이 프로토콜에서는 원핵 생물의 단일 세포 분석을 위한 미세유체 피콜리터 생물반응기(PLBR)의 제작, 설정 및 기본 작동이 소개됩니다. 산업적으로 관련된 미생물을 원리 증명으로 분석하여 기존 방법으로는 거의 불가능했던 특정 기간 동안의 성장 속도, 형태 및 표현형 이질성에 대한 통찰력을 얻을
수 있었습니다.이 논문에서
요약
초록
이 프로토콜에서는 최근에 도입된 미세유체 피코리터 생물반응기(PLBR)의 제조, 실험 설정 및 기본 작동에 대해 자세히 설명합니다. PLBR은 단일 박테리아 및 미세군집체를 분석하여 세포 성장, 형태, 스트레스 반응, 단일 세포 수준에서의 대사 산물 또는 단백질 생산과 관련된 생명공학 및 미생물 관련 질문을 조사하는 데 사용할 수 있습니다. 이 장치는 섭동 연구를 위한 일정한 환경 조건을 가능하게 하는 연속 매체 흐름을 특징으로 할 뿐만 아니라 원하는 환경 상황을 모방하기 위해 빠른 매체 변화와 진동 조건을 허용합니다. 일회용 장치를 제조하기 위해 마이크로미터 미만의 SU-8 구조를 포함하는 실리콘 웨이퍼가 신속한 폴리디메틸실록산 주조를 위한 복제 금형 역할을 했습니다. 칩을 절단, 조립, 연결 및 시공간 세포 분석을 위한 강력한 도구인 타임 랩스 이미징에 적합한 고해상도 완전 자동화 현미경에 설정했습니다. 여기에서 생명공학 플랫폼 유기체인 Corynebacterium glutamicum을 PLBR에 파종하고 세포 성장 및 세포 내 형광을 몇 시간에 걸쳐 추적하여 유세포 분석과 같은 기존 분석 방법으로는 불가능한 단일 세포 수준에서 시간 의존적 집단 이질성을 밝혔습니다. 장치 제조에 대한 통찰력 외에도 박테리아의 사전 배양, 로딩, 포획 및 단일 세포 및 콜로니의 PLBR 배양 준비가 입증됩니다. 이 장치는 엄격한 환경 제어 하에서 단일 박테리아의 시간 의존적 현상을 분석하기 위해 미생물 연구에 새로운 차원을 더할 것입니다. 간단하고 상대적으로 짧은 제조 공정으로 인해 이 기술은 모든 미세유체 실험실에서 쉽게 적용할 수 있으며 특정 요구 사항에 맞게 간단히 조정할 수 있습니다.
서론
타임랩스 현미경은 생체 내살아있는 세포를 연구하기 위한 강력한 도구입니다 1. 한편, 열 유도 초점 드리프트 보정을 포함한 상업적으로 이용 가능한 완전 자동화 현미경 플랫폼은 암 및 뉴런 세포 연구, 조직 공학 및 단일 효모 또는 박테리아 세포를 사용한 동적 연구2-6에 이르기까지 시간 의존적 현상을 연구하기 위한 생물학 연구에 일반적으로 적용됩니다.
일반적으로 투명 웰 플레이트, 한천 패드 또는 단순히 현미경 슬라이드가 적용되어 타임 랩스 이미징 중에 세포 배양 환경을 제공합니다7. 특정 연구에 적합하더라도, 이러한 간단한 시스템은 환경 조건에 대한 제어가 매우 제한적이며 더 복잡한 섭동이나 잘 정의되고 빠른 매체 변화를 허용하지 않습니다. 대량 생산으로 생산되는 일회용 미세유체 칩 장치는 최근 시장에 출시되었지만 대부분 더 큰 진핵 세포 유형에 맞게 조정됩니다4. 성장을 추적할 수 있지만 정확한 세포 포획, 군집 크기, 성장 방향 및 세포 제거 능력과 같은 잘 정의된 성장 조사는 제한적입니다. 박테리아 세포가 3D 환경에서 배양되는 미세유체 서식지 및 반응기는8-10개가 개발되었으며, 단일 세포 수준에서 정량적 연구를 처리할 때 단점이 있습니다. 전체 집단 이질성을 분석할 수 있지만, 성장이 단층으로 제한되지 않기 때문에 많은 세포 매개변수를 단일 세포 해상도로 정확하게 결정할 수 없습니다.
이 제한은 단일 세포 해상도와 매체 공급 및 환경 조건에 대한 특히 엄격한 제어 및6,11,12를 가진 평평한 단층에서 성장하는 세포와 함께 잘 정의 된 채널 및 서식지에서 세포의 배양을 가능하게하는 마이크로 시스템의 개발을 촉발했습니다.박테리아 세포의 배양을 위한 미세유체 시스템의 몇 가지 예는 입증되었습니다12-14. 박테리아는 일반적으로 매우 빠른 성장 속도를 보이며 특히 현미경 검사에 세포 단층이 필요한 경우 수 마이크로미터 이하의 미세 유체 구조를 필요로 합니다. Keymer 외. 미세 가공 경관에서 대장균 균주의 성장 및 확산을 입증15,16. 그들은 집단 역학에 관심이 있었기 때문에 단일 세포 해상도로 조사하지 않았습니다.
우리는 피콜리터 생물반응기(PLBR)13을 개발했으며, 이는 현재 단일 세포 수준18,19에서 성장17 및 형광 결합 생산성 분석과 같은 다양한 생명공학 성능 지표를 조사하는 데 적용되고 있습니다. 현재의 미세유체 장치는 약 1피코리터의 정의된 배양 부피에서 환경 반응기 제어와 연속적인 단일 세포 관찰을 동시에 가능하게 합니다. 한쪽 또는 두 면이 매체 공급 채널에 개방되어 있는 개방형 단층 박스 시스템11,14와 비교하여 PLBR은 제어된 포획 및 배양을 허용합니다. 이 설계는 여러 개의 인접한 군체가 하나의 큰 개체군을 형성할 위험 없이 박테리아를 장기간 배양할 수 있도록 합니다. 또한 이 시스템은 1μm 높이(세포 직경 순서)의 배양 영역을 통합하여 박테리아 성장을 세포 단층으로 제한합니다. 대조적으로, 공급 채널은 유압 저항을 최소화하기 위해 10배 더 깊습니다.
소형화된 배치 배양 시스템(20)과 비교하여, 현재의 시스템은 연속적인 매체 흐름으로 인해 일정한 환경 파라미터로 배양을 허용한다. 또한 매체 구성, 온도, 유속 및 가스 교환과 같은 환경 매개 변수를 쉽게 제어하고 몇 초 내에 변경할 수 있습니다. 이를 통해 예를 들어 영양소 가용성 또는 스트레스 자극과 관련된 환경 변화에 대한 세포 반응에 대한 특정 조사를 수행할 수 있습니다. 감소된 배지 부피, 즉 수 마이크로리터 범위에 대한 수요로 인해 연구자들은 이러한 특정 환경 조건에서 세포 반응을 밝히는 대규모 실험의 상등액을 사용한 타임 랩스 이미징 중 세포의 섭동과 같은 새로운 연구를 수행할 수 있습니다17. 피코리터 바이오리액터는 생물물리학적 조건을 엄격하게 제어하는 강력한 시스템을 연구자에게 제공하며, 타임랩스 이미징을 위해 고정밀 주사기 펌프와 자동화된 명시야 및 형광 현미경을 사용하여 작동됩니다. 여기에서는 장치 설계, 제조 및 모범적인 응용 프로그램을 포함한 완전한 프로토콜을 보고합니다.
프로토콜
1. 웨이퍼 제작
- CAD 소프트웨어를 사용하여 입구, 출구, 주 채널 및 PLBR(그림 1A)을 포함하는 미세유체 장치를 설계합니다.
- 이 프로토콜(그림 2)에 제시된 설계는 2개의 시딩 주입구, 2개의 서로 다른 기질을 혼합하기 위한 그래디언트 생성기, 1개의 배출구 및 6개의 PLBR 어레이로 구성됩니다. 각 어레이에는 5개의 PLBR이 포함되어 있어 하나의 미세유체 장치 내부에 30개의 병렬 PLBR이 생성됩니다.
- 원하는 칩 레이아웃을 포함하는 리소그래피 포토마스크를 만듭니다(그림 1B). 포토마스크는 서브미크론 해상도의 전자빔 쓰기로 사내에서 생산되었습니다. 사용된 마스크는 5 in2 유리판에 크롬 층으로 구성되었습니다.
참고 : 클린룸 클래스 100 조건 이상에서 다음 단계를 모두 수행합니다(프로세스 순서도는 그림 3A 및 3B에 표시됨). - 4인치 실리콘 웨이퍼를 피라냐(황산과 과산화수소의 10:1 비율)와 불산으로 몇 분 동안 청소합니다(주의: 유해 화학 물질). 약 10초 동안 탈이온수(DI)로 헹굽니다.
- 웨이퍼를 200°C에서 20분 동안 탈수합니다.
- 웨이퍼 (1층) (4 ml 레지스트, v = 500 rpm 및 a = 100 rpm / sec로 10 초 스핀, v = 1,000 rpm 및 a = 300 rpm / sec)에 1 μm SU-8 2000.5 포토 레지스트를 스핀 코팅합니다.
- 코팅된 웨이퍼를 95°C의 핫플레이트에 올려 과도한 용매를 제거합니다(65°C에서 1.5분, 95°C에서 1.5분, 65°C에서 1분, 이상적으로는 두 개의 핫플레이트를 사용).
- 마스크 정렬기 내부에 1층 포토마스크(여기서는 피코리터 반응기의 트래핑 영역)와 웨이퍼를 삽입하고 웨이퍼를 350-400nm(진공 접촉, 64mJ/cm², t = 3초, I = 7mW/cm²)에 노출시킵니다.
- SU-8의 중합을 시작하기 위해 95°C의 핫플레이트에서 노출 후 베이크를 수행합니다(65°C에서 1분, 95°C에서 1분, 65°C에서 1분). 참고: 이 단계 후에 SU-8 레이어의 구조를 볼 수 있습니다.
- 웨이퍼를 SU-8 현상액에 1분 동안 놓고 새로운 SU-8 현상액이 있는 두 번째 용기에 웨이퍼를 몇 초 동안 옮깁니다.
- 웨이퍼를 이소프로판올로 헹구어 SU-8 현상액을 제거하고 웨이퍼 스피너의 질소 흐름을 사용하여 웨이퍼를 건조시킵니다.
- 웨이퍼를 150°C에서 10분 동안 하드 베이킹합니다.
- 웨이퍼(2층)에 9μm SU-8 2010 포토레지스트를 스핀 코팅합니다(4ml 레지스트 분배, v = 500rpm, a = 100rpm/sec로 10초 스핀, v = 4,000rpm, a = 300rpm/sec로 30초 스핀).
- SU-8이 포함된 웨이퍼를 95°C의 핫플레이트에 올려 과도한 용매를 제거합니다(65°C에서 15분, 95°C에서 45-60분, 65°C에서 10분). 참고: 주름과 거품에 주의를 기울여야 합니다. 웨이퍼를 95°C까지 가열하면 증발된 용매가 작은 기포에 캡슐화될 수 있습니다.
- 원하는 레이아웃의 포토마스크(여기서는 영양분 공급을 위한 주요 채널)와 웨이퍼를 마스크 얼라이너에 삽입하고 350-400nm(하드 접촉, 64mJ/cm², t = 10초, I = 7mW/cm²)에 노출시킵니다.
- SU-8의 중합을 완료하기 위해 95°C의 핫플레이트에서 노출 후 베이크를 수행합니다(65°C에서 5분, 95°C에서 3분 30초, 65°C에서 3분). 참고: 이 단계 후에 SU-8 레이어의 구조를 볼 수 있습니다.
- 웨이퍼를 SU-8 현상액에 45초 동안 넣고, 새로운 SU-8 현상액이 있는 두 번째 용기에 웨이퍼를 옮기고 60초 동안 현상합니다.
- 웨이퍼를 이소프로판올로 20초 동안 헹구어 SU-8 현상액 잔여물을 제거하고 가압 질소를 사용하여 웨이퍼를 건조시킵니다.
- 마지막으로 웨이퍼를 150°C에서 하드 베이킹합니다. 그 결과 PDMS 성형을 위한 마스터 몰드로 사용될 최종 웨이퍼(그림 1C)가 얻어집니다.
- 형상계 측정(그림 3C)을 수행하여 SU-8 구조 높이를 검증합니다. 참고: 구조 높이가 부정확하면 배양 중에 비효율적인 세포 포획 또는 세포 손실이 발생할 수 있습니다.
2. 폴리디메틸실록산 칩 제작
참고: 다음 모든 단계는 제조 절차를 방해하는 먼지 입자를 방지하기 위해 층류 조건에서 이상적으로 수행해야 합니다(프로세스 순서도는 그림 4에 나와 있음).
- 폴리디메틸실록산(PDMS) 염기와 경화제의 혼합물을 10:1 비율로 준비합니다. 불투명하게 보이는 균일한 용액이 나올 때까지 조심스럽게 혼합합니다. 원하는 층 높이(여기서는 3mm)에 필요한 만큼 준비합니다.
- 모든 기포가 사라질 때까지 약간의 진공 상태에서 약 30분 동안 PDMS 혼합물의 가스를 제거합니다.
- 적절한 SU-8 웨이퍼가 있는 성형 장치(또는 페트리 접시)를 준비하고 PDMS 혼합물을 붓습니다(그림 1D).
- PDMS를 오븐에서 3°C에서 80시간 동안 굽습니다.
- 웨이퍼에서 PDMS 슬래브를 조심스럽게 떼어냅니다. 깨끗하고 날카로운 메스를 사용하여 슬래브를 단일 칩으로 자릅니다.
- n-pentane bath에서 칩을 90분 동안 씻은 다음 아세톤 세척 수조(각각 90분)를 두 번 씻습니다. 칩을 밤새 건조시켜 용매 잔여물을 제거하십시오. 주의: 흄 후드 아래에서 PDMS 세척을 수행합니다. 참고: n-pentane 세척 중에 경화된 PDMS에서 단량체와 이량체가 제거되고 세척 절차 중에 칩 크기가 일시적으로 두 배가 될 수 있습니다.
- 최종 실험이 끝날 때까지 미세유체 PDMS 칩을 밀폐된 용기에 보관하십시오.
- 실험 직전에 튜브를 PDMS 칩과 연결하는 데 사용되는 커넥터보다 약간 작은 직경의 바늘(또는 구멍 펀처)을 사용하여 PDMS 칩에 입구 및 출구 구멍을 펀칭합니다.
- 미세유체 PDMS 칩을 이소프로판올로 조심스럽게 청소하고 스카치 테이프를 사용하여 구조화된 PDMS 면에 붙을 수 있는 먼지 입자를 제거합니다. 칩에 입자가 보이지 않을 때까지 스카치 테이프를 여러 번 사용하십시오.
- 170μm 두께의 유리 슬라이드에 아세톤과 이소프로판올을 연속적으로 세척합니다. 마지막으로 탈이온수로 세척하고 가압 질소로 건조시킵니다.
- 플라즈마가 활성화되기 전에 플라즈마 클리너를 예열하고 약 300초 동안 플라즈마를 실행합니다. 플라즈마 산화 유리 슬라이드 및 PDMS 칩(전력 50W, 시간 = 25초, 산소 유량 = 20sccm).
- 접착하기 전에 PDMS와 유리 칩을 정렬합니다. 마지막으로, PDMS 칩을 유리 슬라이드에 조심스럽게 놓습니다(그림 1E). PDMS와 유리는 몇 초 안에 접착됩니다. 참고: 본딩 과정에서 PDMS 칩 상단을 핀셋으로 밀어 넣지 마십시오. 이것은 채널과 작은 구조물의 소위 지붕 붕괴로 이어질 수 있습니다.
- 결합을 강화하기 위해 최종 PDMS 유리 칩을 80°C에서 10초 동안 굽습니다.
3. 박테리아 배양 준비
참고: 모든 재배는 재배 중에 방해가 될 수 있는 원치 않는 입자의 축적을 방지하기 위해 멸균 여과 매체에서 준비해야 합니다.
- 원하는 유기체(여기서는 C. glutamicum ATCC 13032)를 함유한 한천 플레이트를 사용하고 하나의 콜로니를 20ml의 신선한 BHI 배지에 접종하고 회전식 쉐이커(120rpm)에서 30°C에서 하룻밤(≈8-14시간) 배양합니다.
- 미세유체 배양 중에 사용될 10μl의 사전 배양을 원하는 배지(여기서는 CGXII21)로 옮기고 회전식 쉐이커(120rpm)에서 30°C에서 하룻밤 동안 세포를 성장시킵니다.
- 원하는 양의 세포 현탁액(실험 시작에 따라 10-500μl 사이)을 미세유체 세포 배양 중에 사용될 원하는 배지(여기서는 CGXII21)로 옮깁니다. 참고: 가장 좋은 방법은 파종을 위해 초기 로그 단계의 세포를 사용하는 것입니다. C. glutamicum 배양의 경우 파종을 위한 최상의 광학 밀도(OD600)는 0.5-2였습니다.
- 박테리아 배양액 1ml를 멸균 2ml 튜브에 옮깁니다. 참고: 이 작업은 진탕 플라스크와 미세유체 배양 사이의 전송 시간을 최소화하기 위해 미세유체 PDMS 칩을 조립한 직후에 수행해야 합니다. 일반적으로 이송 시간은 약 15분이며 산소 제한 및 온도 변화로 인한 신진대사에 미치는 영향을 방지하기 위해 가능한 한 작게 유지해야 합니다.
4. 실험적 설정
참고: 모든 단계는 도립 현미경으로 수행됩니다.
- 실험 2시간 전에 현미경 인큐베이터를 시작하여 시스템을 예열합니다. 참고: 현미경 검사에는 온도와 원하는 경우 가스 흐름을 제어할 수 있는 풀 사이즈 인큐베이터가 장착되어 있어야 합니다. 칩 시스템에 지속적으로 미디어가 주입되기 때문에 추가 습도 제어가 필요하지 않습니다.
- 인큐베이터 시스템을 열고 원하는 대물렌즈를 선택하고 필요한 경우 대물렌즈에 이멀젼 오일을 추가합니다.
- 칩 홀더 내부에 칩을 장착합니다. 필요한 경우 무대 작동 중 칩이 움직이지 않도록 유리판을 접착 테이프로 고정하십시오.
- 샘플을 현미경의 중앙에 놓고 PLBR 어레이에 초점을 맞춥니다.
- 적절한 튜브로 입구와 출구를 연결합니다(그림 1F). 튜브를 폐기물 저장통에 연결합니다. 대표적인 칩이 도 4D에서 볼 수 있다.
- 펌프에 주사기를 삽입하고 매체 흐름을 시작합니다. 매체, 완충액 또는 필요한 경우 코팅 용액을 사용하고 약 1시간 동안 미세유체 채널을 헹굽니다. 참고: 코팅 용액은 불특정 세포 접착을 방지하기 위해 채널 벽을 코팅하는 데 사용됩니다.
- E. coli의 경우 0.1% BSA 용액을 사용하여 채널 벽을 코팅합니다. C. 글루타미쿰의 경우 코팅이 필요하지 않습니다. 코팅 절차 후 배지 이전 세포 파종으로 칩을 세척합니다.
- 세포 파종 및 배양 전에 누출이 발생하지 않고 온도가 일정한지 확인하십시오.
5. 세균 세포를 미세유체 장치에 파종하기
- 튜브에 연결된 적절한 주사기에서 원하는 박테리아 용액을 사용할 수 있는지 확인하십시오.
- 버퍼 또는 코팅 용액을 분리하고 셀 현탁액을 칩에 연결합니다. 죽음의 양, 원치 않는 기포를 최소화하고 실험 시간을 줄이려면 주사기만 교체하는 것이 아니라 전체 바늘과 튜브를 교체하십시오.
- 대부분의 PLBR이 원하는 양의 세포로 채워질 때까지 200nl/min의 체적 유속으로 세포 현탁액을 채널에 주입합니다(그림 5A). 참고: 최적의 파종 결과는 박테리아 균주, OD600 및 배양 전의 성장 배지에 따라 다릅니다. 이러한 매개변수는 충분한 수의 셀이 반응기 구조에 포획될 때까지 포획 효율성과 시간을 증가시키기 위해 조정되어야 합니다. C. glutamicum의 경우, 전형적으로 OD600 0.5-2의 세포 현탁액이 사용되었습니다. 대장균의 경우 OD600은 0.5-1 사이였습니다.
- 적은 수의 PLBR만 채워진 경우 유속을 800-1,200nl/min으로 높입니다.
- 세포 현탁액을 분리하고 성장 배지를 칩에 연결합니다(그림 5B). 매체 변경 중에 기포가 유입되지 않는지 확인하십시오. 100nl/min의 속도로 신선한 성장 배지로 관류합니다.
6. 타임랩스 이미징
- 타임랩스 이미징을 위한 특정 PLBR을 선택합니다. 일반적으로 실험 시작 시 단일 모세포를 포함하는 PLBR이 선택됩니다. 한 번의 실험에서 조사할 수 있는 관심 영역의 수는 원하는 프레임 속도와 미시적 설정에 따라 다릅니다.
- PLBR 수에 따라 적절한 프레임 속도를 선택하십시오. 현미경이 타임 랩스 간격 동안 원하는 양의 ROI를 처리할 수 있는지 확인하십시오.
- 적절한 필터 세트(여기서는 YFP)를 선택합니다. 무대 이동 중과 각 타임랩스 측정 후 자동으로 셔터를 닫아 발색단 표백을 방지합니다.
- 타임랩스 현미경 시퀀스를 구성하고 실험을 시작합니다.
- 모든 PLBR이 과도하게 자란 후에는 실험을 중지하고 미세유체 PDMS 칩을 폐기하고 실험을 평가할 수 있습니다.
7. 분석
참고: 절차의 다음 단계 또는 부분은 수동으로 또는 ImageJ 등과 같은 이미지 분석 프로그램을 통해 수행할 수 있습니다.
- 배양이 원하는 모든 기준(예: 모세포의 수, 모세포의 위치 등)을 충족하는 관심 PLBR을 결정합니다.
- 하나의 미세군집의 성장률을 결정하려면 각 시간대의 세포 수를 세십시오.
- 시간 대 ln(셀 번호)을 플로팅하여 최대 성장률을 계산합니다. 플롯의 기울기는 [1/hr]의 성장률을 나타냅니다(그림 6 참조).
- 형광 데이터 분석은 수행된 실험에 따라 크게 달라집니다. 이 보고서에서는 서로 다른 동종 소군집 간의 콜로니 간 및 세포 간 이질성을 설명하기 위해 예를 선택했습니다(그림 7 참조).
결과
장치 제작
미세유체 PLBR 시스템은 고해상도 현미경 관찰에 적합한 얇은 유리 칩 위에 본딩된 하나의 PDMS 층으로 제작됩니다. 제작 과정은 두 가지 주요 단계로 구성됩니다. 첫 번째는 복제 마스터의 제작(그림 1A, 1B 및 1C)이며, 두 번째는 칩 제작(그림 1D, 1E 및 1F)입니다. 프로토콜에 따라, 표준 광리소그래피 미세가공 기술을 사용하여 마스터 몰드를 생성합니다. 클린룸 시설이 없는 연구실의 경우, 시판되는 맞춤형 SU-8 마스터 몰드를 구입할 수 있습니다. 반복적인 PDMS 몰딩(그림 1A, 1B 및 1C)을 통해 수백 개의 일회용 칩을 생산할 수 있습니다. PDMS 몰딩 및 칩 조립은 모든 연구실에서 가능하며 클린룸 시설이 필요하지 않으나, 층류 작업대(laminar airflow workplace)를 사용하는 것이 권장됩니다.
이 과정은 미세유체 칩 시스템의 설계부터 시작됩니다. 일반적으로 미세유체 칩 설계에는 CAD 소프트웨어가 사용됩니다(그림 1A). CAD 설계 후, 서브마이크론 해상도를 가진 e-빔 라이터로 마스크를 제작합니다(그림 1B). 본 연구에서는 SU-8 웨이퍼 리소그래피에 사용될 5 $\mu$m 크롬 마스크를 제작하였습니다. 최종적으로 제작된 실리콘-SU-8 웨이퍼는 PDMS 몰딩에 사용됩니다(그림 1D). 베이킹 단계를 거친 후 PDMS 슬래브를 칩 형태로 절단하여 유리 슬라이드 위에 가역적으로 접합합니다(그림 1E). 마지막으로 튜빙을 연결합니다(그림 1F).
그림 2는 미세유체 시스템의 설계를 상세히 보여줍니다. 이 시스템은 두 개의 시딩 입구, 서로 다른 기질 또는 배지를 혼합하기 위한 구배 생성기, 그리고 하나의 출구로 구성됩니다. 주 채널의 크기는 50 µm x 10 µm (W x H)입니다. 각 장치는 각각 5개의 PLBR을 포함하는 6개의 PLBR 어레이로 구성됩니다. 그 결과, 하나의 미세유체 장치 내에 30개의 병렬 반응기가 구축됩니다.
그림 3은 복제 마스터 제작 과정을 보여줍니다. 프로토콜에 상세히 설명된 바와 같이, SU-8 리소그래피를 통해 첫 번째 SU-8 층을 제작합니다(그림 3A). 두 번째 층에도 유사한 절차가 적용됩니다(그림 3B). 채널 기하학적 구조를 확인하기 위해 프로필로미터를 사용하여 PLBR 및 메인 채널의 높이를 조사했습니다. 그림 3C에 표시된 예시에서는 첫 번째 층(배양층)을 측정했습니다. 여기서 해당 층은 1,200 nm의 일정한 높이를 나타내며, 이는 BHI 배지 내 C. glutamicum 배양에 적합합니다.
그림 4는 PDMS 혼합(그림 4A)부터 시작하여 성형 과정(그림 4B), 그리고 마지막 결합 단계(그림 4C)까지의 PDMS 몰딩 절차를 보여줍니다. 그림 4D는 170 µm 두께의 유리판, 입구와 출구가 있는 PDMS 칩(높이 3 mm), 그리고 튜빙에 연결된 스틸 니들이 통합된 최종 미세유체 칩을 보여줍니다. 실험 후에는 칩을 폐기할 수 있으며 광범위한 세척이 필요하지 않습니다. 또한 조립과 취급이 용이합니다. 복잡하고 까다로운 충진 절차는 필요하지 않습니다.
장치 원리
그림 5는 반응기 시스템의 작동 원리를 보여줍니다. 세포를 미세유체 장치에 주입하면, 개별 세포들이 세포벽 상호작용에 의해 단순히 PLBR 내에 포획된 상태로 유지됩니다. 채널과 PLBR의 유체역학적 저항 차이로 인해 PLBR 내부에서는 최소한의 흐름만 발생합니다. PLBR에 세포를 파종한 후(그림 5A), 박테리아 용액을 배양 배지로 교체하여 성장 및 관찰 단계가 시작됩니다(그림 5B). PLBR이 과성장한 후(그림 5C) 일반적으로 실험을 중단하며, 타임랩스 이미지를 분석할 수 있습니다. PLBR 내의 포획 메커니즘과 흐름 프로파일에 대한 자세한 내용은 Grünberger et al.13 의 문헌을 참조하시기 바랍니다.
성장률 분석
본 시스템은 성장, 형태 또는 형광 신호와 같은 다양한 생물학적 파라미터와 관련하여 다양한 박테리아 종을 연구하는 데 적용될 수 있습니다. 첫 번째 예로, 산업적으로 유용한 생산 생물인 C. glutamicum을 표준 배양 조건(T=30 °C, CGXII 배지21)에서 배양하였습니다. 그림 6A는 세 개의 이종 미세군집(microcolonies)으로부터 얻은 성장 곡선을 보여줍니다. PLBR가 가득 찰 때까지 지수 성장 단계가 유지되는 것은 영양분 제한이 발생하지 않았음을 나타냅니다. 그림 6B는 성장 중인 C. glutamicum 군집의 네 가지 DIC 타임랩스 현미경 이미지를 보여줍니다.
형광 분석
단일 세포 형광 현미경 관찰을 위해 연구자들은 종종 GFP 또는 그 유도체와 같은 특정 형광 단백질을 사용하여 관심 있는 특정 표현형을 측정 가능한 출력값(형광 신호)과 연결합니다. 형광 기반 타임랩스 연구에 대한 PBLR의 적용 가능성을 입증하기 위해, 우리는 Ptac 프로모터의 제어 하에 플라스미드 인코딩 YFP-TetR 융합 단백질을 생성하는 C. glutamicum 균주(pEKEx2-yfp-tetR)18,22의 형광 방출을 조사하였습니다. 낮은 농도의 유도제(IPTG) 존재 하에서 Ptac로부터의 발현은 동종 박테리아 집단 내에서 상당한 세포 간 변이를 일으키는 것으로 알려져 있습니다. 하나의 사전 배양물로부터 시작하여, 여러 동종 마이크로콜로니의 성장과 단일 세포 형광을 추적하였습니다. 그림 7에서 볼 수 있듯이, 서로 다른 마이크로콜로니 간의 표현형 이질성과 하나의 모세포로부터 시작된 콜로니 내 단일 세포 수준에서의 이질성을 관찰하였습니다. 한 콜로니(그림 7B, PLBR 1)는 형광 방출이 거의 나타나지 않은 반면, PLBR 2의 세포들은 Ptac 프로모터의 기저 yfp-tetR 발현으로 인해 낮은 형광 방출을 보였습니다. PLBR 3의 경우 다른 콜로니들에 비해 형광 방출이 상당히 강했으며, 집단의 넓은 분포가 관찰되었습니다. 이 사례는 타임랩스 형광 현미경 연구에 대한 PBLR의 적용 가능성을 보여줍니다. 단일 세포의 형광을 한 시점에서만 결정할 수 있는 유세포 분석법과 비교하여, 본 시스템은 여러 세대에 걸쳐 실시간으로 세포를 추적하고 단일 세포 형광을 연구할 수 있게 해줍니다.
그림 1. PLBR 칩 제작 공정 개요. 마스터 몰드 제작: (A) 설계, (B) 리소그래피 마스크 제작, (C) 웨이퍼 생산 단계로 진행됨. PDMS-유리 칩 제작: (D) PDMS 몰딩을 시작으로 (E) 유리와 PDMS 본딩, (F) 최종 칩 조립 순으로 진행됨.
그림 2. PLBR 칩의 설계. (A) 전체 마이크로플루이딕 칩의 CAD 도면; (B) 선택된 레이아웃 위치의 확대도: 레이아웃에는 두 개의 배지 유입구(a1), 혼합 채널이 포함된 구배 생성기(a2) 및 6개의 병렬 PLBR 어레이(b1)가 포함되어 있습니다. b2는 너비 100 µm의 유체 채널에 내장된 하나의 PLBR을 보여줍니다. PLBR은 내경 40 µm이며, 너비 2 µm의 영양분 채널을 가지고 있습니다. 세포 파종 유입구의 길이는 40 µm입니다. 분홍색은 첫 번째 층(포획 및 배양 영역)을 나타내고 파란색은 두 번째 층(유체 수송)을 나타냅니다.)
그림 3. 2층 웨이퍼 제작 공정 도식. (A) 트랩 구조를 포함하는 첫 번째 층의 제작; (B) 유체 채널, 입구 및 출구를 포함하는 두 번째 층의 제작; (C) 첫 번째 층의 대표적인 표면 프로파일. 이 경우 첫 번째 층의 높이는 1,200 nm이며, 복합 배지에서 C. glutamicum의 배양에 사용되었다.
그림 4. 장치 제작 및 대표 칩. PDMS 몰딩 과정의 도식: (A) PDMS 혼합 및 탈기; (B) PDMS 몰딩; (C) 몰드 분리, 절단 및 칩 본딩. 최종 칩 (Royal Society of Chemistry의 허가를 받아 재수록13): (D) 2개의 입구와 1개의 출구가 있는 PDMS 칩 사진; (E) 각각 5개의 PLBR을 포함하는 6개의 병렬 어레이 CAD 이미지; (F) 하나의 PLBR에 대한 SEM 이미지.
그림 5. PLBR 시스템의 작동 원리. (A) 시딩 단계; (B) 박테리아 미세 콜로니의 성장 단계; (C) 오버플로우 단계. Royal Society of Chemistry의 허가를 받아 재수록됨13. http://dx.doi.org/10.1039/C2LC40156H.
그림 6. C. glutamicum 야생형(WT) 마이크로콜로니의 성장률 결정. (A) 세 가지 PLBR 배양의 성장 도식과 그 결과로 도출된 지수 곡선 (Royal Society of Chemistry의 허가를 받아 재수록함)13. http://dx.doi.org/10.1039/C2LC40156H. (B) 성장하는 C. glutamicum 콜로니의 타임랩스 이미지.
그림 7. PBLR 기반의 개체군 이질성 분석. 유도제 IPTG가 없는 상태에서 Ptac 프로모터의 제어 하에 yfp-tetR 융합 단백질을 발현하는 C. glutamicum (pEKEx2-yfp-tetR)을 보여준다. (A) 실험 워크플로우; (B) 콜로니 간 이질성 및 세포 간 이질성을 보여주는 세 개의 동종 미세콜로니; (C) 각 미세콜로니 내 단일 세포 형광의 분포.
그림 8. 서로 다른 PLBR의 주사 전자 현미경 이미지. 포집 효율 최적화를 위한 시딩 입구를 보여주는 SEM 이미지. (A) 더 큰 시딩 입구 (B) 더 작은 시딩 입구 (C) 더 큰 "개방형" 시딩 입구 (D) 두 개의 시딩 입구.
| 단계 | 문제 | 가능한 원인 | 해결 방법 |
| 웨이퍼 제작 | 소프트 베이크 중 SU-8 내에 기포가 갇힘 | 온도 상승 속도가 너무 빠름 | 95 °C 및 65 °C에서 여러 번 베이크 |
| 웨이퍼 제작 | SU-8 구조의 소실 및 파손 | 최적화되지 않은 제작 절차, SU-8 구조 내 기계적 응력 | 베이킹 시간, 노광 시간 등의 파라미터 최적화 |
| 웨이퍼 제작 | SU-8 층이 너무 낮거나 높음 또는 층 두께가 불균일함 | 스핀 코팅 중 문제 발생 | 스핀 코터 파라미터 및 웨이퍼 척 확인 |
| 칩 본딩 및 조립 | PLBR 붕괴 | PDMS 본딩 파라미터가 최적화되지 않음 | 전력, 플라즈마 노출 시간 및 본딩 후 베이킹 시간 조정 |
| 칩 본딩 및 조립 | PLBR 내에 오염물 및 입자 존재 | 칩이 제대로 세척되지 않음 | 표면 세척을 위해 스카치테이프 사용 |
| 칩 본딩 및 조립 | PDMS-유리 본딩 불충분 | 본딩 파라미터가 최적화되지 않았거나 세척이 불충분함 | 산소 플라즈마 설정 확인 |
| 미세유체 실험 | 유체 누출 | 입구/출구 구멍이 제대로 뚫리지 않음 | 구멍 펀칭 공정 최적화 |
| 미세유체 실험 | 충전 중 많은 수의 작은 PDMS 입자 발생 | 구멍이 제대로 뚫리지 않음 | 구멍 펀칭 공정 최적화 |
| 미세유체 실험, 생물학적 측면 | 세포 성장 없음 | 세척 절차로 인한 용매 잔류물 | 세포 로딩 전 칩을 더 광범위하게 플러싱하거나 본딩 전 용매를 증발시킴 |
| 미세유체 실험, 생물학적 측면 | 성장률 변화 | 다양한 원인 | 사전 배양 및 온도 확인 |
| 미세유체 실험, 생물학적 측면 | 배양 중 세포 형태 변화 | 영양소 제한 또는 온도 변화 | 인큐베이터 및 유량 확인 |
| 미세유체 실험, 기술적 측면 | 타임랩스 현미경 관찰 중 위치 드리프트 | 온도 변동 | 진동이 없을 때까지 실험 전 온도 프로파일 확인 |
| 미세유체 실험, 기술적 측면 | 배양 중 세포 손실 | 반응기 높이가 약간 너무 높음 | 반응기 높이 최적화 |
| 미세유체 실험, 기술적 측면 | 트래핑 안 됨 | 반응기 높이가 너무 낮음 | 반응기 높이 최적화 |
표 1. 문제 해결. 이 표는 실험 과정 중의 주요 고려 사항, 흔한 실수 및 가능한 해결 방법을 요약하여 보여줍니다.
토론
우리는 박테리아의 단일 세포 분석을 위해 여러 개(PLBR)를 포함하는 미세유체 PDMS 장치의 제작, 실험 설정 및 관련 작동 절차를 설명했습니다.
소프트 리소그래피 기술을 사용한 미세 가공을 통해 다양한 크기와 박테리아 형태에 맞게 장치 치수를 빠르게 조정할 수 있습니다. 현재 우리는 다양한 미생물 유기체의 배양 및 배양 처리량과 관련하여 피코리터 바이오리액터를 최적화하고 있습니다. 트래핑 효율을 높이기 위해 반응기 형상도 최적화되고 있습니다. 그림 8 은 현재 검증된 4개의 새로운 PLBR 디바이스를 보여줍니다. 모든 그림에서 파종 채널은 너비와 모양과 관련하여 재설계되었습니다. 실제로 이것은 갇힌 세포의 수에 영향을 미치는 것으로 보이지만 추가 조사가 필요합니다. 추가 오버플로 채널을 통합하여 반응기를 통과하는 대류 흐름이 높아지고 더 많은 세포가 트래핑됨으로써 트래핑 효율과 관련하여 상당한 개선이 달성되었습니다. 그러나 동시에 배양 중에 세포를 씻어낼 위험이 증가합니다.
이 장치는 단일 세포 수준에서 성장 및 생산 과정을 조사하기 위해 수십 년 동안 사용되어 온 거시 규모 재배에 대한 흥미로운 대안입니다. 그러나 몇 가지 중요한 요구 사항이 있습니다. 여러 피코리터 바이오리액터의 병렬 모니터링을 위해서는 초점 드리프트 보정이 있는 고해상도 및 완전 전동식 현미경 설정이 필수입니다. 또한 측정 전반에 걸쳐 원하는 배양 온도를 일정하게 유지하려면 배양 시스템이 필요합니다.
우리는 장치 제작에서 95%의 성공률을 달성합니다. 주요 문제는 비효율적인 PDMS-유리 접착, PDMS 지붕 붕괴 또는 유체 누출과 관련이 있습니다(대부분의 문제 해결은 표 1 참조). 실험 작업은 부분적으로 비멸균 조건에서 수행되지만 폐쇄된 유체 시스템으로 인해 실험 중에 오염을 거의 볼 수 없습니다. PDMS 미세유체 장치는 광학적으로 투명하므로 고해상도 생체 내 이미징에 사용할 수 있습니다. PDMS는 응용 분야에 완벽한 것처럼 보이지만 소수성 분자에 대한 친화력이 높아 전체 세포 생체 촉매 공정에 널리 사용되는 용매의 사용이 제한됩니다. 그러나 프로토콜을 이러한 종류의 응용 분야에 적용하기 위해 적절한 코팅을 사용할 수 있습니다.
제안된 PLBR은 다양한 종류의 박테리아의 세포 및 세포 내 사건의 시공간 분석에 매우 적합합니다. 현재 접근 방식의 주요 장점은 기존 방법과 달리 마이크로콜로니 성장을 직접 정량화할 수 있는 능력에 있습니다. 또한 PLBR은 정의되고 일정한 조건에서 배양할 수 있습니다. 이 시스템은 소량의 시약이나 재료를 쉽게 사용할 수 있기 때문에 저렴하고 맞춤화가 가능하며 높은 처리량에 적합하다는 장점이 있습니다. 전통적인 방법에서는 미생물 배양을 분석할 때 전체 인구의 평균값을 고려합니다. 또한 기존 방법에는 수동 샘플링이 필요하므로 샘플의 품질이 저하되어 측정 오류가 발생할 수 있습니다. PLBR은 미생물학에서 바이오프로세스 개발 및 집단 이질성 분석에 대한 새로운 관점을 제공합니다. PLBR은 바이오프로세스 개발 내의 다양한 응용 분야에 유망한 도구이며 세포 간 이질성 분석, 세포 계통 내 특정 세포 클러스터 분석, 미생물 생산 균주 스크리닝 및 세포 표현형의 실시간 조사 와 같은 다양한 연구 분야에 적용될 수 있습니다.
공개 사항
저자는 공개할 것이 없습니다.
감사의 글
저자는 기술자 Agnes Müller-Schröer의 귀중한 공헌에 감사드립니다. 이 작업은 Forschungszentrum Jülich GmbH의 Helmholtz Nanoelectronic Facility(HNF)에서 부분적으로 수행되었습니다. 저자는 관대한 도움과 지원에 감사드립니다.
재료
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| 포토레지스트 SU-8 2000.5 | Micro Resist Technology GmbH, 독일 | ||
| 포토레지스트 SU-8 2010 | Micro Resist Technology GmbH, 독일 | ||
| SU-8 개발자 mr DEV- 600 | Micro Resist Technology GmbH, 독일 | ||
| 폴리디메틸실록산(PDMS) Sylgard 184 실리콘 엘라스토머 키트 | 다우 코닝; Farnell GmbH, 독일 | ||
| 디스펜싱 바늘 정밀 팁 27g; ID = 0.2mm, OD = 0.42mm | Nordson EFD Deutschland, 독일 | ||
| 유리판 D263 T eco, 30mm x 25mm x 0.17mm | Schott AG, 독일 | ||
| 홀 펀처 AKA 5130-B-90 | Harris Uni-Core | ||
| Tubing Tygon S-54-HL, ID = 0.25mm, OD = 0.76mm | Saint Gobain; VWR International GmbH, 독일 | ||
| 일회용 주사기 – Omnifix Spritzen BRAUN Omnifix 40 Duo, 1 ml | B. Braun Melsungen AG, Germany | 552-183143 | |
| 주사기, 1 ml 멸균 유리 주사기 | INNOVATIVE LABOR SYSTEME GMBH (ILS), Germany | ||
| Chemicals | |||
| (NH4)2SO4 | Carl Roth GmbH + Co. KG, Germany | ||
| Urea | Carl Roth GmbH + Co. KG, 독일 | ||
| KH2PO4 | Carl Roth GmbH + Co. KG, 독일 | ||
| K2HPO4 | Carl Roth GmbH + Co. KG, 독일 | ||
| MgSO4• 7H2O | Carl Roth GmbH + Co. KG, 독일 | ||
| MOPS | Carl Roth GmbH + Co. KG, 독일 | ||
| FeSO4• 7H2O | Carl Roth GmbH + Co. KG, 독일 | ||
| MnSO4• H2O | Carl Roth GmbH + Co. KG, 독일 | ||
| ZnSO4• 7H2O | Carl Roth GmbH + Co. KG, 독일 | ||
| CuSO4 | Carl Roth GmbH + Co. KG, 독일 | ||
| NiCl2• 6H2O | Carl Roth GmbH + Co. KG, 독일 | ||
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| Biotin | Carl Roth GmbH + Co. KG, 독일 | ||
| Procatechuic acid | Carl Roth GmbH + Co. KG, 독일 | ||
| Glucose-Monohydrate | Carl Roth GmbH + Co. KG, 독일 | ||
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| 대장균 MG 1655 | DSMZ; 라이프니츠 연구소 DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Germany | ||
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| 웨이퍼 클리너 SSEC 3300 | 솔리드 스테이트 장비 LLC | ||
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| 마스크 얼라이너 MA-6 | Karl Suess | ||
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| 마그네틱 교반기 CB 162 | 스튜어트 | VWR 442-0304 | |
| 현미경 니콘 이클립스 Ti | 니콘 현미경 | ||
| 현미경 인큐베이터 | Pecon GmbH, 독일 | ||
| 원심분리기 minispin plus " 블랙 라인" | Eppendorf | 9776501 | |
| Photometer BioPhotometer plus | Eppendorf | 6132000008 | |
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