Summary
Tilgange til at teste effekten af antipsykotiske lægemidler (APDS) i Caenorhabditis elegans er påvist. Analyser er beskrevet til at teste effekter stof på udvikling og levedygtighed og på svælg pumpe sats. Disse metoder er også for farmakogenetiske eksperimenter med andre end APD narkotika klasser.
Abstract
Caenorhabditis elegans er en simpel genetisk organisme modtagelig for storstilet frem og bak genetiske skærme og kemiske genetiske skærme. C. elegans genom omfatter potentiel antipsykotisk lægemiddel (APD) mål konserveret i mennesker, herunder gener, der koder for proteiner, der kræves for neurotransmittersyntese og synaptiske struktur og funktion. APD eksponering producerer forsinket udvikling og / eller dødelighed i nematoder i en koncentrationsafhængig måde. Disse fænotyper er forårsaget delvist af APD-induceret hæmning af svælg pumpe 1,2. Således udviklingsmæssige fænotype har en neuromuskulær basis, hvilket gør den anvendelig for farmakogenetiske undersøgelser af neuroleptika. Her demonstrerer vi detaljerede procedurer for afprøvning APD virkninger på nematode udvikling og svælg pumpning. For den udviklingsmæssige assay, er synkroniseret embryoner placeret på nematode medium vækst (NGM) plader indeholdende APD, og stadier af udvikling af animals derefter modtog dagligt. For svælg pumpe rate assay, iscenesat unge voksne dyr er testet på NGM plader indeholdende APD. Antallet af svælg pumper per tidsenhed registreres, og den pumpende beregnes. Disse assays kan anvendes til at studere mange andre typer af små molekyler eller store molekyler.
Introduction
Caenorhabditis elegans er en simpel genetisk organisme modtagelig til store frem og bak genetiske skærme og kemiske genetiske skærme. C. elegans er følsom over for et bredt spektrum af bioaktive forbindelser og har derfor været anvendt med succes til at definere virkningsmekanismer af en række af sådanne forbindelser. For eksempel bioaktive stoffer undersøgt ved hjælp af ormen farmakogenetik omfatter acetylcholin receptor agonister (f.eks Levamisol, nikotin, morantel og pyrantel), anæstetika (f.eks halothan), koffein, kolinesterasehæmmere (f.eks aldicarb, lannate og trichlorfon), fluorid, GABA-relaterede forbindelser (f.eks GABA og muscimol), ivermectin, paraquat phorbolestere og serotonin-relaterede lægemidler (f.eks serotonin og imiprimine) 3.. Endvidere C. elegans er blevet brugt til store småmolekyle skærme, så opdagelsen af nye bioaktive forbindelses og identifikation af nye genetiske mål 4.
C. elegans genom omfatter potentiel antipsykotisk lægemiddel (APD) mål bevaret hos mennesker, herunder gener, der koder for proteiner, der er nødvendige for neurotransmittersyntese og synaptiske struktur og funktion 5. Således C. elegans Neurogenetics og neurobiologi tilbyder metoder til at opdage nye molekylære virkningsmekanismer for APD. I nematoder APD eksponering tidligt i udviklingen producerer forsinket udvikling, og ved højere koncentrationer, dødelighed 2,6. APD eksponering i voksenalderen producerer adfærdsmæssige fænotyper. For eksempel clozapin eksponering hæmmer bevægelse og svælg pumpning og forbedrer æglægning 1,2,7.
APD-induceret forsinket udvikling og dødelighed er stærke fænotyper til store kemiske genetiske skærme. Disse fænotyper er komplekse, for så vidt som de sandsynligvis har mere end én cellulære og genetiske BASIsek. Derfor er sådanne genetiske skærme forventes at give en række indirekte lægemiddelkandidater. Imidlertid har vores laboratorium gennemført kandidat gen-skærme og en genom-dækkende RNAi skærm til undertrykkere af APD-induceret udviklingsmæssige forsinkelser og dødelighed og har med succes genvundet gener, der sandsynligvis koder direkte mål, herunder dopamin, insulin, og nicotinacetylcholinreceptorer 2,8. Genetiske skærme baseret på APD-inducerede adfærd i den voksne har også ført til identifikation af nye APD mål, og vi er nu validere mål fra både udviklingsmæssige og adfærdsmæssige skærme i pattedyr 7. Således vises en hvirvelløse kemisk genetisk metode til at opdage nye molekylære virkningsmekanismer for APD at være mulig 5,8.
C. elegans svælg er et organ, der omfatter 20 neuroner, 20 muskelceller, og 20 accessoriske celler, pakket med en basalmembran. Svarende til pattedyr hjerte, pharynx er autonom ennd konstant pumper mad i fra det ydre miljø 9. Hæmning af svælg pumpe sats kompromiser mad optagelse, og dermed mutationer eller lægemidler, der hæmmer svælg pumpe årsag forsinket udvikling eller arrestere 9. APD hæmme svælg pumpe sats, der tegner sig i en del for deres virkninger på udvikling og levedygtighed 1,2. Her bruger vi den atypiske APD clozapin som et eksempel for at demonstrere narkotika assays for nematode udvikling og svælg pumpning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Developmental Delay / Dødeliqhed Assay: vildtype (N2) og to mutant (Mut1 og Mut2) Stammer testes i tre Clozapin Koncentrationer i en 12-brønds plade
- På dag 1, hældes 2 ml NGM medium 10 ind i hver brønd i en plade med 12 brønde (hver brønd med en diameter på 2 cm), og tillade at hærde på bænken ved stuetemperatur (RT) natten over. Samme dag, vælge en koloni af Escherichia coli OP50 bakterier inficere en flaske 50 ml LB-løsning, og kultur er det i et 37 ° C ryster ved 220 rpm rotation natten over.
- På dag 2, overføres 20 ul OP50 bakteriekultur på midten af hver NGM godt. Pladerne inkuberes i en 37 ° C inkubator eller lade dem ved stuetemperatur natten over for at tillade den bakterielle plæne at vokse tykkere.
- Lav en 80 mM clozapin stamopløsning ved at opløse clozapin i DMSO (dimethylsulfoxid) opløsningsmiddel. Derefter foretage en 80 pi arbejder løsning med stamopløsningen fortyndet i 1,7 mM eddikesyre based på tabel 1.
Bemærk: Arbejdsgruppen løsning for et bestemt lægemiddel af interesse skal bestemmes ved at gøre en række indledende koncentration test for at finde den mest passende koncentration for at skelne vildtype fra mutanter. - Overfør 80 ul clozapin arbejder løsning på seedede NGM plade godt og slyng pladen at lade opløsningen at distribuere jævnt på overfladen. Vent til pladen til tørre. Brug pladen for analysen på samme dag eller placere den i en 20 ° C inkubator, der skal bruges næste dag.
Bemærk: arbejdsopløsning er et stof suspension på grund af den lave opløselighed af clozapin, især ved højere koncentration. Derfor vortex røret før overførsel løsningen til stoffet plade for at sikre, at koncentrationen af lægemidlet er korrekte. - Vask orme fra en 3,5 cm plade indeholdende mange Gravid voksne med M9 buffer og derefter dreje dem ned i et 15 ml rørved 2.000 rpm i 1 min.
- Aspirer supernatanten. Der tilsættes 5 ml blegemiddel opløsning (NaOH: hypochlorit: ddH2O ved 04:01:05) og forstyrre nematoderne ved forsigtigt at vende rørene.
- Observere dyrene indtil halvdelen af dem er opløst på omkring 5 min. Spin ned æggene ved 2.000 rpm i 1 min.
- Aspirer supernatanten, og der tilsættes 14 ml M9-puffer hurtigt.
- Spin ned æggene ved 2.000 rpm i 1 min og aspirere supernatanten, hvilket efterlader ca 100 ul løsning. Vortex at suspendere æggene.
- Overfør 2 æg ul suspenderet i M9 på en regelmæssig NGM plade til at teste, hvor mange æg overføres. Juster lydstyrken af de suspenderede æg for at sikre, at der er cirka 30-35 æg i hver overførsel. Overfør 30-35 æg til hver brønd i assay-pladen, og inkubér derefter i en 20 ° C inkubator i 24 timer.
- På den første dag af analysen, score det antal æg klækkede. Juster det samlede antal af udklækkede dyr 25/well ved picking off ekstra orme, hvis nødvendigt.
- På de følgende dage, observere dyrene og score dem hver 24 timer. Udviklingsstadiet er scoret baseret på størrelsen af dyret og formen af vulva 11. Forsøget varer 5-6 dage med de mest robuste virkning ses typisk på den tredje eller fjerde dag.
- Indtast dataene i en Excel-fil og beregne procentdelen af dyr på hver udviklingsstadiet for hver dag i forsøget. Generer grafer med funktionen '100% stablet søjlediagram 'i '2-D kolonnen' menu.
2. Faryngeal Pumping Assay: unge voksne dyr til vildtype-og mutantstammer er scoret på Clozapin assayplader
- Assaypladen er lavet efter samme protokol, der bruges til forsinket udvikling / dødelighed assay.
- Pick 50 L4 dyr for hver stamme til udsåede NGM plader 24 timer før assayet og inkuber orme ved 20 ° C.
- Pick 10 dyr til en ASSAy plade godt. Vælg derefter 10 dyr til den næste godt hver 15-20 min.
- Efter dyrene i den første brønd har været udsat for stoffet i 30 min, starter analysen ved at observere svælg pumpning under en dissektion mikroskop og score pumperne for 20 sek 9. Når svælg pumpning er scoret, plukke ormen fra pladen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
1.. Developmental forsinkelse / dødelighed assayresultat
Et typisk resultat for forsinket udvikling / dødelighed assay er demonstreret i figur 1a og 1b. Når vildtype-dyr i kontrolgruppen er vokset til gravide voksne stadium (figur 1a), vildtype-dyr udsat for clozapin er stadig i de unge larvestadier eller er døde (figur 1b). Figur 1c viser et repræsentativt resultat sammenligning en suppressor mutant (Mut1) og en forstærker mutant (Mut2) med vildtypen ved tre forskellige clozapin koncentrationer. På alle tre clozapin koncentrationer dødeligheden af Mut1 er lavere end vild type og dødelighed af Mut2 er højere. Overlevende Mut1 dyr videre til mere avancerede larvestadier end vildtype, mens overlevende Mut2 dyr vise forsinket udvikling sammenlignet med vildtype. </ P>
2. Faryngeal pumpehastighed analyseresultatet
Figur 2 viser et repræsentativt svælg pumpning analyseresultat sammenligner en suppressor mutant (Mut1) og en forstærker mutant (Mut2) med vildtypen ved to clozapin koncentrationer. Clozapin eksponering reducerer svælg pumpning satser af vildtype og mutant stammer i en koncentrationsafhængig måde. Den faldt svælg pumpehastigheden af Mut1 er imidlertid mindre end den for vildtype, mens den faldt svælg pumpehastigheden af Mut2 er større end den af vildtypen.
Figur 1. Demonstration af clozapin-induceret forsinket udvikling og dødelighed. Wild-type dyr (N2) dyrket på en kontrol NGM plade (a), og på en NGM plade suppleret med 200 ug / ml (612 pM) clozapin (b). (C) Et repræsentativt resultat af forsinket udvikling / dødelighed assay viser clozapin effekt på vildtype (N2), en suppressor mutant (Mut1) og en enhancer mutant (Mut2). Billederne i (a) og (b) er genoptrykt < http://www.nature.com/npp/journal/v34/n8/full/npp200935a.html > fra Neuropsychopharmacology. 34 (8), 1968-1978 (juli , 2009). Klik her for at se større billede .
ig1.jpg "width =" 600px "/>
Figur 2. Demonstration af clozapin-induceret hæmning af svælg pumpning. Et typisk resultat for svælg pumpning assay viser clozapin effekt på vildtype (N2), en suppressor mutant (Mut1) og en enhancer mutant (Mut2). Dataene blev analyseret med to-vejs ANOVA ved hjælp af den statistiske software program R. Klik her for at se større billede .
Tabel 1. Fremstilling af arbejdsopløsningen af clozapin. Beløbet er til 4 brønde ved hver koncentration.
| Clozapin koncentration | 0 uM | 300 uM | 400 uM | 500 uM |
|---|---|---|---|---|
| HAC løsning | 270 pi | 270 pi | 270 pi | 270 pi |
| Clozapin stamopløsning | - | 30 pi | 40 ul | 50 pi |
| DMSO | 50 pi | 20 pi | 10 pi | 0 pi |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her beskriver vi metoder til at teste effekten af APD om udvikling og adfærd C. elegans. DMSO eller ethanol anvendes til at opløse clozapin, da stoffet er relativt uopløseligt i vand. Fordi opløsningsmidler er blevet rapporteret at påvirke C. elegans biologi 12, DMSO-alene eller ethanol-alone kontrolgrupper er afgørende. Den højeste koncentration af DMSO anvendt i vores assays er op til 3%, hvilket ikke har nogen indlysende virkning på C. elegans udvikling. DMSO kan anvendes til mange små molekyler, eller endda nogle store molekyler, fx lipid syrer.
APD koncentrationer anvendt i disse assays er højere end dem, der gives til mennesker. Dette er fælles for de fleste små molekyle studier i C. elegans, da der ikke kræves høje koncentrationer til indtrængning i C. elegans neglebånd. HPLC undersøgelser indikerer, at niveauerne af clozapin i C. elegans væv i den udviklingsmæssige assay er tæt på dem, der forventes i den menneskelige hjerne 2.
Penetration af neglebånd er en særlig bekymring for studier af store molekyler. Mutanter med defekter i neglebånd barriere, såsom ACS-20 mutanter og Bus (B acterially U n-S wollen) mutanter, tilbyder en metode til at omgå dette problem 13. Bus mutanter er blevet isoleret på grund af deres modstand mod infektion med patogenet Microbacterium nematophilum. For eksempel svage alleler af bus-8 viser, at dette gen spiller en rolle i produktionen af kutikulaen overflade. Disse mutanter er resistente over for infektion, fordi bakterien ikke kan binde til værten overflade. Vigtigere er det, afbrydelse af neglebånd dannelse forårsager også øget narkotika følsomhed i denne genetiske baggrund 14.
Den udviklingsmæssige assay beskrevet her kan skaleres op for genetiske skærme storstilede ved at udføre analysen i flydende culture. For genome-wide RNA-interferens (RNAi) skærme for eksempel protokollen svarer til den, der er beskrevet ovenfor, men fodring RNAi bakterier substitueres for OP50 bakterier 15. Dyrkningsvæsken analysen kræver en lavere medikamentkoncentration end pladeassayet (upubliceret observation). Vores laboratorium gennemført sådan en genom-dækkende RNAi skærm til undertrykkere af clozapin-induceret forsinket udvikling og opnåede 40 undertrykkere fra en skærm på ~ 17.000 C. elegans gener 8..
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at der ikke er interesse konflikt involveret.
Acknowledgments
Arbejdet blev støttet af en NIH Clinical pris Scientist Development K08NS002083, en Shervert Frazier Research Institute Grant, og en NARSAD Young Investigator Award til Edgar A. Büttner.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Clozapine | Sigma | C6305 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D8418 | |
| Acetic acid (HAC) | Fisher | BP2401 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | EMD | SX0590-13 | |
| Hypochlorite | Sigma-Aldrich | 425044 | |
| Centrifuge 5810 | Eppendorf | 5810 000.017 | |
| Incubator shaker | New Brunswick Scientific | M1246-0006 | |
| Low temperature incubator 815 | Precision Scientific | J1790-1B | |
| Stereomicroscope | Olympus | SZX12 | |
| Petri dish 35 x 10 mm | Fisher Scientific | NC9434271 | |
| 12-well Tissue culture plate | BD Falcon | REF 353043 |
References
- Donohoe, D. R., Jarvis, R. A., Weeks, K., Aamodt, E. J., Dwyer, D. S. Behavioral adaptation in C. elegans produced by antipsychotic drugs requires serotonin and is associated with calcium signaling and calcineurin inhibition. Neurosci. Res. 64, 280-289 (2009).
- Karmacharya, R., et al. Clozapine interaction with phosphatidyl inositol 3-kinase (PI3K)/insulin-signaling pathway in Caenorhabditis elegans. Neuropsychopharmacology. 34, 1968-1978 (2009).
- Rand, J. B., Johnson, C. D. Carnorhabditis elegans Modern Biological Analysis of an Organism. Estein, H. F., Shakes, D. C. 48, Academic Press, Inc.. 187-204 (1995).
- Kwok, T. C., et al. A small-molecule screen in C. elegans yields a new calcium channel antagonist. Nature. 441, 91-95 (2006).
- Wang, X., Sliwoski, G. R., Buttner, E. A. The relevance of Caenorhabditis elegans genetics for understanding human psychiatric disease. Harv. Rev. Psychiatry. 19, 210-218 (2011).
- Donohoe, D. R., Aamodt, E. J., Osborn, E., Dwyer, D. S. Antipsychotic drugs disrupt normal development in Caenorhabditis elegans via additional mechanisms besides dopamine and serotonin receptors. Pharmacol. Res. 54, 361-372 (2006).
- Karmacharya, R., et al. Behavioral effects of clozapine: involvement of trace amine pathways in C. elegans and M. musculus. Brain Res. 1393, 91-99 (2011).
- Saur, T., et al. A Genome-Wide RNAi Screen in Caenorhabditis elegans Identifies the Nicotinic Acetylcholine Receptor Subunit ACR-7 as an Antipsychotic Drug Target. PLoS Genet. 9, (2013).
- Avery, L., You, Y. J. C. elegans feeding. WormBook, ed. The C. elegans Research Community, doi:10.1895/wormbook.1.150.1. , Available from: http://www.wormbook.org (2012).
- Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. An introduction to worm lab: from culturing worms to mutagenesis. J Vis Exp. 47, (2011).
- Lewis, J. A., Fleming, J. T. Carnorhabditis elegans Modern Biological Analysis of an Organism. Estein, H. F., Shakes, D. C. 48, Academic Press, Inc.. 3-29 (1995).
- Davis, J. R., Li, Y., Rankin, C. H. Effects of developmental exposure to ethanol on Caenorhabditis elegans. Alcohol Clin. Exp. Res. 32, 853-867 (2008).
- Kage-Nakadai, E., et al. Two very long chain fatty acid acyl-CoA synthetase genes, acs-20 and acs-22, have roles in the cuticle surface barrier in Caenorhabditis elegans. PLoS One. 5, (2010).
- Partridge, F. A., Tearle, A. W., Gravato-Nobre, M. J., Schafer, W. R., Hodgkin, J. The C. elegans glycosyltransferase BUS-8 has two distinct and essential roles in epidermal morphogenesis. Dev. Biol. 317, 549-559 (2008).
- Leung, C. K., Deonarine, A., Strange, K., Choe, K. P. High-throughput screening and biosensing with fluorescent C. elegans strains. J. Vis. Exp. (51), (2011).
