Summary
وقد وضعنا رواية وتقنية استنساخه لعزل الثقافات الأولية من الشريان الرئوي خلايا العضلات الملساء (PASMC) من الفئران في سن P7، مما يتيح دراسة أفضل للمسارات الإشارات المشاركة في حديثي الولادة العضلات الملساء انكماش الخلايا والاسترخاء.
Abstract
ارتفاع ضغط الدم الرئوي هو سبب كبير من المراضة والوفيات عند الأطفال الرضع. تاريخيا، كانت هناك دراسة كبيرة من مسارات الإشارات المشاركة في الأوعية الدموية تقلص العضلات الملساء في PASMC من الأغنام الجنين. بينما الأغنام جعل نموذجا ممتازا من ارتفاع ضغط الدم الرئوي المدى، أنها مكلفة للغاية وتفتقر إلى الاستفادة من التلاعب الوراثي الموجود في الفئران. على العكس، كان عدم القدرة على عزل PASMC من الفئران وجود قيود كبيرة من هذا النظام. نحن هنا وصف عزلة الثقافات الأولية من الماوس PASMC من P7، P14، P21 والفئران باستخدام الاختلاف من هذه التقنية هو موضح سابقا من مارشال وآخرون. ال 26 التي كانت تستخدم سابقا لعزل PASMC الفئران. هذه PASMC الفئران تمثل أداة جديدة لدراسة مسارات إشارات في فترة الوليد. لفترة وجيزة، والطين من 0.5٪ (W / V) + الاغاروز هي التي غرست جزيئات الحديد 0.5٪ في M199 سائل الإعلام في السرير الوعائي الرئوي عبر البطين الأيمن (RV). الجزيئات الحديد هي 0.2 ميكرومتر في القطر وليس يمكن أن تمر عبر السرير الشعري الرئوي. وهكذا، فإن النزل الحديد في الشرايين الرئوية الصغيرة (PA). وتضخم الرئتين مع الاغاروز، إزالتها وفصلها. يتم سحبها في الأوعية المحتوية على الحديد إلى أسفل مع المغناطيس. بعد كولاجيناز (80 U / مل) العلاج ومزيد من التفكك، يتم وضع السفن في طبق زراعة الأنسجة في M199 سائل الإعلام التي تحتوي على 20٪ مصل بقري جنيني (FBS)، والمضادات الحيوية (M199 وسائل الإعلام كاملة) للسماح الهجرة الخلية على طبق ثقافة . هذه لوحة من الخلايا الأولية هي مزيج من الخلايا الليفية 50-50 وPASMC. وهكذا، فإن هدم الإجراء يتكرر عدة مرات لتحقيق السكان PASMC أكثر نقاء وإزالة أي الحديد المتبقية. يتم تأكيد هوية الخلايا العضلية الملساء التي كتبها المناعية لسلسة العضلات الميوسين وdesmin.
Introduction
ارتفاع ضغط الدم الرئوي أمر طبيعي خلال الحياة داخل الرحم منذ المشيمة بمثابة الجهاز الرئيسي لتبادل الغازات ويتم توزيعها فقط 10٪ من النتاج القلبي من خلال السرير الوعائي الرئوي. في الرحم والضغوط الرئوي تشبه الضغوط النظامية نظرا لارتفاع المقاومة الوعائية الرئوية . كما تقدم الحمل، وهناك نمو سريع للسلطة الفلسطينية الصغيرة داخل الرئة، وإعداد الجنين لزيادة كبيرة في تدفق الدم الرئوي الذي يحدث عند الولادة 1. عند فشل عملية الانتقال في الفترة المحيطة بالولادة الطبيعية لدى الرضع على المدى القريب والمدى الكامل، والنتيجة هي ارتفاع ضغط الدم الرئوي الثابتة من الأطفال حديثي الولادة (PPHN). PPHN هو متلازمة سريرية بسبب العديد من الأمراض الكامنة مختلفة. ومع ذلك، كل من هؤلاء الرضع بسمات الفسيولوجية المرضية الشائعة مثل ارتفاع المقاومة الوعائية الرئوية، نقص الأكسجة، وتحويلة من اليمين إلى اليسار من تدفق الدم عبر اتصالات الجنين المستمرة مثل القناة الشريانية أو للآمين البيضوية. PPHN يؤثر 2-6 لكل 1،000 ولادة حية وينقل مخاطر 8-10٪ من وفيات فضلا كبيرا على المدى القصير وعلى المدى الطويل 2 الاعتلال. بالإضافة إلى ذلك، قد منخفضة جدا الوزن عند الولادة الخدج تطوير ارتفاع ضغط الدم الرئوي نتيجة لمرضهم الرئة الكامنة. وأمراض الرئة الكامنة الأكثر شيوعا من الأطفال الخدج هو خلل التنسج القصبي الرئوي. في حين أن المخاطر الكلية للبرميل في اليوم يرتبط مع العمر الحملي ووزن الولادة، يبقى من غير الواضح لماذا مجموعة فرعية من هؤلاء الرضع تطور ارتفاع ضغط الدم الرئوي هامة وكيفية التعامل مع هؤلاء الأطفال بشكل مناسب. النتائج السيئة، بما في ذلك الإقامة في المستشفى لفترات طويلة وزيادة معدل الوفيات، شائعة 3-6.
تاريخيا، استخدمت الأغنام PASMC الجنين أو الخنازير PASMC الجنين من الحيوانات السليمة لدراسة مسارات الإشارات المشاركة في عملية الانتقال الأوعية الدموية الرئوية الطبيعية بعد الولادة. عادة يتم عزل هذه من الجيل الخامس المقاومة الفلسطينية منن الأغنام أو الخنازير الجنين التي يتم تسليمها والموت الرحيم قبل أي التنفس العفوي 7-9. بالإضافة إلى ذلك، بعض المحققين عزلت والاستفادة منها PASMC من كبار السن قليلا ويتنفس بشكل عفوي الحملان والخنازير في 3 أيام، 2 أسابيع، و4 أسابيع 10-12. وفي الآونة الأخيرة، بعض المجموعات عزلت بنجاح والاستفادة منها PASMC معزولة عن الحملان مع PPHN لدراسة خللا في مسارات إشارات في حالة المرض 13-17. وقد أثبتت هذه الخلايا لتكون أداة قيمة لدراسة مسارات الإشارات التي تشكل عاملا حاسما في كل من الأوعية الدموية الرئوية طبيعية والمريضة على المدى القريب والبعيد. ومع ذلك، فإنها لا تعطي نظرة ثاقبة في مسارات الإشارات أثرت في الأطفال الخدج المصابين بارتفاع ضغط الدم الرئوي. كما أنها لا تسمح إمكانيات التلاعب الجيني ينظر في نماذج الماوس من المرض.
منذ فترة طويلة تستخدم الجرذان والفئران نماذج لنموذج برميل يوميا ويجري استخدامها في الآونة الأخيرة إلى نموذج HY الرئويpertension الناتجة عن برميل يوميا 18-22. الفئران حديثي الولادة هي تحريضية للعمل مع نظرا لحجم أكبر، لكنها تعاني أيضا من عدم وجود إمكانية التعديل الوراثي. تم الحيوانات المعدلة وراثيا المستخدمة على نطاق واسع للتحقيق في الآثار المترتبة على أهداف جين معين على فسيولوجيا الحيوان كله في الفئران حديثي الولادة، ولكن حتى الآن لا أحد سبق له معزولة بنجاح PASMC من هذه الفئران الصغيرة. من خلال عزل PASMC، ويمكن الحصول على مزيد من المعلومات حول كيفية تغيير مسارات في الاستجابة للمؤثرات البيئية و / أو التعديل الوراثي وتحديدا في العضلات الشريان الرئوي على نحو سلس. بالإضافة إلى ذلك، يمكن تصوير الحية PASMC في الوقت الحقيقي لدراسة التغيرات السريعة في الجزيئات يشير المفتاح مثل الكالسيوم وأنواع الاكسجين التفاعلية 23-25. وصفنا في الآونة الأخيرة عزلة الناجح لPASMC من فئران بالغة باستخدام تباين أسلوب مارشال وآخرون. 26 تستخدم لعزل الفئران PASMC 23،25،26. نحن الآن تكيفت علىتمديد الثانية هذه التقنية على الفئران الصغيرة 7-21 أيام من العمر (P7، P14، P21 و). والقيد الرئيسي لهذه التقنية الجديدة العزلة PASMC هو أنه يتطلب الفئران متعددة لتوليد خلايا كافية لإجراء التجارب وأن الخلايا تنمو ببطء شديد، والذي هو سمة من خلايا العضلات الملساء الأولية. وعلى الرغم من هذه القيود، ونحن نعتقد أن هذا الأسلوب لعزل PASMC الماوس حديثي الولادة تسمح للتحقيق تعزيز مسارات الإشارات الرئيسيين المشاركين في تطوير ارتفاع ضغط الدم الرئوي، ويمثل تقدما كبيرا في هذا المجال.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
لجنة استخدام المؤسسات ورعاية الحيوان في جامعة نورث وسترن الموافقة على هذا البروتوكول.
1. عزل الشريان الرئوي من الفئران حديثي الولادة - يوم واحد
- إعداد M199 وسائل الإعلام كاملة - ميكس 400 مل M199 مع 100 مل (تركيز النهائي = 20٪) الحرارة المعطل FBS و 5 مل (تركيز النهائي = 1٪) البنسلين / الستربتوميسين.
- إعداد المصل الحرة M199 الإعلام - ميكس 500 مل M199 مع 5 مل (تركيز النهائي = 1٪) البنسلين / الستربتوميسين.
- إعداد الاغاروز PA - ميكس 0.05 غ الاغاروز زائد 0.05 جزيئات الحديد غ في 10 مل العقيمة، المصل خالية M199 سائل الإعلام.
- إعداد الرئة الاغاروز - ميكس 0.1 غ الاغاروز في 10 مل العقيمة، المصل خالية M199 سائل الإعلام.
- إعداد كولاجيناز - كولاجيناز خلط في العقيمة، المصل خالية M199 سائل الإعلام في تركيز النهائي من 80 U / مل ثم تصفية العقيمة هذا الخليط. إعداد كافة المعدات في وقت مبكر قبل القتل الرحيم الماوس.
- مجموعة PA الاغاروز والرئة الاغاروز لغلي الحق قبل القتل الرحيم الماوس.
- الموت ببطء الماوس في جرة مخدر مع جرعة زائدة isoflurane وتوخي الحذر وعدم السماح الماوس الجرو لتأتي في اتصال مع isoflurane و. يتم الحصول على أفضل عائد الخلية عندما يتم حصاد الخلايا مباشرة بعد الموت من أجل تجنب الجلطات الصغيرة التي تشكل في الدورة الدموية بعد الموت.
- إزالة الماوس من جرة مخدر، وتأمين الماوس إلى لوحة التشغيل، وتعقيم الماوس، والصكوك، وقفازات مع الكحول.
- تحميل مشرط مع شفرة وشق الماوس من الرقبة إلى البطن السفلي.
- فتح البطن على جانب الماوس الأيسر، فضح الكلى، وقطع الشريان الكلوي للسماح الماوس ليستنزف، وبالتالي تجنب الجلطات في الأوعية الصغيرة في الرئتين.
- استخدام مقص لقطع جنبا الى جنب مع الماوس الأيسر منالقص لفتح القفص الصدري.
- استخدام بعناية مشرط لقطع الحجاب الحاجز في كلا الجانبين وفتح بالكامل تجويف الصدر. استخدام ملقط أو دبابيس لعقد تجويف الصدر المفتوح.
- عصا RV مع 27 G ½ بوصة إبرة الموجهة نحو السلطة الفلسطينية ويروي RV / السلطة الفلسطينية / الرئتين مع برنامج تلفزيوني العقيمة حتى تظهر الرئتين الأبيض (كل الدم يخرجوا من الدورة الدموية الرئوية). وهذا سوف يستغرق حوالي 3-5 مل من برنامج تلفزيوني اعتمادا على حجم من الفأرة. من المهم أن الدفقة الأولى لمنع تشكيل جلطة في الأوعية الرئة صغير.
- استخدام بعناية تشريح حادة لفضح القصبة الهوائية وموضوع واحد تحت الدرز.
- وضع أصغر ملقط تحت القصبة الهوائية للحصول على الدعم ووضع angiocatheter G 24 إلى القصبة الهوائية. وضع angiocatheter كما لو وضع IV.
- تأمين angiocatheter في القصبة الهوائية مع خياطة الخيوط في الخطوة 1.16.
- خذ الغليان PA الاغاروز من الماء المغلي، وعكس لتخلط جيدا. تبريد agaroSE إلى ما يقرب من درجة حرارة الجسم عن طريق يحوم على الجليد. الاغاروز يجب أن يظل في حل ولكن لا تكون ساخنة بحيث أنه سيتم تلف الخلايا من السلطة الفلسطينية.
- عصا RV مع 27 G ½ بوصة إبرة ويروي RV / السلطة الفلسطينية / الرئتين مع السلطة الفلسطينية الاغاروز حتى تظهر الرئتين الرمادي. فإن جزيئات الحديد في الخليط الاغاروز جعل الرئتين تظهر رمادية اللون. وهذا سوف يستغرق حوالي 3-5 مل من PA الاغاروز اعتمادا على حجم من الفأرة. ومن المهم أيضا أن يذهب ببطء كما حقن سريع جدا قد يسبب الحديد لتتسرب إلى المجاري الهوائية.
- خذ الاغاروز الرئة من الماء المغلي وعكس لتخلط جيدا. ثم تبريد الاغاروز إلى ما يقرب من درجة حرارة الجسم بواسطة يحوم على الجليد. الاغاروز يجب أن يظل في حل ولكن لا تكون ساخنة بحيث أنه سيتم تلف الخلايا في الرئة.
- وضع الاغاروز الرئة ونعلق المحقنة إلى angiocatheter G 24 في القصبة الهوائية. لبث الاغاروز من خلال القصبة الهوائية لتضخيم تماما الرئتين. سوف الرئتين يكون easieR إلى اللحم المفروم (انظر خطوات لاحقة) إذا تضخمت بشكل مناسب الرئتين.
- إزالة كتلة القلب والرئة، وتغمره في 25 مل من الجليد الباردة PBS ليصلب الاغاروز (~ 5 دقائق). استخدام هذا الوقت لتنظيف المنطقة الجراحية.
- بالنسبة للفئران حديثي الولادة (P7-P21)، وأفضل عائد PASMC تأتي من الجمع بين 2-3 الجراء في دفعة واحدة من الخلايا. PASMC يفضل أن يكون على اتصال مع خلايا أخرى للصحة الخلية الأمثل والنمو. إذا تم استخدام الماوس واحد في عزلة، ثم الخلايا هي ضئيلة جدا والتي لا تنمو بشكل جيد. عند الجمع بين الحيوانات، والحصاد والبرد الكتل القلب والرئة معا ومن ثم الانتقال الى تنميق مرة واحدة وقد تم إزالة جميع الكتل القلب والرئة من الحيوانات.
- انتقال إلى الخلية هود الثقافة للعقم من هذه النقطة فصاعدا.
- وضع الرئتين المبردة في غطاء من سم صحن زراعة الأنسجة 10 وإزالة بعناية القلب، والغدة الصعترية، القصبة الهوائية، وأي النسيج الضام من الرئتين.
- نقل الرئتين إلى الجزء السفلي من صحن سم زراعة الأنسجة 10وإضافة ما يقرب من 1 مل من الجليد الباردة برنامج تلفزيوني العقيمة.
- اللحم المفروم الرئتين إلى قطع صغيرة جدا (1-2 ملم) مع 2 المشارط.
- كسر غيض الخروج من معقمة 5 مل ماصة المصلية. ماصة مفروم الطين الرئة في العقيمة 50 مل أنبوب مخروطي الشكل. استخدام إضافية العقيمة PBS الجليد البارد لغسل لوحة لضمان أن كل من أنسجة الرئة يحصل في مل أنبوب مخروطي 50.
- ضع مل أنبوب مخروطي 50 على المغناطيس. انتظر الأنسجة المحتوية على الحديد للانتقال إلى الجانب من الأنبوب بجانب مغناطيس. اعتمادا على نسبة من السفينة المحتوية على الحديد إلى أنسجة الرئة، وبعض من السفن قد لا يزال يسبح في هذه المرحلة. نضح قبالة PBS ببطء وبعناية محاولة عدم نضح أنسجة الرئة العائمة نظرا لأنه غير واضح إذا كان يحتوي على السفن.
- غسل الرئة بيليه 3x مع 5 مل العقيمة PBS، في محاولة مرة أخرى لتقليل كمية من أنسجة الرئة التي يستنشق.
- resuspend الكرية الرئة في 3 مل كولاجيناز وتصب في صحن 60 ملم زراعة الأنسجة. لامحاولة ماصة هذا؛ فإن أجزاء الرئة العصا إلى الداخل من ماصة الخاص.
- استخدام 3 مل إضافية لشطف الأنبوب بعد صب، وتصب هذه في 60 مم طبق زراعة الأنسجة أيضا.
- المكان الى 37 درجة مئوية الأنسجة حاضنة الثقافة لمدة 1 ساعة.
- الأنسجة ماصة + الطين كولاجيناز صعودا وهبوطا مع 15 G إبرة حادة على حقنة 5 مل حتى تتعطل جميع القطع الرئة كبيرة. الأنسجة + سوف يكون الطين كولاجيناز غائم في هذه المرحلة مع عدم وجود قطع الأنسجة والأجهزة المختلفه.
- تصب العقيمة 50 مل أنبوب مخروطي الشكل الجديد ونعلق على المغناطيس.
- غسل الطبق زراعة الأنسجة مع حوالي 5 مل من اكتمال M199 سائل الإعلام لضمان أن جميع الأنسجة تم جمعها، وتصب هذه في أنبوب مخروطي الشكل.
- نضح قبالة كولاجيناز + طاف وسائل الإعلام. هذه المرة سوف يكون هناك عدد قليل جدا من العوامات، وسوف التعاقد المحتوية على الحديد بيليه تكون على الجانب من الأنبوب المخروطية بجانب مغناطيس.
- يغسل مع 5 مل كاملة ميدIA 3X. هذا مطلوب لإبطال نشاط كولاجيناز.
- أضف 3 مل من وسائل الإعلام كاملة، ومزج صعودا وهبوطا عدة مرات لresuspend الكرية التي تحتوي على الحديد.
- صب بيليه معلق إلى 35 مم طبق زراعة الأنسجة. باستخدام المجهر، وسيكون هناك شظايا سفينة صغيرة تطوف مع جزيئات الحديد الواردة في التجويف السفينة.
- وضع صحن زراعة الأنسجة (المسمى لوحة صفر) في نسيج الثقافة الحاضنة بين عشية وضحاها. أول خلايا للانتقال من على لوحة صفر ما يقرب من 50٪ الخلايا الليفية و 50٪ PASMC، استنادا إلى تلطيخ لعلامات العضلات الملساء. وهذا ما يسمى لوحة صفر مطلي والتخلص منها في نهاية المطاف بعد خطوات تخصيب اللاحقة.
2. عزل الشريان الرئوي من الفئران حديثي الولادة - اليوم الثاني
- صب سائل الإعلام طاف من لوحة صفر في نظيفة 50 مل أنبوب مخروطي الشكل.
- نضح قبالة طاف وسائل الإعلام. هذه المرة سيكون هناك تقريبا أي العوامات، والتعاقد الحديد كونتاسوف ining بيليه تتشكل على الجانب من الأنبوب المخروطية بجانب مغناطيس.
- يغسل مع 5 مل وسائل الإعلام كاملة 3X.
- أضف 3 مل من وسائل الإعلام كاملة، ومزج صعودا وهبوطا عدة مرات لresuspend الكرية التي تحتوي على الحديد.
- تصب في طبق 35 ملم زراعة الأنسجة. باستخدام المجهر، وينظر إلى شظايا سفينة صغيرة تطوف مع جزيئات الحديد الواردة في التجويف السفينة. وستكون هذه لوحة واحدة (الشكل 1A).
- وضع صحن زراعة الأنسجة في زراعة الأنسجة حاضنة.
3. عزل الشريان الرئوي من الفئران حديثي الولادة - الأيام الستة
- صب سائل الإعلام طاف من لوحة واحدة في نظيفة 50 مل أنبوب مخروطي الشكل. تكرار هذه الخطوة عدة مرات يؤمن بأن كل من خلايا العضلات الملساء المقيمين في جدار السفينة لديك فرصة للانتقال من على طبق من ذهب ثقافة الخلية. هناك سوف عودة تناقص مع كل خطوة أي كل لوحة لديها خلايا أقل وأقل الانضمام.
- نضح قبالة طاف وسائل الإعلام. هذه المرة سيكون هناك تقريبا أي العوامات، وسوف التعاقد المحتوية على الحديد بيليه تتشكل على الجانب من الأنبوب المخروطية بجانب مغناطيس.
- يغسل مع 5 مل وسائل الإعلام كاملة 3X.
- أضف 3 مل من وسائل الإعلام كاملة، ومزج صعودا وهبوطا عدة مرات لresuspend الكرية التي تحتوي على الحديد.
- تصب في طبق 35 ملم زراعة الأنسجة. باستخدام المجهر، وينظر إلى شظايا سفينة صغيرة تطوف مع جزيئات الحديد الواردة في التجويف السفينة. وستكون هذه لوحة اثنين.
- وضع صحن زراعة الأنسجة في زراعة الأنسجة حاضنة.
4. عزل الشريان الرئوي من الفئران حديثي الولادة - اليوم التاسع
- صب طاف وسائل الاعلام من الطبق زراعة الأنسجة لوحة نظيفة اثنين الى 50 مل أنبوب مخروطي الشكل.
- لوحة Refeed اثنين مع كامل M199 وسائل الإعلام، ومكان مرة أخرى في زراعة الأنسجةالحاضنة.
- نضح قبالة طاف وسائل الإعلام. هذه المرة سيكون هناك تقريبا أي العوامات، وسوف التعاقد المحتوية على الحديد بيليه تتشكل على الجانب من الأنبوب المخروطية بجانب مغناطيس.
- يغسل مع 5 مل وسائل الإعلام كاملة 3X.
- أضف 3 مل من وسائل الإعلام كاملة وخلط صعودا وهبوطا عدة مرات لresuspend الكرية التي تحتوي على الحديد.
- تصب في طبق 35 ملم زراعة الأنسجة. باستخدام المجهر، وينظر إلى شظايا سفينة صغيرة تطوف مع جزيئات الحديد الواردة في التجويف السفينة. وستكون هذه لوحة ثلاثة.
- وضع صحن زراعة الأنسجة في زراعة الأنسجة حاضنة.
5. عزل الشريان الرئوي من الفئران حديثي الولادة - ثلاثة عشر يوم
- نضح وسائل الإعلام الخروج من لوحات 1-3.
- غسل بلطف الخلايا مع دافئ، برنامج تلفزيوني العقيمة.
- إضافة طبقة رقيقة من التربسين (~ 0.25-0.5 مل) التربسين إلى كل لوحة ليعرض للتريبسين خارج الخلايا. الخلايا هي ملتصقة جدا وسوف تحتاج إلى أن تكون في التربسين في cultu الأنسجةإعادة الحاضنة لمدة حوالي 10 دقيقة لرفع قبالة لوحة.
- حصاد الخلايا قبالة لوحات إلى 5 وسائل الإعلام كاملة مل في أنبوب مخروطي 50 مل تعلق على مغناطيس لسحب أي جزيئات الحديد المتبقية.
- غسل كل من لوحات مع 0.5 مل إضافية من وسائل الإعلام كاملة وأضيف أن وسائل الإعلام إلى أنبوب مخروطي 50 مل.
- هذه المرة، واتخاذ طاف وسائل الاعلام (لا نضح)، والتخلص من الجسيمات بيليه الحديد.
- لوحة الخلايا في 5 مل كاملة M199 وسائل الاعلام في صحن 60 ملم لديك خلايا متكدسة في غضون أيام قليلة. بدلا من ذلك، لوحة الخلايا في 10 مل كاملة M199 سائل الإعلام في الطول لوحة 10، وPASMC سوف يستغرق ما يقرب من 1-2 أسابيع أخرى للوصول إلى نقطة التقاء.
6. عزل الشريان الرئوي من الفئران حديثي الولادة - يوم أربعة عشر
- تغيير وسائل الإعلام إلى وسائل الإعلام كاملة جديدة M199 لإزالة أي التربسين المتبقية. سيكون هناك سكان رقيقة من PASMC على طبق زراعة الأنسجة (الشكل 1B).
7. الرعاية الروتينية
- تغيير وسائل الإعلام إلى وسائل الإعلام كاملة جديدة M199 حوالي 2X في الأسبوع.
- عند تقسيم هذه الخلايا، مطلوب ما يقرب من 10 دقيقة في الحاضنة في فيلم من التربسين (0.25-0.5 مل) للخلايا لرفع قبالة لوحة. باستخدام فيلم التربسين يسمح replating من PASMC دون الغزل أسفل الخلايا. إذا تم استخدام الكثير من التربسين، ثم يجب طرد في PASMC لتخرج التربسين، أو فإن الخلايا لا readhere إلى اللوحة. في بعض الأحيان، بعد الغزل أسفل الخلايا، فمن الصعب الحصول على PASMC معلق في كامل M199 سائل الإعلام.
- في ملاحظاتها، وPASMC معزولة تتصرف مثل خلايا العضلات الملساء موثوق لمدة 4-5 الممرات، ولكن الخلايا المعزولة سيكون وصمة عار لسلسة الخلايا العضلية علامات حتى مرور 7. عد تجميع أول 60 مم أو 10 سم لوحة على ثلاثة عشر يوم ومرور 2 (الطلاء بعد أول تعرض لالتربسين).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
أثناء وبعد العزلة، ويتم فحص كل PASMC بواسطة المجهر الضوئي والمناعية لسلسة علامات الخلية العضلية. بواسطة المجهر الضوئي في البروتوكول في وقت مبكر، وينظر PASMC المهاجرة على طبق زراعة الأنسجة من الحديد الصغيرة التي تحتوي على الأوعية (الشكل 1A). بعد تجميع لوحات واحد من خلال ثلاثة في ثلاثة عشر يوما، ثم جزيئات الحديد لم تعد ينظر إليها على أنها تلك التي تم انتشالها في خطوة تجميع النهائي. بدلا من ذلك، يعتبر عدد سكانها PASMC على طبق زراعة الأنسجة (الشكل 1B).
استنادا المناعية، الخلايا الأولية التي تهاجر خارج الأوعية المحتوية على الحديد ما يقرب من 50٪ والخلايا الليفية PASMC 50٪ (لا تظهر البيانات). منذ الخلايا الليفية لديها ميزة نموا كبيرا، فإن الخلايا الليفية أكثر من اكتسى الوقت PASMC على لوحة صفر. لهذا السبب، يتم تجاهل لوحة الصفر مرة واحدة هناك PASMC معزولة بشكل واضح على لوحات لاحقة. بعد تجمع، السكانمن هو PASMC> PASMC 90٪ التي وصمة عار إيجابية لكلا α-العضلات الملساء ميوسين وdesmin (الشكل 2). عندما تصويرها في 20X، وينظر متعددة الخلايا على شكل مغزل متسقة مع النمط الظاهري الخلية العضلات الملساء (الشكل 2A). عندما تصويرها في أعلى التكبير (40X)، وlamellopodia من حافة الرائدة في مجال الخلايا وحيدة هي تصور لأنها تهاجر وتنمو نحو خلايا العضلات الملساء الأخرى على طبق (الشكل 2B).
فسفودايستراز 5 (PDE5) ما يعبر عنه في PASMC وhydrolyzes المركب، وسيطا رئيسيا من نغمة الأوعية الدموية، إلى GMP غير نشط. انخفاض في PDE5 يلعب دورا حاسما في عملية التحول الأوعية الدموية الرئوية الطبيعية بعد الولادة. في نماذج حيوانية كبيرة، PDE5 ينظم تنمويا عبر الحمل، والتعبير والنشاط الانخفاض بشكل كبير بعد الولادة 27. من أجل التأكد من أن هذه PASMC معزولة الإبقاء على النمط الظاهري يتفق مع مرحلة نموهم، درسنا PDE5 ENZالنشاط YME في الماوس PASMC معزولة عن P7، P14، P21 والفئران، وكذلك الفئران البالغة. ونحن نرى أن أعلى مستويات PDE5 النشاط في PASMC المعزولة من الفئران P7. هذه المستويات تقع في PASMC معزولة عن P14 P21 والفئران. وأشار إلى أدنى مستويات PDE5 النشاط في PASMC معزولة عن الفئران البالغة (الشكل 3).
الشكل 1. PASMC حديثي الولادة تصور بواسطة المجهر الضوئي. PASMC هي تصور باستخدام مجهر الضوء في 20X. A) في اليوم الثالث من البروتوكول، على شكل مغزل PASMC يمكن رؤية المهاجرة من الأسود الصغيرة السلطة الفلسطينية الحديد مملوءة على طبق زراعة الأنسجة. B) في يوم أربعة عشر بعد تجمع، ويمكن رؤية عدد سكانها PASMC على طبق زراعة الأنسجة.
الشكل 2. PASMC حديثي الولادة وصمة عار بايجابية علامات العضلات الملساء. كانت مطلية PASMC على coverslips الزجاج المعالجة الكولاجين، ثابتة في 4٪ الفورمالديهايد، وpermeabilized مع 0.2٪ تريتون-X كما هو موضح سابقا 7،23 ألف) PASMC من P7، P14، P21 و كانت ملطخة الفئران مع المضادة للdesmin (1:200 تمييع) أو مكافحة سلس العضلات الميوسين (1:2،000 التخفيف) في 5٪ BSA، تليها رودامين الحمراء المضادة للأرنب الثانوية في التخفيف 1:200. كان مضان تصور مع مجهر epifluorescence في 20X. B) كانت ملطخة PASMC من P14، P21 والفئران مع مكافحة سلس الميوسين العضلات أو desmin على النحو الوارد أعلاه، وكان تصور مضان النحو الوارد أعلاه في 40X.
الشكل (3). فسفودايستراز 5 (PDE5) آخر هوينظم تنمويا في PASMC. تم حصادها PASMC عن البروتين الكلي ويعاير لPDE5 النشاط الأنزيمي كما هو موضح سابقا باستخدام دوري اللونية المتاحة تجاريا النوكليوتيدات مقايسة فسفودايستراز عدة 7. كان يقرأ كل عينة ± فياغرا (100 نانومتر). الفرق بين بمول المركب تحلل البروتين الكلي في ملغ في الدقيقة الواحدة ± فياغرا يمثل النشاط المركب-حلمهي PDE5 محددة. N = 4 لP7 PASMC، ن = 10 لP14 PASMC، ن = 4 لP21 PASMC، و n = 8 للكبار PASMC. * P <0.05 مقابل P7 PASMC، # P <0.05 مقابل P14 PASMC.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في هذا المخطوط، وصفنا للمرة الأولى عزلة PASMC من الفئران في P7، P14، P21 و. من أجل تحقيق هذا الهدف، وغرست في الطين من الاغاروز و 0.2 ميكرومتر جزيئات الحديد من خلال RV في السلطة الفلسطينية. ونظرا لصغر حجم جزيئات الحديد، فإنها لا يمكن أن تمر عبر السرير الشعري الرئوي، وبالتالي فهي تودع في السلطة الفلسطينية الصغيرة. وتضخم الرئتين، وإزالة فصلها. يتم سحبها في الأوعية المحتوية على الحديد التدريجي من الحل باستخدام المغناطيس. في نهاية المطاف، ومطلي السفن في طبق زراعة الأنسجة، والخلايا تهاجر خارج الأوعية وعلى لوحة الثقافة. لوحة من الخلايا الأولية هي مزيج من الخلايا الليفية وPASMC، ويتم تكرار هدم الإجراء عدة مرات لاشتقاق السكان PASMC المخصب. مع التعرض لفترات طويلة عند مستويات مرتفعة، وهناك خطر نظري أن الحديد المتبقية قد تؤثر على التوازن الأكسدة داخل الخلايا المعزولة. وهكذا، والحرص في الخطوة الأخيرة لإزالة كل بقايا الحديدقبل تجميع ونشر الخلايا. المناعية لα-العضلات الملساء ميوسين وdesmin يتم للتأكد من أن السكان المخصب هو> 90٪ PASMC. هذه الخلايا لديها PDE5 النشاط الأنزيمي، بما يتفق مع الأوعية الدموية على نحو سلس العضلات النمط الظاهري الخلية. ومن المثير للاهتمام، ونشاط انزيم PDE5 يختلف في PASMC المعزولة من الفئران من مختلف الأعمار، مما يشير إلى تنظيم التنموية المستمر في PASMC بعد العزلة.
في حين أن هذا الأسلوب هو فكريا واضحة جدا، وهي مشكلة شيوعا هو العائد المنخفض من PASMC. يمكن أن يكون هناك أسباب متعددة لهذه المشكلة، حتى عندما يتم تجميع 2-3 الفئران معا. أولا، تحقيق أفضل عائد الخلية إذا بدأت إجراء العزل فورا بعد الماوس يستسلم لجرعة زائدة isoflurane و. وبمجرد حدوث الموت، وشكل جلطات صغيرة في جميع أنحاء السرير الوعائي. وهذه الجلطات في الأوعية الدموية الرئوية منع جزيئات الحديد من الوصول إلى أكبر عدد من السلطة الفلسطينية الصغيرة، وبالتالي ديالتجعيد العائد. أيضا، صلاحية PASMC معزولة يصبح من أكبر القلق يعد الفأر هو ميتة قبل العزلة. الخطوة الأساسية المطلقة التي تؤثر العائد PASMC هو ضخ الحديد. إذا الرئتين ليست رمادية بشكل ملحوظ بعد ضخ الحديد، والأسباب المحتملة هي: 1) الحديد هو ذاهب إلى الوراء إلى الأذين الأيمن والكبد، 2) وجود ثقب أو تمزق في RV، أو 3) وهناك-جلطات صغيرة في الدورة الدموية الرئوية في مكان ما منع التسريب الحديد جيدة. وأخيرا، لاحظنا أن PASMC معزولة عن مختلف السلالات المعدلة وراثيا من الفئران تظهر معدلات نمو مختلفة لافت للنظر في الثقافة بعد العزلة. لذلك، عند أول محاولة هذا الأسلوب، فمن الأفضل لاستخدام السلالة البرية من نوع من الفئران.
ومن الواضح أن التلوث هو مصدر قلق أي مرة واحدة يتم عزل الخلايا من حيوان كامل. يتم تعقيم جميع الأدوات ومسحت مع الكحول قبل الإجراء، ثم مرة واحدة تتم إزالة الكتلة القلب والرئة، آلتتم لتر من الخطوات اللاحقة في نسيج الثقافة هود مع تقنية معقمة. باستخدام هذه الاحتياطات جنبا إلى جنب مع وسائل الإعلام التي تحتوي على المضادات الحيوية والقضاء تقريبا على أي تلوث.
مع العزلة من أي خط الخلية الأولية، هناك قلق حول كيفية طويلة خلية ستحافظ على النمط الظاهري في الثقافة. الأغنام FPASMC معزولة عن السيطرة والحملان PPHN حفاظ على النمط الظاهري على نحو سلس العضلات لمدة 8 و 5 مقاطع، على التوالي 7،14. لPASMC الماوس، فإن الخلايا تبدأ في فقدان الاستجابات يشير من قبل مرور 5 وعلامات العضلات الملساء قبل مرور 7 (لا تظهر البيانات). هذا يسلط الضوء على واحدة من القيود المفروضة على هذه التقنية. مطلوبة الفئران متعددة لتحقيق كميات صغيرة من الخلايا، والوقت من العزلة إلى خلايا كافية للتجارب طويلة؛ 2-4 أسابيع اعتمادا على عدد من الخلايا اللازمة. وأخيرا، مرة واحدة يتم عزل الخلايا، واحد من ثلاثة ممرات للعمل معهم فقط قبل أن تفقد الخلية العضلية الملساء الخاصة بهم مما يشيرالردود. فإن للمرء مجالا محتملا للتحسين هو وضع طريقة يمكن من خلالها تجميد هذه الخلايا وتعافى بنجاح من النيتروجين السائل. وسوف يسمح هذا المختبر لجعل بانتظام وتجميد الخلايا كما تتوفر الفئران، ومن ثم يمكن أن المحققين ذوبان الجليد والاستفادة من الخلايا لإجراء التجارب حسب الحاجة.
وعلى الرغم من التحدي التقني من أداء العزلة والجدول الزمني الطويل للعزلة، وهذه PASMC تمثل أداة لا تقدر بثمن لرواية ودراسة مسارات إشارات في الأوعية الدموية الرئوية الفئران النامية. ونحن نعتقد أن هذا الأسلوب لعزل PASMC الماوس حديثي الولادة تسمح للتحقيق تعزيز مسارات الإشارات الرئيسيين المشاركين في تطوير ارتفاع ضغط الدم الرئوي، والتي سوف تؤدي إلى فهم أفضل للإمراض المرض وتسمح لتطوير علاجات جديدة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة HL109478 (KNF). يعترف الكتاب وشكرا جينا كيم وجوان تايلور لمساعدتها في عزل والمحافظة على PASMC في الثقافة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bard Parker surgical blade handle | BD | 371030 | |
| Stainless steel surgical blades #10 (sterile) | Miltex | 4-310 | |
| Syringes (3 ml and 5 ml, sterile) | BD | 309657 and 306646 | |
| Needles (27 G, sterile) | BD | 305109 | |
| Angiocatheter (24 G, sterile) | BD | 381412 | |
| Monoject blunt cannula (15 G) | Kendall | SWD202314Z | |
| Sutures | Fisher Scientific | NC9782896 | |
| Dynal magnet particle collector | Invitrogen | 120-01D | This is a critical tool for the protocol. |
| Tissue culture plates (35 mm, 60 mm, and 10 cm, sterile) | BD | 353001, 353004, and 353003 | Any brand of tissue culture plates will be fine. |
| Iris Scissors (4 ½ inch stainless steel) | American Diagnostic Corporation | 3424 | |
| Forceps (4 inch stainless steel) | Quick Medical | L5-5004 | |
| D-PBS | Mediatech | 21-031-CV | |
| M199 media | Mediatech | 10-060-CV | |
| Penicillin/streptomycin | VWR | TX16777-164NWU | |
| Fetal bovine serum | Hyclone/Thermo Scientific | SH3091003 | Heat inactivate at 55 °C for 45 min. For consistency in results, lot match all serum and obtain from same vendor. |
| Iron particles (iron (II, III) oxide powder) | Aldrich Chemical Company | #31,006-9 | |
| Agarose | Sigma | A9539 | |
| Collagenase (made to 80 U/ml) | Sigma | C5138 | |
| Isoflurane | Butlet Schein | NDC 11695-6776-1 | |
| Nikon Eclipse TE2000-U with a Cascade Photometrics 12-bit camera | Nikon | TE2000-U | Any good light microscope will be fine to observe PASMC in culture. |
| Anti-desmin antibody | Sigma | D-8281 | Use at 1:200 dilution for immunostaining. |
| Anti-smooth muscle myosin | Biomedical Technologies | BT-562 | Use at 1:2,000 dilution for immunostaining. |
| Rhodamine-red anti-rabbit secondary | Molecular Probes/Invitrogen | R-6394 | Use at 1:200 dilution for immunostaining. |
| Nikon Eclipse TE-300 fluorescent microscope and Cool Snap digital camera | Nikon | TE300 | Any good epifluorescence microscope will be fine for immunostaining. |
| Cyclic nucleotide phosphodiesterase assay kit | Enzo Life Sciences | BML-AK800-0001 | This is the only colorimetric PDE enzyme activity assay available. |
| Sildenafil | Sigma | PZ-0003 | A PDE5-selective inhibitor is required for the PDE enzyme activity to determine specificity of cGMP hydrolysis. |
References
- Levin, D. L., Rudolph, A. M., Heymann, M. A., Phibbs, R. H. Morphological development of the pulmonary vascular bed in fetal lambs. Circulation. 53, 144-151 (1976).
- Walsh-Sukys, M. C., et al. Persistent pulmonary hypertension of the newborn in the era before nitric oxide: practice variation and outcomes. Pediatrics. 105, 14-20 (2000).
- Khemani, E., et al. Pulmonary artery hypertension in formerly premature infants with bronchopulmonary dysplasia: clinical features and outcomes in the surfactant era. Pediatrics. 120, 1260-1269 (2007).
- Jobe, A. H., Bancalari, E.
- Mourani, P. M., Sontag, M. K., Younoszai, A., Ivy, D. D., Abman, S. H. Clinical utility of echocardiography for the diagnosis and management of pulmonary vascular disease in young children with chronic lung disease. Pediatrics. 121, 317-325 (2008).
- Check, J., et al. Fetal growth restriction and pulmonary hypertension in premature infants with bronchopulmonary dysplasia. J. Perinatol. , (2013).
- Farrow, K. N., et al. Hyperoxia increases phosphodiesterase 5 expression and activity in ovine fetal pulmonary artery smooth muscle cells. Circ. Res. 102, 226-233 (2008).
- Aschner, J. L., et al. Endothelial nitric oxide synthase gene transfer enhances dilation of newborn piglet pulmonary arteries. Am. J. Physiol. 277, 371-379 (1999).
- Cornfield, D. N., Stevens, T., McMurtry, I. F., Abman, S. H., Rodman, D. M. Acute hypoxia increases cytosolic calcium in fetal pulmonary artery smooth muscle cells. Am. J. Physiol. 265, 53-56 (1993).
- Bailly, K., Ridley, A. J., Hall, S. M., Haworth, S. G. RhoA activation by hypoxia in pulmonary arterial smooth muscle cells is age and site specific. Circ. Res. 94, 1383-1391 (2004).
- Black, S. M., DeVol, J. M., Wedgwood, S. Regulation of fibroblast growth factor-2 expression in pulmonary arterial smooth muscle cells involves increased reactive oxygen species generation. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 294, 345-354 (2008).
- Cogolludo, A., Moreno, L., Lodi, F., Tamargo, J., Perez-Vizcaino, F. Postnatal maturational shift from PKCzeta and voltage-gated K+ channels to RhoA/Rho kinase in pulmonary vasoconstriction. Cardiovasc. Res. 66, 84-93 (2005).
- Wedgwood, S., et al. Hydrogen peroxide regulates extracellular superoxide dismutase activity and expression in neonatal pulmonary hypertension. Antiox. Signal. 15, 1497-1506 (1089).
- Farrow, K. N., et al. Mitochondrial oxidant stress increases PDE5 activity in persistent pulmonary hypertension of the newborn. Respir. Physiol. Neurobiol. 174, 272-281 (2010).
- Chester, M., et al. Cinaciguat, a soluble guanylate cyclase activator, augments cGMP after oxidative stress and causes pulmonary vasodilation in neonatal pulmonary hypertension. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 301, 755-764 (2011).
- Konduri, G. G., Bakhutashvili, I., Eis, A., Gauthier, K. M. Impaired voltage gated potassium channel responses in a fetal lamb model of persistent pulmonary hypertension of the newborn. Pediatr. Res. 66, 289-294 (2009).
- Olschewski, A., et al. Contribution of the K(Ca) channel to membrane potential and O2 sensitivity is decreased in an ovine PPHN model. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 283, L1103-L1109 (2002).
- Aslam, M., et al. Bone marrow stromal cells attenuate lung injury in a murine model of neonatal chronic lung disease. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 180, 1122-1130 (2009).
- Balasubramaniam, V., et al. Bone marrow-derived angiogenic cells restore lung alveolar and vascular structure after neonatal hyperoxia in infant mice. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 298, L315-L323 (2010).
- de Visser, Y. P., et al. Phosphodiesterase-4 inhibition attenuates pulmonary inflammation in neonatal lung injury. Eur. Respir. J. 31, 633-644 (2008).
- de Visser, Y. P., et al. Sildenafil attenuates pulmonary inflammation and fibrin deposition, mortality and right ventricular hypertrophy in neonatal hyperoxic lung injury. Respir. 10, 30 (2009).
- Ladha, F., et al. Sildenafil improves alveolar growth and pulmonary hypertension in hyperoxia-induced lung injury. Am. Respir. Crit. Care Med. 172, 750-756 (2005).
- Farrow, K. N., et al. Brief hyperoxia increases mitochondrial oxidation and increases phosphodiesterase 5 activity in fetal pulmonary artery smooth muscle cells. Antioxid. Redox Signal. 17, 460-470 (2012).
- Waypa, G. B., et al. Hypoxia triggers subcellular compartmental redox signaling in vascular smooth muscle cells. Circ. Res. 106, 526-535 (2010).
- Waypa, G. B., et al. Superoxide Generated at Mitochondrial Complex III Triggers Acute Responses to Hypoxia in the Pulmonary Circulation. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 187, 424-432 (2013).
- Marshall, C., Mamary, A. J., Verhoeven, A. J., Marshall, B. E. Pulmonary artery NADPH-oxidase is activated in hypoxic pulmonary vasoconstriction. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 15, 633-644 (1996).
- Farrow, K. N., et al. Superoxide Dismutase and Inhaled Nitric Oxide Normalize Phosphodiesterase 5 Expression and Activity in Neonatal Lambs with Persistent Pulmonary Hypertension. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 299, L109-L116 (2010).
