Summary
يتم استخدام الجسيمات الدقيقة velocimetry صورة (μPIV) لتصور الصور المقترنة من الجسيمات الدقيقة المصنفة في تدفقات الدم التي هي عبر المترابطة لإعطاء لمحة سرعة دقيقة. معدل القص، وأقصى سرعة، سرعة شكل الملف الشخصي، ومعدل التدفق، كل منها لديه التطبيقات السريرية، ويمكن أن تستمد من هذه القياسات.
Abstract
يتم استخدام الجسيمات الدقيقة velocimetry صورة (μPIV) لتصور الصور المقترنة من الجسيمات الدقيقة المصنفة في تدفقات الدم. هذه الصور هي عبر المترابطة لإعطاء لمحة سرعة دقيقة. ويرد بروتوكول لقياسات μPIV من تدفقات الدم في microchannels. على نطاق دوران الأوعية الدقيقة، لا يمكن اعتبار الدم السائل متجانسة، كما هو تعليق جسيمات مرنة معلقة في البلازما، والسائل النيوتونية. معدل القص، وأقصى سرعة، سرعة شكل الملف الشخصي، ومعدل التدفق يمكن استخلاصها من هذه القياسات. العديد من المعايير الأساسية مثل عمق التنسيق، وتركيز الجسيمات، والامتثال نظام، وتعرض من أجل ضمان بيانات دقيقة ومفيدة جنبا إلى جنب مع أمثلة ونتائج ممثلة لمختلف hematocrits وظروف التدفق.
Introduction
جسم الإنسان يحتوي على العديد من السفن ذات أقطار أقل من 50 ميكرون، والتي هي موقع تبادل الرئيسي بين الدم والأنسجة. دراسة تدفق الدم في هذه الأوعية يمثل تحديا كبيرا بسبب كل من حجم قياسات وخصائص السائل من الدم. هذه القياسات، بما في ذلك التدرج الضغط، والقص عند الحائط، وملامح سرعة في الشرايين والأوردة، هي عوامل أساسية مرتبطة مع الاستجابات الفسيولوجية. هناك الآن فرصا غير مسبوقة لحل هذه التحديات قياس، وذلك بفضل تقنيات تجريبية جديدة على النطاق الجزئي لدراسة دوران الأوعية الدقيقة ويحل هذه المشكلة متعددة النطاقات.
الدقيقة الجسيمات velocimetry صورة (μPIV) هو ومقرها الجسيمات تدفق تقنية التصور الذي يتم استخدامه لتقييم ملامح سرعة تدفق الدم في microchannels عبر ارتباط الصليب. وقد استخدم μPIV، أول من طور سانتياغو آخرون، مع hemorheologyدراسات منذ Sugii وآخرون. في عام 2001 استخدمت تقنية لقياس تدفق الدم في 100 ميكرون أنابيب زجاجية مستديرة 1،2. مناهج مختلفة في الوجود μPIV. الكاميرات عالية السرعة يمكن استخدامها لربط حركة خلايا الدم الحمراء (كرات الدم الحمراء)، والصور نابض يمكن استخدامها لربط حركة الجسيمات التتبع. يمكن أن يقترن أي من هذه الخيارات مع المجهر تستقيم أو المقلوب، اعتمادا على التطبيق. في كلتا الحالتين، فإن النتيجة هي سرعة الشخصي 2D. وثمة نهج آخر هو استخدام المجهر متحد البؤر لتحقيق محات 2D و 3D. وقد تم تطبيق هذا الأسلوب ل3،4،5 الدم.
مايكرو نطاق التعريف الشخصية لديه العديد من المضاعفات مقارنة مع التعريف الشخصية الماكرو. في التعريف الشخصية ماكرو البيانات يمكن أن تقتصر على طائرة واحدة من خلال ورقة من الضوء، ولكن في الدقيقة الإضاءة حجم النطاق هو ضروري. إضاءة حجم مشكلة أكبر للتصوير من تدفقات الدم الصغرى، حيث أن كرات الدم الحمراء نفسها كبيرة بالمقارنة مع جhannels، وباستخدام كرات الدم الحمراء كما الجزيئات التتبع يؤدي إلى عمق الارتباط (DOC) والتي يمكن أن تقلل بشكل كبير من دقة النتائج عبر الارتباط 6،7،8. بعد Wereley وآخرون (1998) وDOC لقناة طويل القامة 40 ميكرون مع RBC كما استشفاف هو 8.8 ميكرون، بينما مع 1 ميكرومتر الجسيمات التتبع وDOC هو 6.7 ميكرون. هذا الاختلاف يصبح أكثر وضوحا عند تغيير القناة وارتفاع التكبير. بالإضافة إلى ذلك، كرات الدم الحمراء هي مبهمة، وزيادة كثافة كرات الدم الحمراء في تدفق يسبب صعوبات التصوير. وقد دعا الاستشعاع الجزيئات التتبع، استخدم لأول مرة من قبل سانتياغو وآخرون (1998)، كأداة لتقليل تأثير الجسيمات خارج نطاق التركيز، عند استخدام جسيمات أصغر ممكن. باستخدام 1 ميكرون الاستشعاع قطر المجهرية الدقيقة إلى جانب وجود الليزر هو النهج الوحيد الذي قد يقلل من عمق مشكلة التركيز في التصوير الجزئي تدفق الدم 10. وهناك العديد من الاستعراضات الحالية لدولة μPIV تكhnology، كل من الذي يسلط الضوء على أهمية μPIV لدراسات تدفق الدم 11،12. يجب أن تؤخذ عدة اعتبارات هامة في الاعتبار عند استخدام μPIV للدم. على المستوى الجزئي، فإن حجم دوران الأوعية الدقيقة، لا يمكن اعتبار الدم السائل متجانسة، كما هو تعليق مرونة خلايا الدم الحمراء (كرات الدم الحمراء)، وخلايا الدم البيضاء الكبيرة، والصفائح الدموية والبروتينات الأخرى معلقة في السوائل النيوتونية (البلازما) .
لمحات سرعة تقاس هنا يمكن أن تستخدم لقياس خصائص معينة من تدفقات الدم الصغيرة. العوامل الهامة في microhemorheology هي معدل تدفق الدم، وشكل الملف الشخصى سرعة، وإجهاد القص في جدار السفينة. هذه المعلومات لها آثار السريرية، كما دوران الأوعية الدقيقة هو موقع لتبادل المغذيات في الجسم، وهذا التبادل هو التي تعتمد على القص. هناك العديد من الدراسات الاستعراض الحالي عن حالة البحوث في دوران الأوعية الدقيقة وكذلك 13،14،15.
قدم هنا هو بروتوكول لقياسات μPIV من تدفقات الدم في polydimethylsiloxane (PDMS) microchannels. ملفقة قنوات PDMS في المنزل في أعقاب مصادر في المادة 1 من البروتوكول. وتم الحصول على عينات دم الخنازير من المسالخ المعتمدة وتنظيفها بعد المادة 2 من البروتوكول. تم الحصول على جميع البيانات باستخدام LaVision MITAS μPIV النظام، كما هو موضح في القسم 3 من البروتوكول. تتكون مجموعة المتابعة من والثانية: YAG الليزر (الموجة الجديدة للبحوث، الولايات المتحدة الأمريكية) واتفاقية مكافحة التصحر الكاميرا (صورة مكثفة، Lavision) التي تسيطر عليها وحدة برمجة اثار، المجهر الفلورسنت بالإضافة إلى مرحلة تتحرك في 3 محاور، وجهاز كمبيوتر، بالإضافة إلى كاميرا عالية السرعة (DALSA 1M150، هولندا) وأضيف لتصور من كرات الدم الحمراء نفسها. وترتبط كل من الكاميرات إلى منفذ مربع البصرية 2 (مخصص بواسطة زايس، ألمانيا). في نموذجي في القياسات المجراة من تدفق الدم، ويستخدم المجهر تستقيم لتتبع كرات الدم الحمراء فيmselves، في حين نموذجي في تطبيقات المختبر ويستخدم مجهر مقلوب لتعقب جزيئات التتبع. في هذا فريدة من نوعها المزدوج انشاء، مربع البصريات يسمح على حد سواء استشفاف ليمكن تصوير باستخدام مجهر مقلوب. وقدم الدم في الرقائق عن طريق ضخ حقنة عالية الدقة (Nexus3000، Chemyx شركة، الولايات المتحدة الأمريكية). ويظهر رسم تخطيطي للنظام في الشكل 1، حيث الجزء العلوي من هذا الرقم يمثل 140 ميكرون بنسبة 40 ميكرون قنوات مستطيلة ملفقة من PDMS، ويمثل الجزء السفلي النظام بأكمله بما في ذلك الكاميرات، ليزر، ضخ حقنة و المجهر.
μPIV الحالي مجموعة عمليات المتاحة، وعادة مع البرمجيات الاحتكارية، وتشمل TSI، DANTEC حيوية، وLaVision. ويمكن تحقيق معيار خوارزميات عبر الارتباط من خلال العديد من خيارات البرمجيات، بما في ذلك MATLAB. البرنامج ليس المفتاح، وفهم ما تتوافق مربعات الحوار إلى سيخدم رياضيا استخدامR أفضل بكثير. في هذا البروتوكول ديفيس، تستخدم البرمجيات LaVision في الملكية أو MATLAB. البروتوكول لا تعتبر برامج محددة، ولكن الخيارات القائمة قد تكون في أماكن مختلفة في حزم البرامج المختلفة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. رقاقة تلفيق
وتتمثل الخطوة الأولى لإنشاء أو شراء متناهية الخاص بك. هناك العديد من الخيارات للمواد الرقائق الدقيقة.
واحدة من المواد الأكثر شيوعا التي تم اختيارها هي بولي (dimethylsiloxane) (PDMS). هناك العديد من المنشورات على الاتجاهات لتلفيق PDMS من خلال الطباعة الحجرية الناعمة 16،17،18.
بمجرد ملفقة قناة PDMS، وهناك العديد من العلاجات السطحية المتاحة لعكس hydrophobicity الطبيعي. العلاج البلازما الاوكسيجين هو خيار شائع.
تشو، إليس، وفولكر (2009) تعطي استعراض المعالجات السطحية وكيف أنها تؤثر PDMS. هذه النتائج هي للمياه ومع ذلك، والدم لديه خصائص مختلفة. وقد أجريت الدراسة على ما أن المعالجة السطحية يعني للدم من قبل بيتس وآخرون (2012A).
للنتائج المعروضة هنا، الأسطح رقاقة والشرائح الزجاجية كانواالمستعبدين من كان كلا تتعرض لبلازما الاوكسيجين لمدة 45 ثانية ثم ضغطت معا مما أدى بحزم في السندات دائم.
2. إعداد الدم
- جمع عينات الدم من منشأة المعتمدة. على سبيل المثال الدم الخنزيري يمكن استخدامها مع حامض ethylenediaminetetraacetic (EDTA) بوصفها مضادة للتخثر. إضافة 1 غرام EDTA مع 4 مل من الماء، ثم قم بإضافة الحل إلى 1 لتر من الدم الكامل، والاختلاط 10X بلطف.
عند التقاط عينات من الدم، والسماح لهم لتبرد ببطء إلى RT. يجب أن تكون عينات دماء جديدة، واستغلالها بالشكل الأمثل اليوم يتم جمعها للحفاظ على خصائص الريولوجية من الدم.
قد تكون مبردة العينات مرة واحدة على RT، وسوف ومع ذلك كله دون تخثر الدم تكون غير صالحة للاستعمال بعد التبريد. اعتمادا على تخثر، ويمكن أن تبقى كرات الدم الحمراء المبردة لمدة تصل إلى 42 يوما، ويمكن أن تظل الدم الكامل المبردة لمدة 35 يوما، ولكن التلوث يكون ممكنا في غير ممرفق edical 21.
بالإضافة إلى ذلك، كن حذرا من طريقة جمع عينات مع الأبقار أو الخنازير، وتجنب التلوث من قبل نخاع العظم.
- الطرد المركزي عينات الدم 3X في 3،000 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقيقة في كل مرة. بعد الطرد المركزي الأول، وإزالة البلازما والغلالة الشهباء، وتجاهل. ومن المسلم به عموما أسهل لإزالة البلازما أولا، ثم تجاهل أو الاحتفاظ بها لاستخدامها في المستقبل، ثم لإزالة الغلالة الشهباء وحدها.
إدخال ماصة ببطء، وذلك لعدم خلط معطف الشهباء مرة أخرى في الدم. بعد إزالة معطف الشهباء، إضافة حوالي 20 مل من الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) وتخلط بلطف، recentrifuge. كرر الخطوة الأخيرة. بعد الطرد المركزي الثالث، إزالة برنامج تلفزيوني والمتبقية الغلالة الشهباء، وتجاهل.
ومن الممكن أيضا استخدام البلازما الأصلية بدلا من برنامج تلفزيوني إذا كنت ترغب في الحفاظ على خصائص تجميع الدم. تأكد من عدم خلط أي معطف الشهباء أو أبيضخلايا الدم في البلازما.
- أخذ خلايا الدم الحمراء تنظيفها (كرات الدم الحمراء) وتعليق في برنامج تلفزيوني أو البلازما بتركيزات المطلوب (hematocrits). تحقق hematocrits مع microcentrifuge (CritSpin FisherSci، الولايات المتحدة الأمريكية).
الدم بنسبة 10 إلى 20٪ الهيماتوكريت ينبغي أن يكون من الأسهل تصور من 40 أو 50٪ (الهيماتوكريت الفسيولوجية). في دوران الأوعية الدقيقة، والدم هو عادة نصف الهيماتوكريت من التداول الكلي، بحيث H = 20 غير كافية 15.
- إضافة الاستشعاع الجزيئات التتبع في التركيز المطلوب للعينات الدم. والقاعدة العامة هي أن يكون 10 جسيمات في إطار الارتباط، والتي يمكن أن تحسب في وقت مبكر.
على سبيل المثال، يتم إضافة 30 ميكرولتر من الجسيمات إلى 1 مل من محلول الدم لمجموعة المتابعة صورت في الفيديو. بدلا من ذلك، كرات الدم الحمراء نفسها يمكن الموسومة fluorescently.
- بالإضافة إلى ذلك، وجعل حل المعايرة مع الماء والانفلونزاorescing الجسيمات. وسيكون من الضروري لمعايرة نظام مع حل النيوتونية.
على سبيل المثال، عند استخدام هدفا 10X مع قناة على مقياس من 100 ميكرومتر، وتركيز مناسب ل300 ميكرولتر من الجزيئات مختلطة مع 15 مل من الماء المقطر. وثمة خيار آخر هو استخدام الجلسرين المخفف بالماء المقطر إلى اللزوجة من 3CP، والذي هو أقرب إلى اللزوجة الماكرو الدم.
3. القياسات μPIV
- الليزر سلامة: التحقق من درجة الحرارة والرطوبة. ارتداء النظارات المناسبة سلامة الليزر. إغلاق الستار الليزر أو تشغيل تسجيل ليزر على باب المختبر على لمنع الناس لا يتمتعون بالحماية من التعرض.
- ويرد الإجراء مع ديفيس البرامج في شريط الفيديو. لمزيد من التفاصيل يرجى الرجوع إلى دليل المستخدم لنظام محدد.
- قبل اتخاذ البيانات، يحتاج نطاق الكاميرا التي يمكن معايرتها باستخدام ميكرومتر.
- للحد من الامتثال للنظام، واستخدام اقصر أنابيب لد أصغر حقنة جامدة ممكن، مثل ميكرولتر هاميلتون Gastight حقنة 15 أو 50. للحد من تسرب الدم أو كمية الهواء في النظام، وختم أنابيب إلى حقنة وإلى رقاقة. ويمكن أن يتم هذا مع الغراء، PDMS أو الفازلين (والحرص على عدم تلوث الدم).
لملء الصغرى حقنة بالماء الذي تغلب عليه اسهم مع جزيئات التتبع استخدام أسلوب ارتجاعي لأن حجم الصغير حقنة عادة ما يكون أصغر بكثير من حجم لملء الفراغ.
يتكون لدينا طريقة ارتجاعي لملء الصغرى حقنة وقناة معا عن طريق إخراج القناة باستخدام حقنة بلاستيكية الثانوية. لذلك، أولا إزالة الصغرى حقنة الغطاس، ثم دفع السائل باستخدام حقنة بلاستيكية الكلاسيكية التي تعلق على منفذ للقناة، والسماح للتدفق السائل خارج الصغرى حقنة حتى كل microbubbles هي من الدقيقة حقنة، أو أنابيب رقاقة، وأخيرا وضع الجزء الخلفي الغطاس، وافصل حقنة بلاستيكية. وجود سيمكن التحقق R غياب microbubbles مع المجهر.
- مستوى ضخ حقنة لتحقيق الأنابيب الأفقية. برنامج ضخ حقنة لمعدل التدفق المطلوب.
يكون على بينة من آثار عابرة ممكن، مثل "تأثير عنق الزجاجة"، لنظام جامدة أو الامتثال للنظام أن تعديل معدل التدفق الفعلي. ويمكن تقدير مرات من سمات نظام بوصفها وظيفة من المواد وأبعاد النظام. (الفصل 2، ص 77-81، Tabeling، 2005)
- وضع رقاقة على خشبة المسرح المجهر وتبدأ المضخة. استخدام المياه مع الجسيمات لمعايرة النظام إلى سرعة الشخصي الأوسط ومعايرة DT (الوقت بين الصور نابض).
يجب أن الجزيئات تتحرك بين 5 و 10 بكسل بين الإطارات للحصول على علاقة جيدة 11. عندما معايرة، وتوخي الحذر لقياس في منتصف القناة. الطائرة التركيز في منتصف لديها أعلىسرعة 8.
إذا باستخدام قناة جولة، وتوخي الحذر من التظليل الآثار.
يتم عرض صورة عينة في الشكل 2، وذلك باستخدام كاميرا نابض، في حين أن الصورة العليا هي نبض أول وصورة أسفل هو نبض الثانية. يمكن أن ينظر إليه في الرقم الذي ألمع نقطة (الاستشعاع الجسيمات) هي الأكثر في التركيز.
- اختياري: من خلال اتخاذ البيانات على ارتفاعات مختلفة لمحة سرعة 3D يمكن بناؤها عن طريق إضافة نواقل مختلفة في صورة واحدة. ويعرض الفيديو روتين الذي تم تطويره لأتمتة هذه العملية.
- عند التقاط البيانات مع الدم، وملء المحاقن مع الكمية المطلوبة من الدم في نفس الطريقة كما الماء. برنامج ضخ حقنة لمعدل التدفق المطلوب، وتأخذ البيانات المطلوبة. ويرد مثال على الصور الخام التي تم الحصول عليها الشكل 2. كن حذرا من RBC الترسيب كذلك. إعادة تعبئة الحقنة كل تشغيل أو كلسيتم تشغيل أخرى تقلل من تصفية للRBC.
- بعد الحصول على الصور، يتم تنفيذ عبر ارتباط على أزواج صورة للحصول على حقول ناقل السرعة بين الصور. فمن المهم أن يكون الصور الجيد ان يكون هناك علاقة جيدة. قبل الربط، ويمكن أن يتم قبل معالجة لإزالة الضوضاء في الخلفية.
يتم ذلك عبر ارتباط بين النوافذ في الصور المجاورة، والتي يمكن أن تختلف في الحجم والشكل للتأثير على العلاقة. بعد عبر الارتباط، ويمكن أن يتم تجهيز آخر صورة لإزالة ناقلات خاطئة أو القيم المتطرفة.
وصف مفصل للخيارات المتاحة مختلفة ودقة بهم يمكن العثور عليها في بيتس وآخرون (2012b)، حيث تم العثور على أفضل معالجة للدم أن يكون الأسلوب من "صورة متداخلة" مع نظام التشغيل Windows مدد في طول وتتماشى مع تدفق . هذه العمليات يمكن القيام بذلك يدويا في برنامج مثل MATLAB، أو ضمن حزمة البرامج مع النظام الخاص بك. ال البرامج ليست مهمة، والرياضيات وراء العمليات هو أكثر أهمية ويمكن أن تؤثر على كل عملية من دقة البيانات الشخصية السرعة النهائية.
يمكن بلغ متوسط ناقلات الناتجة في الفضاء عبر القناة للحصول على ملامح السرعة اللحظية، ثم مرة أخرى في وقت بلغ متوسط للحصول على متوسط، لمحة سرعة ممثل. Kloosterman وآخرون (2011) تعطي تفسيرا من الخطأ في القياسات μPIV حيث عمق الميدان هو كبير. ويمكن الاطلاع على المناقشات بشأن الخطأ من تجهيز البيانات المقدمة هنا في بيتس وآخرون (2012b) لقياسات نابض وChayer وآخرون (2012) للقياسات عالية السرعة.
يتم عرض أمثلة لمحات سرعة في أرقام 3 و 4. ويعرض الشكل 3 لمحة واحدة لسرعة محور من 10 ميكرولتر / ساعة تدفق RBC في H = 10 ميكرومتر في قناة واسعة 140.
خيمة "> ويتحقق ذلك من تعريف واحد عن طريق حساب متوسط ناقلات المترابطة عبر القناة للحصول على سرعة الشخصي، ومن ثم متوسط في الوقت للحصول على قياس ممثل. في هذه الحالة، وبلغ متوسط 100 زوجا في وقت عبر مجال الرؤية.تم العثور على سبيل المثال من الملف الشخصي أعيد بناؤها 3D المتخذة لتدفق معايرة المياه في قناة 100 ميكرومتر مربع مع معدل تدفق المبرمجة من 30 ميكرولتر / ساعة في الشكل 4. في الشكل (4)، ويتم قياس الشخصية في فترات 1 ميكرون.
- اختياري: في تصور مجموعة المتابعة صور عالية السرعة التي يمكن اتخاذها في الظروف نفسها عن طريق التحول الكاميرات (ونظم الحصول على البيانات). هذا يمكن أن تكون مفيدة لتصور طبقة خالية من الخلايا في القناة، لتحديد كمية والتجميع. تحليل البيانات هي مختلفة قليلا (Chayer وآخرون، 2012).
أمثلة من الصور الضوء الأبيض مع وبدون RBC التجميع هي بريسيnted في الشكل 5 في H = 20. أعلى الصور يظهر H = 20 في PBS، الذي يزيل قدرة RBC إلى الكلي، في 1 ميكرولتر / ساعة. صورة أسفل هو H = 20 في بلازما الأم عند 0.5 ميكرولتر / ساعة. في الصورة أسفل، وتجميع مرئيا.
- إيقاف تشغيل النظام بطريقة آمنة عندما تم الانتهاء من القياسات. استخدام الإجراءات المناسبة سلامة الليزر حتى يتم إيقاف مصدر قوة الليزر تماما أسفل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
في جميع الأرقام، يتم ترك تدفق إلى اليمين في الصور الخام، وصعودا في لمحات السرعة المحسوبة. ويرد مثال من البيانات الخام التي تم الحصول عليها مع الدم في الهيماتوكريت H = 10 تتدفق في 10 ميكرولتر / ساعة في الشكل 2. قد يكون شاملا للارتباط البيانات الخام دون أية معالجة البيانات لتحقيق محات السرعة. وتناقش تأثير أساليب المعالجة المسبقة ومعالجة البيانات من قبل بيتس، وآخرون، (2012b). مثال لمحات سرعة الناتجة من بيانات مماثلة إلى الشكل 2 في hematorcrit H هو مبين = 10 ومعدل التدفق من 10 ميكرولتر / ساعة في الشكل (3)، لمحة 3D من معايرة الماء يظهر الشكل (4). الشكل 3 و 4 وشملت القياسية معالجة البيانات. هذه التشكيلات سرعة يمكن استخدامها لإجراء قياسات مثل الحد الأقصى للسرعة في مركز للقناة، فإن معدل التدفق في القناة، ومعدل القص في الجدار لظروف تدفق مختلف، قناة المشاركnfigurations، وphysiologies. الشكل 5 يعطي مثالا لصورة عالية السرعة مع وبدون تجميع من RBC. ويمكن أيضا صور عالية السرعة مثل تلك الموجودة في الشكل (5) أن تستخدم لحساب سرعة باستخدام ملفات تعريف الارتباط الصليب.
الشكل 1. مخطط للμPIV مجموعة المتابعة (أ) يمثل فيها ميكرون 140 ميكرون بنسبة 40 قنوات مستطيلة ملفقة من PDMS مع تدفق تتحرك من اليسار إلى اليمين و (ب) يمثل النظام بأكمله.
الشكل 2. مما أدى الخام بيانات الصورة نابض من نظام μPIV مع H = 10 في برنامج تلفزيوني بمعدل تدفق المبرمجة من 10ميكرولتر / ساعة (تدفق اليسار إلى اليمين). صورة العلوي هو نبض الأول.
الشكل (3). مما أدى الشخصي سرعة من النظام μPIV مع H = 10 في برنامج تلفزيوني بمعدل تدفق المبرمجة من 10 ميكرولتر / ساعة. يتم تدوير الشخصي لإظهار تدفق التصاعدي.
الشكل 4. مثال على الملف الشخصي سرعة 3D أعيد بناؤها من معايرة المياه في قناة 100 ميكرومتر مربع مع ملامح متعددة تؤخذ 1 ميكرومتر إربا. يتم تدوير الشخصي لإظهار تدفق التصاعدي. نقرةهنا لعرض أكبر شخصية.
الشكل 5. مثال على صور عالية السرعة حيث TOP) هو H = 20 في برنامج تلفزيوني في 1 ميكرولتر / ساعة (أي تجميع) وأسفل) هو H = 20 في بلازما الأم عند 0.5 ميكرولتر / ساعة (التجميع). وفي كلتا تدفق الصور واليسار إلى اليمين .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ويمكن استخدام μPIV لقياس تدفق الدم في نطاق من دوران الأوعية الدقيقة تعطي نظرة ثاقبة لعدد كبير من عمليات الهندسة الطبية والميكانيكية والكيميائية ذات الصلة. بعض من العوامل الرئيسية لحساب هي كثافة RBC أنفسهم، وتجميع والتشوه من RBC، تجميع أو حركة الجسيمات الدقيقة الاستشعاع، وتوطين من RBC في القنوات. يمكن أن تمثل كل من هذه لأنه إذا ما اتبعت المبادئ التوجيهية العامة المبينة أعلاه. هناك هو المرجعية الأساسية أن نأخذ في الاعتبار لقياس جيدة باستخدام هذا النظام. بادئ ذي بدء، تحديد مقدار الالتزام في النظام أو النظام المقترح. للحد من الامتثال استخدام اقصر من أنابيب ممكن وأصغر حقنة ممكن. نظم جامدة لديها أقل الامتثال، ولكن يمكن أن يؤدي إلى bottlenecking. على الرغم من صغر حجم القياسات، سوف تؤثر على الجاذبية RBC. حفظ المحقنة والأنابيب وقناة على نفس الارتفاع طق المثالي. ثانيا، تحديد تركيزات من الايقاف. ضمان وجود ما يكفي الاستشعاع الجزيئات التتبع في الحل وليس عالية جدا من تركيز RBC. سوف يزيد من كثافة الجسيمات التتبع لعينة لم نتغلب على التعتيم المتأصلة في كرات الدم الحمراء. سوف كمية الجسيمات التتبع تؤثر على الارتباط، ولكن وجود عدد كبير جدا من كرات الدم الحمراء جعل السائل مبهمة والجزيئات التتبع الصعب الصورة. يجب أن يبقى الهيماتوكريت العام للعينة منخفضة بما فيه الكفاية أن الطائرة منتصف القناة ولا يمكن تصوير بوضوح. هذا هو مقايضة بين الهيماتوكريت وحجم القناة. على عمق زيادة، وكمية من RBC بين العدسة والطائرة من قياس ينمو، حتى في hematorcrit منخفضة. من أجل صورة أعلى عينات hematorcrit أو قنوات أكبر، ويمكن استخدام طريقة "خلايا الشبح" في حين يتم استبدال الداخلية مبهمة من RBC مع السائل واضحة لجزء من RBC (غولدسميث وSkalak، 1975). ثالثا، تأكد من أن microscoوتركز المؤسسة العامة على متن الطائرة الأوسط للقناة. معرفة الارتفاع الحقيقي للقناة هو أمر حيوي لإيجاد الطائرة الأوسط. نضع في اعتبارنا حجم الجسيمات وحجم القناة، وحساب عمق الارتباط (DOC) في النظام الخاص بك (Wereley وآخرون، 1998). وDOC يمكن أن تؤثر بشكل كبير على دقة اللازمة لتحقيق في العثور على الطائرة الأوسط. وهناك فرق من واحد ميكرون يمكن أن تؤثر سلبا على دقة. مرة واحدة كمية من الجسيمات، تم العثور على حجم القناة، وDOC، والفرق في الوقت بين الصور نابض (DT) يجب أن يتم تحديدها. ضمان 5 إلى 10 بكسل من حركة الجزيئات بين النوافذ. حركة الجزيئات يجب أن تنسجم مع نظام التشغيل Windows الارتباط المبينة في القسم 3.9. أخيرا، تقرر على طريقة ما قبل المعالجة، معالجة أو بعد معالجة البيانات النواقل. العديد من الطرق المتاحة في الأدب، ولكن بعضها أكثر نجاحا من الآخرين عندما يطبق على الدم. طريقة "صورة المتداخلة" هو ADVised للتدفقات الدم (بيتس وآخرون، 2012b).
وثمة عامل آخر أن نأخذ في الاعتبار هو طبقة "خالية من الخلايا"، الذي تم توثيقه جيدا في microhemodynamics. هذا هو عدم وجود كرات الدم الحمراء في جدار القناة أو سفينة. في أعقاب الجسيمات التتبع الاستشعاع، المستخدم هو في الواقع بعد حركة البلازما. في مركز للقناة أو سفينة، وسرعة هو بحد أقصى وكلا سوف تتحرك بنفس السرعة. على الجدار، فإن البلازما يكون حركة لا يزال في حين سيكون هناك عدد قليل أو أي كرات الدم الحمراء الحاضر. في نطاق المعروضة هنا مع التكبير 10X، طبقة خالية من الخلايا ليست قابلة للقياس ولكن في تكبير العالي يجب المحاسبة عنها. أن الفيديو عالية السرعة تتيح لقياس سمك طبقة خالية من الخلايا.
الاستنتاجات
وقد استخدم μPIV لhemorheology والدراسات الطبية الحيوية منذ ما بعد تطويره. عندما يطبق على تدفقات الدم على النطاقمن دوران الأوعية الدقيقة، ويجب أن تمثل سلوك معقد من الدم ل. وقدم بروتوكول للقياسات μPIV من تدفقات الدم في microchannels هنا جنبا إلى جنب مع نصائح للتعامل مع الطبيعة المعقدة من الدم. وقد وردت عدة خيارات التصوير، بما في ذلك الصور نابض، صور عالية السرعة وخيار 3D فضلا عن المعلومات معالجة البيانات. في استخدام μPIV للبحوث تتدفق في الدم، وتأثير الأدوية والأمراض والعلاجات العلاجية على شكل ملف سرعة يمكن تحليلها. هذه القياسات المفيد الطب الحديث والهندسة منذ امتصاص المواد الغذائية والأدوية هو القص التابعة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgments
فإن الكتاب أود أن أشكر NSERC (العلوم الطبيعية والهندسة مجلس كندا) للحصول على التمويل، كاثرين Pagiatikis لمساعدتها في أشواط الأولي، سورة أبو ملوح وفريدريك فهيم لاختبار البروتوكول، ريتشارد بريفوست من LaVision، وشركة للدعم التقني، وغاي كلوتير من جامعة مونتريال للحصول على القرض من DALSA كاميرا عالية السرعة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| poly(dimethylsiloxane) (PDMS), i.e. Sylgard-184 | Dow-Corning | 3097358-1004 | |
| ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma Aldrich | E9884-100G | |
| poshpate buffered saline (PBS) | Sigma Aldrich | P5368-10PAK | |
| fluorescing micro particles | Microgenics/FisherSci | R900 | |
| glycerol (OPTIONAL) | Sigma Aldrich | G6279-500 ml | |
| microcentrifuge, i.e. CritSpin | FisherSci | 22-269-291 | |
| syringe, i.e. 50 μl Gastight | Hamilton | 80965 | |
| camera, i.e. Imager Intense, high speed | LaVision, Dalsa | Imager Intense | |
| microscope, i.e. MITAS | LaVision | MITAS | |
| Nd:YAG laser | New Wave Research | Solo-II | |
| syringe pump, i.e. Nexus3000 | Chemyx, Inc. | Nexus-3000 | |
| flexible tubing, i.e. Tygon | FisherSci | 14-169-1A | |
| data processing software, i.e. DaVis | LaVision | DaVis | |
| centrifuge, i.e. Thermo Scientific CL2 | Thermo Scientific | 004260F |
References
- Santiago, J. G., Wereley, S. T., Meinhart, C. D. A particle image velocimetry system for microfluidics. Experiments in Fluids. 25, 316-319 (1998).
- Evaluation of Velocity Measurement in Micro Tube by Highly Accurate PIV Technique. Sugii, Y., Okamoto, K., Nishio, S., Nakano, A. 4th International Symposium on Particle Image Velocimetry (PIV '01), 17-19 Sept. 2001, , 1-5 (2001).
- Park, J. S., Choi, C. K., Kihm, K. D. Optically sliced micro-PIV using confocal laser scanning microscopy (CLSM). Exp. Fluids. 37 (1), 105-119 (2004).
- King, M. R., Bansal, D., Kim, M. B., Sarelius, I. H. The effect of hematocrit and leukocyte adherence on flow direction in the microcirculation. Ann. of Biomed. Eng. 32 (6), 803-814 (2004).
- Lima, R., Wada, S., Tsubota, K., Yamaguchi, T. Confocal micro-PIV measurements of three-dimensional profiles of cell suspension flow in a square microchannel. Meas. Sci. Tech. 17 (4), 797-808 (2006).
- Wereley, S. T., Santiago, J. G., Chiu, R., Meinhart, C. D., Adrian, R. J.
- Meinhart, C. D., Wereley, S. T., Gray, M. Volume illumination for two-dimensional particle image velocimetry. Measurement Science and Technology. 11, 809-814 (2000).
- Chayer, B., Pitts, K. L., Cloutier, G. Velocity measurement accuracy in optical microhemodynamics: experiment and simulation. Physiological Measurement. , In Press (2012).
- Tabeling, P. Introduction to Microfluidics. , Oxford University Press. Oxford, UK. (2005).
- Olson, M. G., Adrian, R. J. Out-of-focus effects on particle image visibility and correlation in microscopic particle image velocimetry. Experiments in Fluids. 29, S166-S174 (2000).
- Wereley, S. T., Meinhart, C. D. Recent advances in micro-particle image velocimetry techniques. Ann. Rev. Fluid Mech. 42, 557-576 (2010).
- Williams, S. J., Park, C., Wereley, S. T. Advances and applications on microfluidic velocimetry. Microfluid. Nanofluid. 8 (6), 709-726 (2010).
- Chiu, J. J., Chen, S. Effects of disturbed flow on vascular endothelium: Pathophysiological basis and clinical perspectives. Physiol. Rev. 91 (1), 327-387 (2011).
- Secomb, T. W., Pries, A. R. The microcirculation: Physiology at the mesoscale. J. Physiol. 589 (5), 1047-1052 (2011).
- Popel, A. S., Johnson, P. C.
- Xia, Y. N., Whitesides, G. M.
- Whitesides, G. M., Stroock, A. D.
- Sia, S. K., Whitesides, G. M. Microfluidic devices fabricated of poly(dimethylsiloxane) for biological studies. Electrophoresis. 24, 3563-3576 (2003).
- Zhou, J., Ellis, A. V., Voelcker, N. H. Recent developments in PDMS surface modifications for microfluidic devices. Electrophoresis. 31, 2-16 (2009).
- Pitts, K. L., Abu-Mallouh, S., Fenech, M. F. Contact angle study of blood dilutions on common microchip materials. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. , (2012).
- Hovav, T., Yedgar, S., Manny, N., Barshtein, G. Alteration of red blood cell aggregability and shape during blood storage. Transfusion. 39, 277-281 (1999).
- Pitts, K. L., Mehri, R., Mavriplis, C., Fenech, M. F. Micro-particle image velocimetry measurement of blood flow: validation and analysis of data pre-processing and processing methods. Measurement Science and Technology. 23, 105302 (2012).
- Kloosterman, A., Poelma, C., Westerweel, J. Flow rate estimation in large depth-of-field micro-PIV. Exp. Fluids. 50 (6), 1587-1599 (2011).
- Goldsmith, H. L., Skalak, R.
