효소 세포 융합 분석을 사용하여 올가미로 인한 막 퓨전 분석
Summary
우리는 β-갈 락토의 활성화 표현으로 올무로 인한 막 퓨전 이벤트를 단정 지을 세포 융합 분석을 개발했습니다.
Abstract
스네어 (들 oluble N-ethylmaleimide에 민감한 요소 ttachment 단백질 재를 ceptor) 소포 (V-그물)에 및 대상 멤브레인에 단백질의 상호 작용 (T-올무) 세포 소포의 융합 1-4 catalyze. Reconstitution의 assays는 올무로 인한 막 융합 (5)의 체계 및 규정을 해부에 필수적입니다. 세포 융합 분석 6,7에서 스네어 단백질은 세포 표면에 ectopically 표현됩니다. 이러한 올무가 세포 세포막을 융합하기에 충분한 것으로 입증, 스네어 단백질 드라이브 세포 세포 융합 "을 뒤집힌." 세포 융합 분석은 현미경 분석을 기반으로하기 때문에 여러 V-와 t-올무 상호 작용 양적 분석하는 데 사용하면 덜 효율적이다.
여기 β-갈 락토의 활성화 표현으로 올무로 인한 세포 융합 이벤트를 단정 지을만한 새로운 검정 8 설명합니다. 두테트라 사이클린 제어 transactivator (TTA) 및 테트라 사이클린 – 응답 요소의 제어 (트레 – LacZ)에서 LacZ 유전자를 인코딩 플라스미드 기자 : Tet 오프 유전자 발현 시스템 9의 구성 요소는 판독 시스템으로 사용됩니다. 익스프레스 익스프레스는 세포 표면에 t-올무 단백질을 뒤집은 것이 COS-7 세포 (T-세포)로 세포 표면의 V-스네어 단백질 (V-세포)와 transfect 트레 – LacZ를 뒤집힌 것을 COS-7 세포에 우리 transfect TTA . 트레 전사 LacZ의 활성화 및 β-갈 락토 표현에 TTA의 바인딩의 V-및 T-세포 결과의 올무에 의존 융합. β-갈 락토의 활동은 420 nm의에서 흡수하여 colorimetric 방법을 사용하여 정량하고 있습니다.
소포 – 관련 막 단백질 (VAMPs)는 다양한 사후 Golgi 기공을 갖는 구획에 10-15을 거주 V-올무 있습니다. 동일한 수준의 VAMPs 1, 3, 4, 5, 7, 8을 표현함으로써, 우리는 막 융합을 비교효소 세포 융합 분석을 사용하여 활동. spectrometric 측정을 바탕으로,이 분석은 스네어로 인한 막 융합을 분석 및 높은 처리량을 연구 양적 접근 방식을 제공합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
원래 세포 융합 분석 6 형광 현미경으로 올무로 인한 세포 융합 이벤트를 결정합니다. 여기 β-갈 락토 및 spectrometric 측정의 활성화 표현으로 올무로 인한 세포 융합 이벤트를 단정 지을 혁신적인 분석을 설명합니다. 이 분석을 사용하여, 우리는 정기적으로 15 분석 – 20 V-와 t-올무 한 실험에서 조합. 세포 표면에 올무 식을 측정하는 유동 세포 계측법을 사용하여, 우리는 VAMPs의 표현 수준을 …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 국립 보건원에서 루이스 빌과 CA135123 대학 (CH까지)에서 시작 자금에 의해 지원됩니다.
Materials
| Name of reagent and equipment | Company | Catalog number |
| DMEM | Invitrogen | 12800-017 |
| COS-7 cells | ATCC | CRL-1651 |
| tunicamycin | Sigma-Aldrich | T7765-5MG |
| pTet-Off | Clontech | K1620-A |
| pBI-G | Clontech | 6150-1 |
| lipofectamine | Invitrogen | 18324-012 |
| Enzyme-free cell dissociation solution | Invitrogen | 13151-014 |
| Rabbit anti-TET Repressor polyclonal antibody | Millipore | AB3541 |
| FITC-conjugated donkey anti-mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 715-095-150 |
| Laser scanning confocal microscope | Olympus | FV1000 |
| FACSCalibur flow cytometer | BD Biosciences | |
| β-Galactosidase Enzyme Assay System with Reporter Lysis Buffer | Promega | E2000 |
| Model 100-40 UV-VIS spectrophotometer | Hitachi | C740843 |
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