbefaler ikke denne praksis, fordi det er en metode, der er stærkt afhængig af dens evne til kirurgen at måle det korrekte tryk og efter vores mening, kan bidrage til en lavere succesrate. Med praksis bør overlevelsesrater på 90% eller mere forventes.

Suturering teknik til end-to-end anastomoser er en kritisk færdighed, der er erhvervet med erfaring. Afhængig af tidligere erfaring med kirurgiske teknikker og håndelag, kan fuld beherskelse opnås efter 50-100 procedurer. Nyere undersøgelser tyder på alternative teknologier i anastomoser kan blive tilgængelige i fremtiden ^15.

Den primære begrænsning ved denne procedure er, ligesom de fleste mikrokirurgiske procedurer i mus, at et højt niveau af dygtighed ernødvendige for en vellykket gennemførelse og enkeltpersoner uden gode finmotorik kan aldrig opnå et højt færdighedsniveau. Men med praksis, kan de fleste individer opnå en acceptabel overlevelse. Den lille størrelse af de væv medfører også yderligere begrænsninger, fordi størrelsen af ​​implantatet er meget lille, så mængden af ​​materiale til efterfølgende analyse er begrænsende. Den største fordel ved modellen er de godt karakteriserede Immunogenetics af mus, den brede tilgængelighed af talrige indavlede stammer, transgene mus og knockout-mus, der giver mulighed for meget nyttige eksperimenter at løse molekylære mekanismer in vivo.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Vascular Clamps	Fine Science Tools	00396-01 (Size B-1)
Dumont Forceps	Fine Science Tools	11293-00
10-0 Needled microsuture	AROSurgical	TK-107038
Straight scissors	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-5620
Low temperature cauterizer	Beaver-Visitec International	8441000
Self retaining retractor	World Precision Instruments	14240