Cokultur System med en organotypisk Brain Slice og 3D Sfæroide af carcinomaceller

Summary

Den organotypiske hjernesnit cokultur med carcinomaceller muliggør visualisering morfologiske ændringer ved fluorescens samt lysfelt (video) mikroskopi under processen carcinomacellelinie invasion af hjernevæv. Dette modelsystem også mulighed for celle udvekslings-og genopfyldning metoder og byder på en bred vifte af manipulationer og analyser.

Abstract

Patienter med cerebral metastase af carcinomer har en dårlig prognose. Imidlertid har processen på den metastatiske stedet knapt blevet undersøgt, især rolle beboeren (stroma) celler. Studier i primære carcinomer påvise indflydelsen af mikromiljøet på metastaser, selv på prognosen ^1,2. Især tumorassocierede makrofager (TAM) støtte migration, invasion og spredning ^3.. Interessant, store målsteder af metastase besidder vævsspecifikke makrofager, såsom Kupffer-celler i leveren eller mikroglia i centralnervesystemet. Desuden metastatiske steder også besidder andre vævsspecifikke celler, ligesom astrocytter. For nylig blev astrocytter påvist at fremme spredning og persistens af kræftceller ^4,5. Derfor funktioner af disse vævsspecifikke celletyper synes at være meget vigtig i processen af hjernemetastaser ^6,7.

På trods af disse observationer,Men indtil nu er der in vivo / in vitro-model tilgængelig ingen egnet til direkte at visualisere gliaceller reaktioner under cerebral metastase dannelse, især ved lysfeltmikroskopi. Seneste in vivo billeddannelse af carcinomaceller vist deres cerebral kolonisering adfærd ^8.. Men denne metode er meget arbejdskrævende, kostbare og teknisk kompleks. Desuden er disse former for dyreforsøg begrænses til små serier og komme med en betydelig belastning for dyrene (ved implantation af glaspladen, injektion af tumorceller, gentagne anæstesi og langsigtet fiksering). Desuden er in vivo-billeddannelse hidtil begrænset til visualisering af carcinomaceller, mens interaktion med residente celler er endnu ikke blevet illustreret. Endelig er umulige ⁸ undersøgelser af humane carcinom celler i immunkompetente dyr.

Af disse grunde har vi etableret et cokultur-system consibrodden af ​​en organotypisk mus hjerne skive og epitelceller indlejret i matrigel (3D celle sfære). 3D carcinomcellelinjer sfærer blev placeret direkte ved siden af ​​hjernesnit kant med henblik på at undersøge, invasion af tilstødende hjernevæv. Det giver os mulighed for at visualisere morfologiske ændringer og samspillet mellem de gliaceller og carcinom celler ved fluorescens og endda af lysfeltmikroskopi. Efter cokultur eksperimentet kan hjernevævet eller 3D celle sfæroiderne blive indsamlet og anvendt til yderligere molekylære analyser (f.eks qRT-PCR, IHC eller immunoblot) samt til efterforskning med konfokal mikroskopi. Denne metode kan anvendes til at overvåge hændelser i en levende hjernevæv for dage uden skadelige virkninger på hjernen skiver. Modellen giver også selektiv undertrykkelse og udskiftning af residente celler af celler fra en donor væv til at bestemme særskilte konsekvenser af en given genotype. Endelig cokultur modellen er et praktisk alternativtil in vivo nærmer ved test målrettede farmakologiske manipulationer.

Protocol

Denne nye model er en tilpasning af en tidligere offentliggjort organotypiske hippocampus hjerne skive tilgang ^9-12. Ændringer og tilføjelser blev indført for at optimere kræftcellen-hjernevæv interaktioner og sikre reproducerbarhed. Undersøgelsen blev gennemgået og godkendt af den lokale etiske komité. Dyrene blev behandlet omhyggeligt i overensstemmelse med de retningslinjer for pasning af dyr på University Medicine Göttingen. Den organotypisk hjerne skive cokultur kan opdeles i to trin. Trin et er forberedelsen af ​​den organotypiske hjerne skive. Trin to omfatter forberedelse tumor celle og aflejring i cokultur modellen.

1.. Organotypisk Brain Slice

1. Forbered dissektion medium bestående af minimalt essentielt medium (MEM) suppleret med 0,2 mM glutamin, 100 U / ml penicillin, 100 mg / ml streptomycin og 4,5 mg / ml glucose.
2. Halshugge musene fra enhver musestamme mellem postnatal dagseks og otte (P6-8).
3. Fjern hjernen hurtigt fra kraniet under aseptiske betingelser og overføre det til iskoldt dissektionsmedium.
4. Fjern frontal pol og cerebellum fra hele hjernen sektion.
5. Fix og stabilisere hjernen på en scene med cryo lim og 5% agarose.
6. Skær hjernesnit vandret til en 350 um tykkelse ved hjælp af et vibratom.
7. Saml 05:56 hele hjernen skiver fra en enkelt mus hjernen afhængigt af art og alder.
8. Forbered dyrkningsmedium bestående af 50% MEM, 25% Hanks balancerede saltopløsning (HBSS), 25% normalt hesteserum (NHS), 0,2 mM glutamin, 100 U / ml penicillin, 100 mg / ml streptomycin (Sigma, Munich Tyskland), og 4,5 mg / ml glucose.
9. Sæt hver organotypisk hjerne skive på en 0,4 mM polycarbonat transwell membran indstik i en seks-brønds plade med 1 ml dyrkning medium i den nederste godt.
10. Kultur organotypisk hjerneskiver natten over i en luftfugtd atmosfære med 5% _CO2 ved 37 ° C inkubator.

2. Slice cokultur Model

1. Indkapsle 10 ⁵ af GFP-transficerede tumor eller andre celler (f.eks MCF-7-GFP-celler) i 20 pi gelmatrix, bestående af 15% RPMI-medium og 85% ECM gel.
2. Placer MCF-7-gelmatrix blanding i en steril metallisk spacer (3,8 mm i diameter) støder direkte op til den kortikale region af organotypisk hjernesnit og inkuberes i 2 timer.
3. Fjern afstandsstykket og lade 3D-tumor klumpformet at cokultur med organotypiske skive for 24-96 timer.
4. Skift dyrkningsmediet hver anden dag.

3. Immunofluorescens Farvning af astrocytter og microgliale i organotypisk Brain Slice cokultur

1. Fastgør organotypisk hjerne skive cokultur med 4% paraformaldehyd i 8 timer ved 4 ° C.
2. Vask skive cokultur med PBST (PBS med 0,5% Triton X-100) i 5 min.
3. Bloker ssempler med normal gedeserum i PBST (1:20) ved stuetemperatur i 1 time.
4. Plette astrocytter ved at inkubere hjernesnit cokultur med anti-glial fibrillært surt protein monoklonalt antistof (GFAP, 1:200 i PBST) i 36 timer ved 4 ° C efterfulgt af gede-anti-muse-TRITC (1:100 i PBST) farvning i 1 time ved stuetemperatur.
5. Vask prøverne med PBST tre gange i 5 min.
6. Plette mikrogliaceller med ILB _4-Alexa Fluor 647 (1:100 i PBST) i 1 time ved stuetemperatur.
7. Kontrastfarve hjernen skive cokultur med DAPI (1:1000) i 3 minutter ved stuetemperatur.
8. Mount og dækglasset hjernen skive cokultur med DAKO fluorescerende montering medium.
9. Vurdere karakteren af ​​tumor invasion baseret på følgende pointsystem: 0 = ingen af ​​celler + <1/3 + + = 1/3 - 2/3 + + + ≥ 2/3 af de invaderede celler (første måle længden af ​​kontakt sektionen mellem tumor stik og skive, derefter måle fraktioneringsn kontakt detekteres af de invaderende celler).

4.. Live-Imaging af samspillet mellem Glial og tumorceller

1. Udfør eksperimentet under et Leica omvendt DMI 6000B mikroskop ved 10X forstørrelse linse og et Leica DFC 350 FX CCD kamera.

Representative Results

Først alle brugte carcinomceller (human: MCF-7-og murine: 410,4) invaderede organotypisk musehjerne skive. Invasionen var derfor arts-uafhængige (figur 1A), hvilket indikerer en bred vifte af applikationer i en art-uafhængig måde. Derudover mikroglia samt astrocytter akkumuleret ved grænsefladen som tidligere beskrevet i vivo og i patientprøver ^13. Time-lapse imaging over en længere periode ikke blot afslørede levedygtighed skive, men også tilbudt en god platform til at observere de cellulære interaktioner. Ved time-lapse eksperimenter blev mikrogliaceller registreret for at indtaste 3D celle sfære, mens til gengæld kræftceller også invaderet hjernen skive (fig. 1B1-B2). Desuden har vi tidligere vist evne mikroglia at transportere carcinomceller af en stadig gådefulde mekanisme for derved at hjælpe med carcinom invasion. Brug immunofluorescens mærkningsteknikker, vibeskrevne co-lokaliseringer af tumorceller og stromaceller (f.eks mikroglia og astrocytter), både i hjernevævet og i tumorcellen stik (figur 1C-D), hvilket tyder på en tæt vekselvirkning mellem disse celler under invasionen processen. Sammenlignelige resultater blev opnået, når muse hjernesnit blev dyrket sammen med enten human (figur 1C1-C3) eller murin (figur 1D1-D3) carcinomaceller - viser den brede vifte af applikationer til at studere celler fra forskellige arter, genotyper og stammer.

Figur 1. Hjernesnit cokultur model med en 3D sfæroid af muse og humane carcinomceller. A) Kvantificering af kræftcelle invasion i organotypiske hele hjernen skive cokulturer med brystkræft muscellelinje 410,4 eller en human brystcancercellelinie MCF-7. Data repræsenterer den procentdel af graden af ​​celleinvasion i hjernesnit i hver gruppe med n ≥ 38. Der var ingen signifikant forskel mellem disse to grupper (Kruskal-Wallis test). B) Time-lapse billeder af organotypiske hele hjernen skive cokulturer med MCF-7-GFP-celler og repræsentative billeder fra day2 (B1) og dag 5 (B2) var vist. CD) konfokal mikroskopi billeder viste kohorter af carcinomer, astrocytter og mikroglia. Dobbelt farvning af astrocytter (anti-GFAP-TRITC, rød) og mikroglia (ILB4-Alexa Fluor 647, violet) af hele cokultur med 350 um tyk organotypisk hjernesnit og GFP-transficerede tumorcelle stik (grøn): 3D- MCF-7-GFP (C1-C3) og 3D-410,4-GFP (D1-D3). Hvide streger viste kanten af ​​hjernen skive og tumor invasion front. Skalapanelerne repræsenterer 50 um. Mikroglia, astrocytter ennd tumorer colocalizations (C1 og D1), astrocytter-tumorer colocalizations (C2 og D2) og mikroglia-tumor colocalizations (C3 og D3) i skive cokultur. Klik her for at se større billede

Discussion

Tidligere histologiske undersøgelser af cerebral metastase demonstreret hurtige og drastiske ændringer af den residente gliaceller, især af astrocytter og microglia ^13. At studere disse ændringer og interaktioner med carcinomacellerne, denne roman cokultur system er velegnet. Andre forskningsområder allerede har mangeårig erfaring med organotypiske hippocampus hjernen skiver. En fordel er, at de organotypiske hippocampus hjerne skivekulturer er levedygtige og effektivt bevaret for dage til uger, hvilket gør den velegnet til langsigtede eksperimenter. Da Stoppini introduktion af organotypiske hippocampus skive-system i 1991, er det blevet vidt anvendt, for eksempel i forskning af degenerative sygdomme. Således er denne innovere cokultur systemet repræsenterer en modifikation af en veletableret tilgang med en række applikationer i tumor biologi ^9,11. Modifikationen tilbudt os en reproducerbar model til at vurdere karakteren af ​​tumor invasion ofeftermonterede og dyrket ved grænsefladen fremgangsmåde er ideelt egnet til forsøg, der kræver en tredimensionel struktur. Adskillige teknikker er blevet anvendt til cokultur organotypiske hippocampus skiver med andre celler. Disse omfatter en indirekte system mellem makrofagceller og organotypisk hjerne skive ¹⁴ og en direkte cokultur af to forskellige snit fra hippocampus region ^15. Glioma aggregater er også blevet samdyrket med hjerneskiver ^16. Disse modeller kan anvendes til at analysere cellulære og molekylære begivenheder i hjernen skiver men ikke tillader direkte fysiologisk kontakt mellem tumorceller, mikroglia og hjerneparenchymet. Desuden er denne metode gør det muligt observation af mikroglia uden forurening af knoglemarv afledt perifere monocytter / makrofager. Anvendelsen af ​​CCR2 og CX3CR1 transgene musemodel er en kritisk forbedring på grund af det faktum, at det er vanskeligt at skelne de bosiddende mikroglia fra invaderende monocytterbaseret på deres lignende egenskaber ^17,18,19. Selvom intracerebral injektion af carcinomaceller tillader behandlende tumorudvikling, kan det ikke fortælle meget, om de er omgivet makrofag-lignende celler stammer fra hjerne-resident mikroglia population eller fra knoglemarv-afledte perifere monocytter / makrofager ^17. Holdet af Kettenmann introduceret en organotypisk hjerne skive model, der er involveret pode gliomceller i hjernen skiver med en mikromanipulator ^20. Men primære maligne gliomer er forskellige i mange henseender fra metastatiske karcinomer. Først maligne gliomer er af mesenchymal oprindelse, ikke metastaserer uden for nervesystemet og vandrer / invadere som enkeltceller uden grænsen mellem tumor og hjernevæv. Derimod infiltrativ vækst er en typisk patologisk karakteristik, og sådanne karcinom normalt migrere / invadere som kohorter. Anden carcinomer ofte forsøge at genopbygge epitel strukturer i hjernen, mens gliacellerforsøge at adskille svulsten fra hjernevæv med en (pseudo) kapsel. Overvejer biologiske og morfologiske træk, malignt gliom og metastasering af kræftsvulster er ikke rigtig sammenlignes. Af disse grunde har vi modificeret og udviklet et cokultur system, hvor vi ikke injicere men cokultur en carcinomacellelinie stik ved siden af ​​hjernesnit. Desuden observerede vi microglial og astrocytisk ophobning ved grænsen af ​​tumor stik, hvilket betyder, at mikroglia indtaste tumor stik og kan let afsløres ved lysfeltmikroskopi og bekræftet bagefter ved konfokal mikroskopi. Kræftcellerne invadere ind i hjernen skive, som kan sammenlignes med den virkelige in vivo situation og en konstatering af, Baumert og kolleger, der fandt en infiltration zone i 63% af obduktion sager med hjernemetastaser ^21.

På grund af den manglende blodperfusion, der kun er bosiddende makrofager / mikroglia i denne kultur. Desuden, på grund af de mIssing T-celler, og derfor fraværende allo-reaktivitet, humane carcinomceller kan anvendes til cokultur selv med hjerneskiver i immunkompetente mus eller rotter (NMRI, B6 eller Wistar). Dette kunne tjene som et alternativ til den nøgen musemodel. Da der kan opnås 04:56 skiver fra hver mus er væsentligt reducerede antal dyr kræves i forhold til de eksisterende injektion modeller. Hertil kommer, at dyrene ikke lider for en lang periode med metastatisk sygdom, og de ​​ikke undergår operative procedurer repetitively ^22.

Med denne cokultur-systemet, har vi vist, at aktivering af mikroglia af kræftceller og kapacitet fremme cancercelleinvasion. Derudover er det første gang, at vores viden blev mikroglia fundet til aktivt at transportere carcinomceller ^23.

Trods alle disse fordele det cokultur systemet har faktisk også begrænsninger. Det er stadig et in vitromodel mangler trinene metastase før kolonisering. På grund af mangel på perfusion, er det ikke muligt at undersøge ekstravasation. Således er den alternative måde at studere ekstravasation er at bruge enten in vivo injektion model eller den modificerede Boydenkammer-system med ekstracellulær matrix, HUVEC og astrocytter at efterligne blod-hjerne-barrieren ^22,24. Hjernen skive cokultur metode er endnu en pålidelig og reproducerbar model med mange fordele og et potentiale for en bred vifte af applikationer, såsom analyse af kolonisering, især med fokus på den rolle, de bosiddende celler. Den kombination med andre etablerede teknikker (såsom immunhistokemi, konfokal mikroskopi og time-lapse mikroskopi) understøtter undersøgelse af direkte celle-til-celle interaktioner. Det er en nem alternativ og supplering af andre teknikker og giver adgang til den undersøgelse af stikord og effekter, som er pålagt af metastatisk mikromiljø.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Hank's balanced salt solution (HBSS)	Gibco, Darmstadt,Germany	24020
Minimum essential medium (MEM)	Gibco, Darmstadt , Germany	32360
RPMI-1640	PAA Laboratories Inc., Cölbe, Germany	E15-840
Dulbecco's phosphate buffered saline (PBS)	Pan Biotech, Aidenbach, Germany	P04-36500
Normal horse serum (NHS)	Invitrogen, Karlsruhe, Germany	16050-122
Fetal calf serum (FCS)	Invitrogen, Karlsruhe, Germany	10091148
Glucose	B. Braum, Melsungen, Germany
L-Glutamine-Penicillin-Streptomycin solution	Sigma, Steinheim, Germany	G1146
Vibratome	Leica, Wetzlar, Germany	Leica VT1200S
Microtome	Leica, Wetzlar, Germany	Leica SM 2000R
Polycarbonate membrane	BD Falcon, Heidelberg,Germany	353090	transwell membrane insert (0.4 μm pore size)
ECM gel	Trevigen, R&D, Wiesbaden-Nordenstadt, Germany	3432-005-01	Basement membrane extract
Metallic spacer	Kig GmbG, Kirkel, Germany	DIN 433
Confocal microscope	Zeiss, Göttingen, Germany	LSM 510
Time-lapse microscope and camera	Leica, Wetzlar, Germany	DMI 6000B microscope and a DFC 350 FX CCD camera
Anatomy microscope	Zeiss, Göttingen, Germany	Stemi SV11
Paraformaldehyde	Merck, Darmstadt, Germany	1.04005.1000
Mouse monoclonal anti-glial fibrillary acidic protein (GFAP) antibody	Sigma, Steinheim, Germany	G3893
Goat anti-mouse IgG, F(ab')2- TRITC	Santa Cruz, Heidelberg, Germany	SC3796
Isolectin GS-IB4 from Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor 647 conjugate	Invitrogen, Karlsruhe, Germany	132450
DAPI (4',6'-diamidino-2-phenylindole dihyfrochloride)	Sigma, Steinheim, Germany	D8417
Fluorescent mounting medium	DAKO, Glostrup, Denmark	S3023