Analyse af SNARE-medieret membranfusion anvendelse af en enzymatisk Cellefusion Assay
Summary
Vi har udviklet en cellefusion assay, der kvantificerer SNARE-medierede membranfusionsteknikker begivenheder ved aktiveret ekspression af β-galactosidase.
Abstract
De interaktioner mellem SNARE (s oluble N-ethylmaleimid-følsom faktor en ttachment protein re ceptor) proteiner på vesikler (v-Snares) og på målgrupperne membraner (t-Snares) katalyserer intracellulære vesikelfusion 1-4. Rekonstitutionsanvisninger assays er afgørende for at dissekere mekanismen og reguleringen af SNARE-medieret membranfusion 5. I en cellefusion assay 6,7, er SNARE proteiner udtrykt ektopisk på celleoverfladen. Disse "vendt" SNARE proteiner drive celle-celle fusion, hvilket viser, at snarer er tilstrækkelige til at smelte cellemembraner. Fordi cellefusion assay er baseret på mikroskopisk undersøgelse, er mindre effektiv, når anvendt til at analysere multiple v-og t-SNARE interaktioner kvantitativt.
Her beskriver vi en ny assay 8, der kvantificerer SNARE-medierede celle fusionsbegivenheder med aktiveret ekspression af β-galactosidase. Tokomponenter i Tet-Off genekspressionssystem 9 anvendes som en tæller systemet: tetracyclin-reguleret transaktivator (tTA), og et reporterplasmid, der koder for LacZ-genet under kontrol af tetracyclin-responselement (TRE-LacZ). Vi transficere tTA i COS-7-celler, som udtrykker vippet v-SNARE proteiner på celleoverfladen (V-celler) og transficere TRE-LacZ i COS-7-celler, som udtrykker vippet t-SNARE proteiner på celleoverfladen (T-celler) . SNARE-afhængig fusion af V-og T-celler resulterer i binding af tTA til TRE, den transkriptionelle aktivering af LacZ og ekspression af β-galactosidase. Aktiviteten af β-galactosidase kvantificeres ved hjælp af en kolorimetrisk metode ved absorbans ved 420 nm.
De vesikel-associerede membranproteiner (overlæder) er V-Snares, der bor i forskellige post-Golgi vesikulær rum 10-15. Ved at udtrykke Vamps 1, 3, 4, 5, 7 og 8 på samme niveau, sammenligne vi deres membran fusion, som anvender den enzymatiske cellefusion assay. Ud fra spektrometrisk måling, giver dette assay en kvantitativ fremgangsmåde til analyse SNARE-medieret membranfusion og for højt gennemløb undersøgelser.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den oprindelige cellefusion assay 6 bestemmer SNARE-medierede celle fusionsbegivenheder ved fluorescensmikroskopi. Her beskriver vi en innovativ assay, der kvantificerer SNARE-medierede celle fusionsbegivenheder med aktiveret ekspression af β-galactosidase og spektrometrisk måling. Anvendelse af dette assay, vi rutinemæssigt analyseres 15-20 v-og t-SNARE kombinationer i et enkelt eksperiment. Ved anvendelse af flowcytometri til måling SNARE ekspression på celleoverfladen, vi titreres ekspressionsniveauer…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde understøttes af startup midler fra University of Louisville og CA135123 fra National Institutes of Health (til CH).
Materials
| Name of reagent and equipment | Company | Catalog number |
| DMEM | Invitrogen | 12800-017 |
| COS-7 cells | ATCC | CRL-1651 |
| tunicamycin | Sigma-Aldrich | T7765-5MG |
| pTet-Off | Clontech | K1620-A |
| pBI-G | Clontech | 6150-1 |
| lipofectamine | Invitrogen | 18324-012 |
| Enzyme-free cell dissociation solution | Invitrogen | 13151-014 |
| Rabbit anti-TET Repressor polyclonal antibody | Millipore | AB3541 |
| FITC-conjugated donkey anti-mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 715-095-150 |
| Laser scanning confocal microscope | Olympus | FV1000 |
| FACSCalibur flow cytometer | BD Biosciences | |
| β-Galactosidase Enzyme Assay System with Reporter Lysis Buffer | Promega | E2000 |
| Model 100-40 UV-VIS spectrophotometer | Hitachi | C740843 |
References
- Rothman, J. E. Mechanisms of intracellular protein transport. Nature. 372, 55-63 (1994).
- Jahn, R., Lang, T., Sudhof, T. C. Membrane fusion. Cell. 112, 519-533 (2003).
- Bonifacino, J. S., Glick, B. S. The mechanisms of vesicle budding and fusion. Cell. 116, 153-166 (2004).
- Jahn, R., Scheller, R. H. SNAREs–engines for membrane fusion. Nature. 7, 631-643 (2006).
- Weber, T. SNAREpins: minimal machinery for membrane fusion. Cell. 92, 759-772 (1998).
- Hu, C. Fusion of cells by flipped SNAREs. Science (New York, N.Y). 300, 1745-1749 (2003).
- Hu, C., Hardee, D., Minnear, F. Membrane fusion by VAMP3 and plasma membrane t-SNAREs. Experimental cell research. 313, 3198-3209 (2007).
- Hasan, N., Corbin, D., Hu, C. Fusogenic Pairings of Vesicle-Associated Membrane Proteins (VAMPs) and Plasma Membrane t-SNAREs – VAMP5 as the Exception. PloS one. 5, e14238 (2010).
- Gossen, M., Bujard, H. Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89, 5547-5551 (1992).
- Hanson, P. I., Heuser, J. E., Jahn, R. Neurotransmitter release – four years of SNARE complexes. Current opinion in neurobiology. 7, 310-315 (1997).
- McMahon, H. T. Cellubrevin is a ubiquitous tetanus-toxin substrate homologous to a putative synaptic vesicle fusion protein. [see comments. Nature. 364, 346-349 (1993).
- Steegmaier, M., Klumperman, J., Foletti, D. L., Yoo, J. S., Scheller, R. H. Vesicle-associated membrane protein 4 is implicated in trans-Golgi network vesicle trafficking. Molecular biology of the cell. 10, 1957-1972 (1999).
- Zeng, Q. A novel synaptobrevin/VAMP homologous protein (VAMP5) is increased during in vitro myogenesis and present in the plasma membrane. Molecular biology of the cell. 9, 2423-2437 (1998).
- Galli, T. A novel tetanus neurotoxin-insensitive vesicle-associated membrane protein in SNARE complexes of the apical plasma membrane of epithelial cells. Molecular biology of the cell. 9, 1437-1448 (1998).
- Wong, S. H. Endobrevin, a novel synaptobrevin/VAMP-like protein preferentially associated with the early endosome. Molecular biology of the cell. 9, 1549-1563 (1998).
