Summary
L'incisive de la souris en croissance continue fournit un modèle pour l'étude de renouvellement des tissus dentaires à partir de cellules souches épithéliales dentaires (DESCs). Un système solide de façon cohérente et fiable obtention de ces cellules de l'incisive et leur expansion in vitro est rapporté ici.
Abstract
Comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires qui sous-tendent la régénération de la dent et le renouvellement est devenu un sujet de grand intérêt 1-4, et l'incisive de la souris fournit un modèle pour ces processus. Cet organe remarquable pousse en permanence tout au long de la vie de l'animal et génère tous les types de cellules nécessaires de piscines actives de cellules souches adultes logés dans le labiale (vers la lèvre) et multilingue (vers la langue) boucle col de l'utérus (CL) des régions. Seules les cellules souches de l'art dentaire labiale CL donnent lieu à adamantoblastes qui génèrent émail, l'enveloppe externe de dents, à la surface labiale. Cette formation de l'émail asymétrique permet à l'abrasion, à la pointe de l'incisive, et les progéniteurs et les cellules souches dans le incisive proximale veiller à ce que les tissus dentaires sont constamment renouvelés. La capacité d'isoler et de cultiver ces cellules progénitrices ou souches in vitro permet leur expansion et ouvre les portes à de nombreuses expériences pas réalisables in vivo, comme htests de débit aute de facteurs de régulation de cellules souches potentiel. Ici, nous décrivons et démontrons une méthode fiable et cohérente à des cellules de culture de la CL vestibulaire de l'incisive de la souris.
Introduction
L'une des caractéristiques uniques de vertébrés est l'évolution de dents. La dent est devenue un important système modèle pour de nombreux domaines de recherche, comme les voies moléculaires et morphologiques spécialisations pertinentes à cet organe ont été étudiés à partir de plusieurs points de vue, y compris par les biologistes du développement et de l'évolution 5. Plus récemment, le domaine de la médecine régénérative a commencé à acquérir de précieuses connaissances en utilisant la dent comme un modèle. En particulier, la découverte de cellules souches épithéliales dentaires a été un progrès important 6-13.
Tous les rongeurs possèdent incisives croissance continue dont la croissance est alimentée par les cellules souches, faisant de ces dents d'un système de modèle accessible pour étudier la régulation des cellules souches adultes. expériences en matière d'étiquetage dans les années 1970 10,11, suivie par la lignée génétique des expériences de traçage 8,9,12,14, ont démontré que DESCs résident dans la région proximale de l'incisive. La tigedescendance des cellules épithéliales dans le compartiment sur le côté labial de déplacement hors de la niche putatif, connu sous le col de l'utérus boucle labial (CL), et de contribuer à une population de cellules appelées transit d'amplification (AT) des cellules (figure 1). Plus précisément, DESCs résident dans l'épithélium externe de l'émail (OEE) et réticulum étoilé (SR) 8,9,14, et l'épithélium adamantin interne (EEI) donne lieu à des cellules d'assistance technique qui progressent à travers un nombre limité de cycles cellulaires et mouvement de manière distale le long de la longueur de l'incisive (Figure 1). Les améloblastes de différenciation dans l'incisive de la souris continuent à se déplacer le long de distale de l'incisive à un taux remarquable d'environ 350 um en une seule journée 15,16. Comme ils se déplacent, les cellules se différencient en améloblastes matures et strate intermedium (SI) des cellules. Après le dépôt de la totalité de l'épaisseur de la matrice de l'émail, bon nombre des adamantoblastes subissent une apoptose, et les cellules restantes diminuer en taille et réguler la maturation émail <sup> 17. La lignée des autres types de cellules dans le CL labial, tels que le SR, est moins claire, et les données concernant les cellules souches dans le mésenchyme 18 et dans la face linguale CL commencent seulement à émerger.
En utilisant le modèle de l'incisive de la souris, un certain nombre de groupes ont travaillé à élucider les voies génétiques et les processus biologiques cellulaires impliqués dans le renouvellement des organes à base de cellules souches naturel. Cependant, la labiale CL contient un nombre relativement restreint de cellules, estimée à environ 5.000 par incisive de la souris, ce qui permet de travailler avec des cellules primaires contester. Par conséquent, des efforts ont été faits pour la culture et d'élargir ces cellules in vitro 6,16,19,20 afin d'ouvrir de nouvelles portes à des approches expérimentales qui ne sont pas réalisables in vivo. L'étude la plus récente a démontré que ces cellules peuvent à la fois se renouveler et de se différencier en cellules exprimant amelogenin lorsqu'elles sont cultivées 13. Ici, nous décrivons et démontrons une méthode pour ee culture fiable et cohérente des cellules de la labiale de la souris CL.
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Protocol
1. Disséquer Basse Hemi-mandibules de souris adulte
- Avant d'effectuer ce protocole, obtenir l'approbation institutionnel nécessaire et assurez-vous de respecter toutes les directives de protection des animaux. Euthanasier des animaux en utilisant la norme IACUC procédures approuvées. Pour ce travail asphyxie au CO2 a été utilisée, suivie par dislocation cervicale.
- OPTION: tête séparée du reste du corps en utilisant une lame de rasoir.
- Retirez la peau de la lèvre inférieure à l'encolure.
- Avec un scalpel, faire une incision entre les deux incisives inférieures, qui sont faiblement connectées. Après application d'une pression, la mandibule est divisé en deux moitiés.
- Caler le scalpel entre le condyle de la mâchoire et de l'articulation mandibulaire temporelle et couper le long de la muscle de la mâchoire pour détacher la mâchoire.
- Retirez tous les muscles, les tendons et les ligaments jusqu'à ce qu'il ne reste de l'os.
2. Isoler l'incisive
- Avec un scalpel # 15, Soigneusement raser l'os à un angle de 45 ° à partir de l'extrémité distale à l'extrémité proximale de la région membraneuse. Utilisez la pointe du scalpel à prendre une distance n'importe quel os restant, y compris les fragments d'os sur le bord. Lentement commencer à chercher loin à la plaque corticale linguale de la mandibule, en commençant juste en dessous de la 3 ème molaire.
- Continuez jusqu'à ce que l'incisive est propre, travailler soigneusement vers la zone contenant le CL.
- Retirer nerf alvéolaire inférieur faisceau.
- Faire une coupe propre pour enlever la première l'os et les tissus à proximité de la CL.
- Faire une deuxième coupe distale avec le scalpel, plus ou moins en dessous de la 2 ème molaire. La région incisive proximale est ensuite disséqué en insérant le scalpel entre l'os et la surface interne de l'incisive proximale. Ceci doit être effectué avec soin, de manière à ne pas déchirer le tissu. La motion de l'incision est proximal-distal.
STEP ALTERNATIVE:
Retirer autant que possible os long de la zone au-dessus du incisor. Une fois la zone est dégagée, retirez soigneusement toute incisive en utilisant une taille de 5 pinces pour manipuler la partie de l'émail plus proche de la région CL. - Placer le tissu disséqué (CL soit isolé comme dans la figure 3E, ou l'ensemble de l'incisive comme dans la variante Etape 2.5) dans 2% de collagénase dans du PBS 1X pendant 3-4 heures à 4 ° C dans une plaque de faible adhérence. Pour 1-10 incisives, utiliser 100 pi par puits dans une plaque de 12 puits. Pour plus de 10 incisives, utiliser 500 pi par puits dans une plaque à 6 puits à faible adhérence.
3. Microdissect la labiale col de l'utérus boucle
- Retirer région CL de la collagénase et la place dans les médias DMEM/F12 froid.
- Tirez doucement à l'extrémité inférieure de la CL en utilisant soit la taille 5 forceps ou une seringue à insuline (1 cc, 28 G ½); mésenchyme va s'écrouler tout l'épithélium reste intacte. Le CL et l'épithélium adjacent qui s'étend latéralement comme une structure «en forme d'aile" seront visibles.
- Supprimerle bourgeon apical de l'épithélium adjacente en faisant une incision en forme de V sur chaque côté, et placer immédiatement en DMEM/F12 froid sur de la glace.
- Répétez l'opération pour tous les CL, de recueillir dans 1,5 ml tube de centrifugeuse.
- Isoler tube de centrifugeuse avec des échantillons, retirer les supports, les remplacer par 100 ul solution de détachement cellulaire.
- Incuber les tissus dans une solution de détachement des cellules pendant 30 min à 37 ° C.
- Dissocier les tissus pour produire une suspension cellulaire unique par pipetage et l'aide d'un faible coefficient d'adhérence pointe de la pipette 1000 pi vers le bas. Les cellules peuvent aussi être placées à travers un tamis cellulaire stérile pour réaliser la dissociation.
- Compter les cellules avec un hémocytomètre, sur la plaque en matière plastique pour culture de tissus ou tout autre matériau souhaité.
4. Culture primaire de DESCs
- Cellules de la plaque dans une plaque à 6 puits à raison de 6.1 x 10 4 cellules / ml dans des milieux DESC, qui se compose de DMEM/F12 supplémenté avec de l'EGF de la souris une protéine recombinante à une concentration de 20 ng / ml, FGF protéine recombinante à une concentration de 25 ng / ml, compléter 1X B27, et une solution à 1% d'antibiotiques (pénicilline, 100 U / ml, streptomycine, 50 pg / ml).
- Cultiver les cellules étalées sur une plaque à 6 puits à 37 ° C dans 5% de CO 2 dans 1 ml de DESC médias. Ne pas déranger cultures initiales pendant 5 jours après l'étalement de permettre l'adhésion cellulaire et la formation de colonies.
- Pour le premier changement de médias, remplacer la moitié du volume (500 pi) de vieux médias avec la moitié du volume (500 pi) de nouveaux médias. Vérifiez colonies au microscope lors du changement de support.
- Après le premier changement de support, continuer à changer de support (1-2 ml) tous les 2 jours. Vérifiez colonies au microscope lors du changement de support.
5. DESCs Passage
- Aspirer le milieu et laver les cellules 3x avec PBS préchauffé.
- Ajouter préchauffé à 0,25% de trypsine-EDTA dans une solution saline et incuber à 37 ° C pendant 10 à 15 min pour les DESCs à détacher.
- Ajouter un média DESC pour neutraliser la trypsine, la pipette doucement le long tissu plaque de culture pour recueillir les cellules, et les placer dans un tube de 15 ml conique.
- Isoler les cellules à 800 g pendant 2 min.
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Representative Results
L'hémi-mandibule de la souris un comprend croissance continue incisive et trois molaires enracinées (figure 1A). Toutes les dents sont constituées de la dentine et de l'émail, les deux composants minéralisées de la couronne de la dent (Figures 1A et 1A '). Les maisons des incisives deux niches de cellules souches appelées CL labiale et linguale CL, et l'émail est formé exclusivement sur le côté labial (figure 1A). DESCs sont responsables de la formation de l'émail incisive et sont logés dans le CL labial, notamment l'OEE et SR (figure 1A'') 8,9. Le labiale CL contient également l'EEI, les cellules TA, et la SI (figure 1A''). Notre technique est axée sur la dissection et l'isolement de DESCs de la CL labiale (figure 1A''). Krt14-actine GFP marque toutes les cellules épithéliales dérivées de l'hémi-mandibule (figure 1B), et la labiale CL peut être clairement vu thropouah la mandibule (figure 1B ', flèche blanche). Il convient de noter que tous les types de cellules peuvent être identifiées sous un grossissement supérieur (comparer les figures 1A '' et B'').
La procédure pour l'isolement de DESCs du labial CL est résumée dans la figure 2. Brièvement, l'hémi-mandibule est d'abord enlevé de l'animal, de l'os mandibulaire est enlevée pour exposer l'labial CL, puis le labial CL est traitée avec de la collagénase à séparer l'épithélium du mésenchyme environnant. Le CL est microdisséquées, traité avec du tampon de dissociation cellulaire, et étalées dans des plaques de culture de tissus. La séparation de la CL labial de l'os de la mâchoire sous-jacente (figure 3) et l'addition d'un volume approprié de médias sont essentiels pour la croissance et l'isolement des colonies, respectivement. De petites colonies epitheliales serrés formés à l'aide de cette technique peuvent être consultées par 7 jours (Figure 4A),et celles-ci deviennent des grandes colonies dans les 2-3 semaines (Figure 4B).
Figure 1. Illustrations de l'incisive de souris adulte. (A) La souris adulte hémi-mandibule montrant les composants minéralisés, émail et la dentine, et les deux types de dents, molaires et incisives. La région de l'incisive proximale où les DESCs sont logés est mise en évidence dans A '. (A') de vue sagittale de l'incisive proximale montrant les deux niches de cellules souches, la boucle col de l'utérus labiale et linguale (LACL et LiCl), améloblastes qui génèrent l'émail, et les odontoblastes qui forment la dentine. Le lad, qui génère exclusivement cellules précurseurs améloblaste et forment finalement incisive émail est mis en évidence dans un''. (A'') Le LACL montrant l'épithélium adamantin externe (OEE), réticulum étoilé (SR), émail intérieur épithélium (EEI), région de transit d'amplification (TA), et la strate intermède (SI). Le SR est représenté en bleu et rose foncé pour tenir compte des sous-populations ayant des densités différentes. (B) Visualisation de la boucle col de l'utérus à l'aide d'une souris rapporteur fluorescent, KRT14-EGFP/Actb. L'os est relativement auto-fluorescente, et l'enlèvement de l'os cervical expose la boucle (B ') et le reste de l'épithélium, qui peut ensuite être facilement excisé. (B'') Toutes les structures de boucle du col de l'utérus, y compris l'OEE, IEE, TA SI et peut être facilement visualisée avec le gène rapporteur. Barres d'échelle B ', B "= 2 mm, B" = 50 um. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Figure 2. Vue d'ensemble de la dissection et l'isolement de la CL de l'incisive de la souris. Représentation schématique de la procédure. Le CL est situé à l'extrémité proximale de l'incisive inférieure. La première étape consiste à supprimer alentours os de la mâchoire pour exposer l'incisive avec CL intact. Ensuite, l'organe de dent est isolé et placé dans de la collagénase à 2% épithélium distinct du mésenchyme. Après 4 heures d'incubation, le CL est excisé manuellement, dissociée en cellules individuelles, et on les cultive sur des plateaux de culture de tissu standard.
Suppression Figure 3. Osseuse de la mandibule de la souris pour exposer la région CL sous-jacent. Points de contrôle visuels pour la suppression de l'os du processus de dissection sont présentés. (A) Indique l'hémi-mandibule unefter Etape 1.5, une fois que le muscle, tendon et ligament sont retirés de l'os (B). Indique la zone pour commencer à retirer l'os, à partir de juste en dessous de la 3 ème molaire, déplacer de manière proximale vers la région contenant le CL. Ensuite, tous les os proximal de la CL est retiré (C), comme indiqué à l'étape 2.4. La prochaine incision pour enlever le reste de l'os comme il est indiqué à l'étape 2.5 est représenté en (D). Enfin, le CL est retirée de l'os restant comme indiqué à l'étape 2.6 (E), vue agrandie (encart).
Figure 4. Des résultats représentatifs de succès la formation de colonies in vitro. A. Phase microscopie à contraste de DESCs, après placage en culture pendant 7 jours. La formation de colonies serré indique réussie isolatio épithélialen sans contamination mésenchymateuses. Barre d'échelle = 400 um. B. Après 10 jours d'incubation, les colonies sont de plus grande taille et les cellules ont une morphologie épithéliale pavée typique. Barre d'échelle = 100 um. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Les cellules épithéliales ont d'abord été cultivées avec succès il ya 40 ans 21-24 et, plus récemment, réussi à isoler des cellules souches épithéliales 25-27 a fait progresser notre connaissance de la biologie épithéliale. Nous rapportons un protocole pour isoler le DESCs de l'incisive de souris adulte, une population relativement peu étudié des cellules souches qui a le potentiel pour obtenir des informations importantes sur la biologie dentaire et la formation de l'émail. Ce protocole a été initialement fondée sur les précédents rapports de l'isolement de cellules souches épithéliales du follicule pileux 28. Alors que de nombreux protocoles utilisent des couches d'alimentation et de sérum à maintenir les cellules souches épithéliales, notre méthode est un système d'alimentation sans sérum libre. Cependant, notre milieu de croissance exige l'utilisation d'un cocktail de l'EGF, FGF2 et supplément B27. EGF a longtemps été utilisé pour maintenir les cellules indifférenciées 29. Un cocktail d'EGF et FGF2 avec B27 a été utilisé précédemment pour les cheveux de la culture des cellules souches du follicule 27 et B27 est largement utilisé pour garder les cellules souches neurales dans la culture 30,31. Nous avons également mesuré auparavant les caractéristiques de viabilité et de taux de croissance de DESCs au sommet de la culture tissulaire en plastique et sur une variété de substrats ECM, et aucune différence n'a été détectée dans les taux de prolifération 19. Les cellules peuvent être maintenues pendant un maximum de 10 passages en série 19.
Nous utilisons les incisives inférieures pour cette procédure en raison de la facilité d'élimination par comparaison avec les incisives supérieures. Les étapes les plus importantes dans notre protocole au cours de l'isolement sont le retrait complet de la zone CL à partir de l'os mandibulaire avant de passer à la collagénase et une microdissection propre de la CL. Parce que l'incisive proximale est très délicate, il est important de ne pas l'endommager lors de la dissection, ce qui pourrait entraîner la perte de la labiale CL. Une élimination incomplète entraînera des restes de la labialCL et un rendement inférieur de DESCs. En outre, il est important d'éviter une contamination par des non-CL cellules épithéliales. Ainsi, après l'épithélium a été séparé du mesenchyme, une incision en forme de V propre doit être faite pour éliminer la CL labial de l'épithélium voisin. Enfin, il est essentiel pour plaquer ces cellules à une concentration de plus de 1 x 10 4 cellules par ml, et laisser la moitié du milieu conditionné pour le premier changement de support.
Le principal avantage de ce protocole pour la recherche dentaire est qu'il permet la production et la manipulation de DESCs in vitro efficace. Bien que l'incisive de la souris est établi comme un modèle in vivo 7-9,12,32-34, le développement d'un système in vitro avancer le domaine de la recherche dentaire en ouvrant les portes à des expériences qui sont difficiles à réaliser in vivo. Les avantages de ce système comprennent la capacité de manipuler facilement les cellules dans différentes conditions de culture, le ciblage facile des voies de signalisation simples ou même plusieurs, et l'inhibition ou l'activation de targeted utilisant des molécules de siRNA ou des facteurs de croissance. Les applications en aval de ce système in vitro comprennent l'utilisation des techniques énumérées ci-dessus ainsi que d'autres techniques de pointe pour réaliser des études fonctionnelles et / ou mécaniques, en particulier au niveau de la cellule unique.
Dans l'ensemble, les informations glanées DESC culture in vitro peut aider à démêler les complexités de renouvellement des dents à base de cellules souches.
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Disclosures
Les auteurs n'ont aucun conflit d'intérêt à divulguer.
Acknowledgments
Les auteurs remercient Xiu-Ping Wang pour une aide initiale avec des cultures de DESC. Les auteurs sont financés en partie par des bourses et des subventions des Instituts nationaux de la santé (K99-DE022059 à AHJ, K12-GM081266 à MGC, K08-DE022377-02 à OH, et R01-DE021420 à ODK).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Forceps, size 5 | Fine Science Tools | 11251-30 | FST by Dumont, Dumoxel |
| Forceps straight, fine, 3.5 | Roboz | RS5070 | |
| Razorblades | Electron Microscopy Services | #71960 | |
| Scalpel Handle No. 3 | VWR | ||
| Feather Blade No. 15 | Electron Microscopy Services | #72044-15 | Surgical Stainless Steel |
| Collagenase Type-1 filtered | Worthington Biochemical Corporation | #4214 | |
| Insulin syringe | BD | #329424 | |
| Accumax | EMD Millipore | #SCR006 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320-033 | |
| EGF | R&D | 2028-EG-200 | |
| FGF2 | R&D | 233-FB-025 | |
| B27 Supplement | Gibco | 10889-038 |
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