단백질 A 아가로즈 비드가 포장된 컬럼을 이용한 전통적인 친화성 크로마토그래피와 비교하여, 단백질 A 멤브레인 흡착제는 항체 및 기타 Fc 단편 발현 단백질의 실험실 규모 절연을 크게 가속화할 수 있습니다. 적절한 분석 및 정량화 방법은 단백질 처리를 더욱 가속화할 수 있으므로 20시간 이상의 근무 시간이 아닌 한 작업 시간에 격리/특성을 완료할 수 있습니다.
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방법 논문
단백질 A 멤브레인 흡착제 및 간소화된 워크플로우를 사용하여 키메라 인간 Fc 발현 단백질의 격리 및 특성화
이 논문에서
요약
초록
세포 배양 체와 용세포 용액으로부터 생체 분자의 산업 규모의 정제에 대한 실험실 규모는 친화성 크로마토그래피를 사용하여 달성 될 수있다. 다공성 단백질A아가로즈 구슬을 사용하여 열에 포장된 친화성 크로마토그래피는 틀림없이 IgG의 Fc 단편을 발현하는 항체 및 재조합 단백질의 실험실 스케일 절연의 가장 일반적인 방법이지만, 시간이 많이 걸리고 비용이 많이 드는 과정이 될 수 있다. 희석 솔루션에서 수백 마이크로그램의 단백질을 밀리그램으로 회수해야 하지만 고압 액체 전달 시스템 및/또는 생체 분리 에 대한 전문 지식을 갖춘 인력에 대한 접근이 부족한 소규모 기초 과학 실험실에서는 시간과 재정적 제약이 특히 어렵습니다. 또한, 제품 정량화 및 특성화는 또한 여러 근무일에 걸쳐 처리 시간을 과도하게 연장하고 비용(소모품, 임금 등)을부풀릴 수 있습니다. 따라서, 실험실 규모 격리 및 항체 및 Fc 단편을 소유한 다른 단백질의 특성화를 위해서는 빠르고 저렴하면서도 효과적인 프로토콜이 필요합니다. 이를 위해 20시간 이상의 근무 시간을 요구하는 기존의 방법과는 달리 9시간 미만(약 1일 근무)과 4시간 이내에 제한된 경험의 기술 직원이 완료할 수 있는 프로토콜을 고안했습니다. 대부분의 필수 장비는 표준 생의학 과학, 생화학 및 (바이오) 화학 공학 실험실에서 쉽게 사용할 수 있으며 모든 시약은 시판됩니다. 이러한 프로토콜을 입증하기 위해, 대표적인 결과는 키메라 뮤린 갈렉틴-1이 세포 배양 상수로부터 인간 Fc(Gal-1hFc)에 융합되어 단백질 A막 흡착기를 사용하여 분리되었다는 것을 제시한다. 정제 된 Gal-1hFc는 신속한 서양 블로팅 분석 절차를 사용하여 정량화되었으며 유동 세포 측정을 사용하여 특징지어졌습니다. 간소화된 워크플로우는 항체와 같은 다른 Fc 발현 단백질을 위해 수정하거나 대체 정량화 및 특성화 방법을 통합하도록 변경할 수 있습니다.
서론
세포 배양 초월제로부터 면역글로불린 G(IgG) Fc 단편을 발현하는 항체 및 재조합 단백질의 분리및 희석 된 세포 용액은 단백질 A 친화 크롬 토그래피를 사용하여 달성 될 수있다. 기초 과학 및 공학 실험실 및 산업에서다공성 단백질 A-코팅 아가로즈, 유리 또는 폴리머 비드로 포장 된 컬럼은 높은 재정적 비용과 긴 처리 시간1-3에도불구하고 친화성 크로마토그래피에 가장 일반적으로 사용됩니다. 친화성 크로마토그래피는 실험실 및 산업 설정2,4모두에서 가장 큰 비용과 처리 병목 현상을 나타낸다는 것이 좋습니다. 그 결과, 공정열차1,2,5-7에서전체적인 제품 회수를 희생하지 않고 비용 및 처리 시간을 줄이기 위해 수많은 개선이 개발되었다. 특히 항체 및 기타 Fc-발현 단백질의 분리에 대한 유망한 단백질A막흡착제 2,5,7-10을이용한 친화성 크로마토그래피이다. 컬럼 크로마토그래피에서 의Fc 포획은확산제한(즉, Fc-표현 단백질은 내부 모공을 통해 확산되어 단백질 A의 대부분에 도달해야 한다)와 고압 강하량, 멤브레인 흡착제의 질량 수송은 대량 대류에 의해 구동되어 확산한계를 8,9,11,12로방지한다. 또한 멤브레인 흡착기를 가로지르는 압력 강하가 낮기 때문에 구슬이 가득한 컬럼....
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프로토콜
1. 단백질 A의 선호도 확인
- Fc-expressing 단백질(재조합 융합 단백질 또는 IgG 항체, 본선 "단백질"이라고 불리는 IgG 항체)이 단백질 A14-17을 사용하기 전에 단백질A에 대한 허용 가능한 친화력을 가지고 있는지 확인하고, 주식 용액에 단백질의 존재를 테스트한다(예를들어, 세포 배양 과민제는 1,00분에서 원심분리에 의해 정제됨). 유동 세포측정, 서양 블로팅, ELISA 등을 사용하십시오. 실험실 선호도에 따라 Fc의 단백질 기능 및/또는 존재를 감지합니다. 이상적으로, 단백질을 초과하는 것을 피하기 위해 세포 배양 상수(step 6)에서 단백질을 정량화하여 단백질A 막 흡착 용량을 초과하지 않도록 한다. 단백질이 검출되면 진행합니다.
2. 단백질 A 막 흡착및 세포 배양 상수 준비
- 멤브레인 흡착기를 준비하기위한 제조업체의 지침을 따르십시오. 공기가 멤브레인 흡착제에 들어가지 마십시오. 멤브레인 흡착을 통해 퍼진 모든 솔루션은 실온에서 0.22 μm 필터를 사용하여 사전 필터링되어야 합니다. 0.22 μm 여과 Dulbecco의 인산완충식염(DPBS) 또는 선택 및 방전 기포버퍼로 10ml 주....
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결과
Fc 발현 단백질의 격리 및 특성화를 위한 간소화된 프로토콜은 희석세포 배양 초나티로부터 인간 Fc(Gal-1hFc)에 융합된 키메라 뮤린 갈렉틴-1을 처리하는 데 일상적으로 사용됩니다. 그림 2의 순서도는 프로토콜의 각 단계에 대한 워크플로우와 시간을 보여 줍니다. 300ml의 전형적인 미퍼나탄의 경우, 용출 분획의 선택적 유동 세포측정 시험이 수행될 때 총 처리 시간은 약 9시간입니다. 모든 유동 세포측정 분석이 생략되면, 유동 세포계 또는 개별 실험실 선호도의 부족으로 인해 총 처리 시간은 4시간으로 짧을 수 있다. 일반적으로 처리 시간은 작업자 경험, 처리된 상주 처리량 및 정량화 및 특성화 방법에 따라 달라집니다.
유동 세포측정은 개시 세포 배양 상신체에서 기능성 Gal-1hFc(즉, 유방암 세포에 대한 리간드를 검출할 수 있는 Gal-1)의 존재를 테스트하기 위해 사용되었다. 신선한 세포 배양 배지는 음의대조군(1.......
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토론
본 명세서에 기재된 프로토콜은 제품 회수 또는 팽창 비용을 크게 손상시키지 않으면서 인간 Fc(Gal-1hFc)를 발현하는 키메라 융합 단백질을 신속하게 분리하고 특성화하기 위해 개발되었다. 간소화된 워크플로우의 주요 구성 요소는 절연을 위한 단백질 A 멤브레인 흡착제, 서양 블로팅에 의한 특성화를 위한 반건조 전달 및 진공 보조 면역블로팅입니다.
세포 배양 상류체 300ml에서 Gal-1hFc의 격리 및 특성화를 위한 처리 시간이 급격히 감소(기존 프로토콜에서 20시간 이상에 비해 유선형 프로토콜에서 약 9시간)은 전술한 주요 성분, 특히 멤브레인 흡착제의 통합에 크게 기인한다. 최대 권장 유량10ml 의 수퍼나탄트/분에서 멤브레인 흡착제 적재는 30분 안에 완료할 수 있습니다. 단백질 A 멤브레인 흡착제에서 Gal-1hFc 회복은 일반적으로 실험실에서 10-30%까지 다양하며, 세포 배양 슈퍼나탄의 Gal-1hFc 농도가 5-10 mg/ml일 때 숙련된 실험실 인력에 의해 정.......
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공개 사항
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감사의 글
저자들은 루이스 F. 델가딜로(오하이오 대학교 화학 분자 공학부), 매튜 H. 윌리엄스(오하이오 대학교 화학 분자 공학부), 필리베르토 세데노 로랑 박사(브리검 여성 병원 및 하버드 의과 대학)에게 전문적인 기술 지원을 부탁드립니다. 저자는 또한 겨울 감사 를 원한다 2011 CHE 404/BME 504 그리고 가을 2012 CHE 4830/BME 5830 학생 (화학 및 생물 분자 공학 및 생물 의학 공학 프로그램 학과, 오하이오 대학) 기술 조언 및 토론에 대 한. 이 작품은 국립 과학 재단 (NSF) 주요 연구 계측 보조금 CBET-1039869 (MMB), NSF CBET-1106118 (MMB), 피부과 재단 연구 보조금 A050422 (SRB), 국립 보건원 (NIH) NCI 보조금 1R15CA1611에 의해 지원되었다 (MMB), NIH Kirschstein-NRSA 박사 후 펠로우십 F32CA144219-01A1 (SRB), NIH/NCI R01CA173610 (CJD), NIH NCCAM 보조금 R01AT004628 (CJD).
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 단백질 A 멤브레인 흡착제 (Sartobind Protein A 2 ml) | Sartorius-Stedim | 93PRAP06HB-12--A | |
| Amicon Ultra 원심 필터, 10 kDa, 4 | ml Millipore | UFC801008 | 필요한 경우 15 ml 용량 사용 |
| 멸균 진공 필터 유닛, 0.22 µ m, 500ml | Millipore | SCGPU05RE | |
| Luer Lock 팁이 있는 10ml 주사기 | BD | 301604 | |
| Luer Lock 팁이 있는 30ml 주사기 | BD | 309650 | |
| Tygon lab tubing (1/16 in x 1/8 in x 50 ft) | Cole Parmer | WU-95903-16 | |
| Slide-A-Lyzer MINI 투석 기기(10K MWCO) | Thermo Scientific | 69576 | |
| Snap i.d. 항체 수집 트레이 | EMD Millipore | WBAVDABTR | |
| Snap i.d. 단일 웰 블롯 홀더 | EMD Millipore | WBAVDBH01 | |
| 용리 완충액 | Thermo Scientific | 21004 | |
| Tris, 초순수 | Fisher Scientific | 819623 | |
| 염화나트륨 | Fisher Scientific | 7647-14-5 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-100 | |
| DPBS | Thermo Scientific | SH30028.02 | |
| DPBS with Ca2+/Mg2+ | Life Technologies | 14080-055 | |
| BSA | Sigma | A9647 | |
| Human Fc | Bethyl Research Laboratories | P80-104 | |
| Anti-human Fc-APC | Jackson Immunoresearch | 109136170 | |
| Anti-human Fc-AP | Bio-Rad | 170-5018 | |
| 알칼리성 포스파타제 기질 | Promega | S3841 | |
| 유세포 분석 튜브(5ml 폴리스티렌 또는 폴리프로필렌) | BD | 352054 | |
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참고문헌
- Gagnon, P. Technology trends in antibody purification. J. Chromatogr. A. 1221, 57-70 (2012).
- Gottschalk, U. Bioseparation in antibody manufacturing: The good, the bad and the ugly. Biotechnol. Prog. 24, 496-503 (2008).
- Liu, H. F., Ma, J., Winter, C., Ba....
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재인쇄 및 허가
