Summary
A preparação isolada de perfusão pulmonar de sangue faz com que seja possível visualizar redes microvasos na superfície do pulmão. Aqui nós descrevemos uma abordagem para quantificar a permeabilidade de microvasos de solteiro em pulmões isolados tempo real usando imagens de fluorescência.
Abstract
A preparação isolada de perfusão pulmonar com sangue é amplamente usado para visualizar e definir a sinalização em microvasos individuais. Juntando esta preparação com imagens em tempo real, torna-se viável para determinar alterações da permeabilidade em microvasos pulmonares individuais. Aqui nós descrevemos etapas para isolar pulmões de ratos e perfundem-los com sangue autólogo. Em seguida, descrevemos as etapas para infundir fluoróforos ou agentes através de um microcatheter em uma região de pulmão de pequenas. Utilizando estes procedimentos descritos, determinou-se o aumento da permeabilidade em microvasos de pulmão de rato em resposta a infusões de lipopolissacarídeo bacteriano. Os dados revelaram que lipopolissacarídeo aumento de fugas de fluido em ambos os segmentos venulares e microvasos capilar. Assim, este método faz com que seja possível comparar as respostas de permeabilidade entre os segmentos vasculares e, assim, definir qualquer heterogeneidade na resposta. Enquanto os métodos comumente utilizados para definir a permeabilidade pulmonar requerem pós-processamento de amostras de tecido do pulmão, ouso de imagens em tempo real elimina esta exigência, como é evidente a partir do presente método. Assim, a preparação de pulmão isolado combinado com a imagem em tempo real oferece várias vantagens em relação aos métodos tradicionais para determinar a permeabilidade microvascular pulmão, ainda é um método simples para desenvolver e implementar.
Introduction
O aumento da permeabilidade microvascular nos pulmões leva ao desenvolvimento de edema alveolar e troca gasosa comprometida e é uma das principais características da lesão pulmonar aguda (LPA) 1-3. Assim, estimativas da permeabilidade vascular são importante na definição do grau de lesão dos pulmões e a eficácia das intervenções terapêuticas propostas. Análise gravimétrica como proporção wet-a-seco de pulmão livre sangue e coeficiente de filtração microvascular são amplamente utilizados métodos para estimar a permeabilidade 4,5. Outros métodos incluem a quantificar a retenção de sondas radioactivas ou fluorescentes no tecido pulmonar 6-8. No entanto, os métodos descritos acima requerem processamento postexperiment de amostras de tecido do pulmão para elucidar os dados de permeabilidade. Além disso, uma vez que um animal pode ser usado somente para um único protocolo de tratamento, pode ser necessário um grande número de animais para o estudo completo. Uma característica comum dos métodos acima é que eles determinam a permeabilidade vascular significativo paratodos os vasos sanguíneos no interior da amostra de tecido. No entanto, é bem estabelecido que o micro e macro-vasos pulmonares são fenotipicamente diferente 9. Por isso, as respostas de permeabilidade pode ser heterogênea entre os diversos segmentos de navios, bem 9,10. Assim, a quantificação da permeabilidade média de todos os vasos pulmonares em uma amostra de tecido pode não refletir adequadamente esta heterogeneidade.
Na preparação isolada de perfusão pulmonar de sangue, dos vasos sanguíneos na superfície do pulmão podem ser visualizados por um microscópio vertical 4,11,12. Isto permite que caracterizam as respostas em vasos individuais e, assim, tratar qualquer heterogeneidade na resposta 13. Além disso, através da utilização de imagens de fluorescência de microvasos, ensaios de fluorescência com base pode ser incorporada. Além disso, um microcateter atrial esquerda pode ser utilizado para fornecer agentes e as sondas de fluorescência nos vasos sanguíneos 11,14. O microcatheter limita a entrega a uma região de pulmão de pequenas, assim, exposando apenas os vasos sanguíneos na região, para os agentes infundidos e fluoróforos. Isto permite que várias pequenas regiões dentro do mesmo pulmão a ser utilizado para experiências em separado, levando a uma redução global de animais necessários para um estudo.
Imagens em tempo real permite a captura de mudanças dinâmicas na vascular e fluorescência extravascular de microvasos individuais da preparação de pulmão isolado. Assim, para cada um dos microvasos dentro de um campo de imagem, as alterações na fluorescência durante a infusão de fluoróforos e washoff pode ser gravada, e quantificado desligada 14. Usando valores de fluorescência máximo e residual vascular, um índice de permeabilidade para cada microvasos no campo de imagem pode ser determinada. Para determinar as alterações de permeabilidade na resposta aos agentes inflamatórios ou prejudiciais, o agente desejado, pode ser administrado em primeiro lugar e, em seguida, o índice de permeabilidade determinada. Além disso, o campo de imagem pode ser colocado em qualquer lugar dentro da região do pulmão infundida pelamicrocatheter, permitindo assim um elevado grau de flexibilidade na escolha da rede vascular desejado. Assim, a preparação isolada de perfusão pulmonar com sangue em conjunto com imagens em tempo real fornece um modelo experimental atraente para quantificar permeabilidade em microvasos pulmonares individuais.
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Protocol
Todos os experimentos realizados em animais foram aprovados pelo Comitê da Universidade de Tennessee Health Science Center Animal Care Institucional e uso.
1. Tubulação de preparações perfusão Rat Lung
- Preparar um sistema de tubos com um tubo Tygon (# 18) para a perfusão de sangue como mostrado na Figura 1. Ligue transdutores de pressão (P23XL) e colocar o tubo na platina do microscópio.
- Ajustar a temperatura do banho de água a 37 ° C.
- Conecte a entrada e saída de pulmão temporariamente com Tygon tubulação.
Tubo de perfusão sanguínea Figura 1.. O esquema mostra a configuração tubulação utilizada para a circulação do sangue através da preparação de pulmão isolado. Também estão indicados os componentes associados, através do qual o tubo is roteado. Um diagrama esquemático do coração e pulmão está incluído para mostrar a sítios de ligação entre o tubo e da artéria pulmonar (PA), e atrial (LA) da cânula (azul linhas a tracejado) para a esquerda.
2. Preparação de isolado de rato Pulmões
- Anestesiar ratos machos (Sprague-Dawley; 250-300 g) com cetamina (80-100 mg / kg) e com xilazina (5-10 mg / kg). Depois de garantir um plano cirúrgico de anestesia, coloque o animal em decúbito dorsal.
- Realizar traqueostomia, inserir uma cânula traqueal (PE-90) e prenda com sutura cirúrgica.
- Infuse heparina (100-200 U) para o coração por punção cardíaca (21 G borboleta agulha), aguarde 60 segundos e sangue desangrar (~ 12-15 ml de sangue).
- Prepare duas cânulas (Tygon tubulação, 3 mm de diâmetro, 4 cm de comprimento; queimado em uma das extremidades) e encher com solução salina.
- Realize uma toracotomia. Faça uma incisão (3 mm) no ventrículo direito e deslize a extremidade alargada de uma cânula na incisão para a pulmonarartéria. Fixar a cânula da artéria pulmonar com suturas cirúrgicas.
- Inciso (3 mm) a ponta do ventrículo esquerdo e deslizar a extremidade alargada da segunda cânula para a incisão. Orientar a cânula no átrio esquerdo. Segura cânula no ventrículo esquerdo com uma fita umbilical (largura 2 mm).
- Dissecar qualquer tecido conjuntivo, e remover o pulmão e coração em conjunto com as cânulas anexas. Coloque pulmão e coração em uma placa de Petri. Reposicionar do pulmão de modo a que a superfície do diafragma está no topo. Os três cânulas deve enfrentar a mesma direção.
- Coloque a preparação de pulmão em uma fase que pode ser manipulado na direcção XY. Qualquer etapa que vem com um microscópio pode ser modificada para manter o tubo ou uma fase feito por encomenda construída, se necessário.
3. Perfusão sanguínea dos pulmões isolados de ratos
- Misture o sangue sangrados com uma solução de albumina de volume igual (5%) e adicionar ao reservatório. Inicie a bomba peristáltica e definir fluxo de rComeram a 14 ml / min. Deixar o sangue para encher o tubo.
- Com a derivação aberta, remova o conector de entrada-saída temporária de pulmão. Anexar a artéria pulmonar e da cânula do átrio esquerdo para a entrada e a saída do pulmão, respectivamente. Certifique-se de que não há bolhas de ar na tubulação.
- Ligue a cânula traqueal a um transdutor de pressão terceiro (P23XL). Encha os pulmões com 30% de oxigênio através da cânula traqueal e manter a pressão a 5 cm H 2 O.
- Feche a derivação com uma braçadeira para começar a perfusão pulmonar. Manter artéria pulmonar e das pressões do átrio esquerdo em ~ 10 e 3 cm H 2 O, respectivamente.
4. Preparando Lung para microvascular Infusion
- Levantar a extremidade traseira do tubo de extensão para o cateter acima do nível do pulmão e seguro.
- Preparar um cateter de infusão através da inserção de cerca de 30 cm de um tubo de PE10 40 cm de altura para um tubo de PE90 ~ 30 cm de comprimento. Ligar a extremidade exposta do tubo de PE10 de uma agulha (30 L) aapenso a uma seringa (1 cc).
- Inserir a combinação de cateter para a extremidade posterior saliente do tubo de extensão. Orientar a combinação cateter através do átrio esquerdo e no pulmão até encontrar resistência. Em seguida, empurre o cateter PE10 só mais para o pulmão até encontrar resistência. Note-se que a aplicação de força excessiva durante a inserção do cateter vai prejudicar o pulmão.
- Encha a seringa de 1 cc com solução de Ringer e anexar a uma bomba de seringa. Definir a taxa de infusão de 10 mL / min.
- Local da infusão vai tornar-se pálida em comparação com resto do pulmão.
- Umedeça o pulmão com soro fisiológico e cobrir o pulmão com filme plástico com um buraco grande o suficiente para deixar o local da infusão descoberto.
- Pincelar algumas gorduras torneira no fundo de um O-ring (feito por encomenda) e colocar uma lamela de vidro (# 1.5, diâmetro de 22 mm) na parte inferior do anel de vedação. Suavemente posicionar o anel de vedação com a lamela no local da infusão. Fixe o O-ring com um hol tubo de ensaio padrãoder. A combinação lamela / O-ring não distorce as estruturas alveolares debaixo dela, como relatado recentemente 15.
- Posicionar um objectivo (20X) de um microscópio de fluorescência acima do O-ring e focar na superfície do pulmão.
5. Imagem fluorescente Dextran trânsito através Microvasos
- Prepare o microscópio para FITC imagem florescimento.
- Selecione uma região a ser trabalhada e adquirir imagens a uma taxa de 1/minuto usando o software de aquisição de imagem.
- Comece a infusão de FITC-dextrano 20 kD (0,5 mg / ml) usando a bomba de seringa. Fluorescência nos vasos sanguíneos vai aumentar gradualmente e atingir um máximo. Continuar infusão por 60 minutos.
- Então mude para a infusão de Ringer para lavar fluorescência luminal. Manter a infusão de mais de 10 min. Continuar a aquisição de imagens em 1/min durante a lavagem-off.
6. Image Analysis
- Abra o arquivo de aquisição de imagem.
- Coloque regiõesde juros ao longo microvasos dentro da moldura da imagem.
- Jogue o arquivo de imagem frame-by-frame e registrar a intensidade de fluorescência em cada região de interesse para todos os quadros.
- Traça-se a alteração na intensidade da fluorescência para cada região de interesse, como uma função do tempo.
- Quantificar a intensidade máxima da fluorescência e da intensidade de fluorescência residual após 10 min de washoff.
- Calcula-se a razão entre a intensidade máxima de fluorescência residual em cada região de interesse para obter o índice de permeabilidade para os microvasos associados a essa região de interesse.
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Representative Results
Uma preparação isolada de perfusão pulmonar de sangue ligado ao sistema de perfusão e afins é mostrado na Figura 2. Para fins de demonstração, foi utilizado um rato Sprague Dawley, embora os procedimentos aqui descritos podem ser utilizados com qualquer espécie de rato. Infusões com um microcateter atrial esquerdo atingir apenas uma pequena região do pulmão. A região infundido pode ser identificado pela descoloração induzida por infusão (Figura 3). A preparação de pulmão como posicionada para a imagem em tempo real, é mostrado na Figura 4.
Figura 2. Isolado preparação de perfusão pulmonar com sangue. A fotografia mostra o pulmão de ratos isolados ligados ao sistema de perfusão e perfundidos com sangue autólogo. Note-se que a superfície do diafragma do pulmão enfrenta o microscope objetivo.
Região infusão Microcatheter Figura 3.. A microcathether inserido através do átrio esquerdo foi utilizado para infundir solução de Ringer na preparação de pulmão. A fotografia mostra a região do pulmão esquerdo (círculo) receberam infusão de Ringer. Como a infusão de Ringer desloca o sangue através dos vasos perfusão, a região infundida aparece pálida em comparação com as demais regiões do pulmão. Note-se que a infusão de Ringer é restrito a uma pequena região claramente demarcada do pulmão.
Posição de imagem Figura 4. Isolado para preparação de pulmão. O sho fotografiaws uma preparação de pulmão isolado posicionado sob um microscópio objetivo pronto para a imagem latente. Note-se que a superfície do pulmão está coberta com uma película de plástico para manter a superfície do pulmão húmido. Um anel tórico mantém a superfície horizontal do pulmão durante a imagiologia.
Neste estudo, determinou-se as alterações na permeabilidade vascular em resposta a tratamentos com o lipopolissacarídeo bacteriano (LPS; serotipo 0111: B4), um modelo amplamente usado do LPA. Para este, que infundida com LPS (100 ug / ml) em microvasos de 30 min, seguido de lavagem de Ringer durante 60 minutos 11. Em seguida, infundido FITC dextrano 20 kD, para quantificar o índice de permeabilidade. Residual fluorescência FITC foi baixa em microvasos tratados com Ringer, mas elevada em doentes tratados com LPS (Figuras 5A-D). Além disso, em comparação com a infusão de solução de Ringer, a infusão de LPS causou uma redução significativa no índice de permeabilidade, o que sugere um aumento global na permeabilidade em todos os recipientes dentro da imagem field (Figura 5E). O índice de permeabilidade quantificada separadamente para as vénulas e capilares sugere que o aumento de permeabilidade induzida por LPS foi menor do que em vénulas em capilares, embora a diferença não era significativa (Figura 5F).
Figura 5. LPS aumenta a permeabilidade vascular. Microvasos pulmonares foram tratadas quer com o de Ringer ou LPS (100 ng / ml) durante 30 min. Depois de 60 min, com FITC-dextrano 20 kD foi infundido seguido por lavagem de Ringer e as alterações de fluorescência capturada pela imagem de tempo real. Em seguida, o índice de permeabilidade de vasos sanguíneos na região tratada do pulmão foi determinada como a razão entre a fluorescência residual máxima para o dextrano FITC. AD) Imagens mostram máxima (A, C) e residual (B, D) de FITC fluorE) A infusão de LPS escence em Ringer's-(A, B) e tratados com LPS (C, D) microvasos pulmonares. diminuição do índice de permeabilidade significativamente em todos os segmentos dos vasos dentro do quadro da imagem. F) tratamento com LPS causou uma redução no índice de permeabilidade ambas as vênulas e capilares (* p <0,05 em relação ao controle de Ringer; repetido três vezes cada um, média ± SEM). Capilares (PAC) e vênulas (VEN) foram identificadas por dimensões do reservatório obtido uma imagem de campo claro capturado antes da infusão de FITC dextrano 20 kD a partir. As imagens mostradas são uma parte recortada de uma mM imagem Frame 850 x 850. n = número de navios.
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Discussion
A preparação isolada de perfusão pulmonar com sangue combinado com imagens em tempo real fornece uma ferramenta simples para a determinação de alterações de permeabilidade em microvasos pulmonares individuais. Aplicamos esse método para definir alterações de permeabilidade em resposta à infusão de LPS. Os nossos dados sugerem claramente que a infusão de LPS causou um aumento da permeabilidade microvascular. Além disso, os dados também indicam que as alterações de permeabilidade induzida por LPS foram similares em ambas as vénulas e capilares. Assim, uma importante vantagem desta técnica é a capacidade de definir leakiness de microvasos individuais, bem como uma rede mundial de navios. Dado que esta técnica também produz modificações de permeabilidade globais, é possível comparar estes valores com os valores obtidos usando outros métodos vulgarmente utilizados, tais como a análise gravimétrica. Assim, o presente método também permite a comparação de informações de vazamento de fluido microvascular com o relatado em outros estudos.
Em comparação com otécnicas mais amplamente utilizada para determinar as alterações da permeabilidade vascular, o método de imagem em tempo real com base não requer pós-processamento de amostras de tecido do pulmão. A medida de retenção fluoróforo é capturado durante a infusão e washoff subsequente do fluoróforo. Isto elimina claramente preservando as amostras de tecido e os erros associados com o seu manuseamento. Além de determinar a permeabilidade microvascular indivíduo através do índice de permeabilidade, o actual método facilita também a definição da magnitude do aumento da fluorescência do marcador, a natureza bifásica da taxa de variação da fluorescência do marcador, e a taxa de decaimento de fluorescência do marcador durante lave. Estes parâmetros adicionais podem ser utilizadas para comparar as respostas a diferentes tratamentos, bem como as diferenças inter-segmentais em microvasos, como descrito no nosso relatório anterior 14.
Temos procedimentos para determinar as alterações de permeabilidade aqui descritos em resposta a uma doença inflamatóriaagente entregue por infusão vascular. No entanto, é possível adaptar os procedimentos para determinar as alterações de permeabilidade para os agentes administrados por outras vias bem. Assim, já microvasos permeabilidade aumenta para ácido entregues por instilação alveolar 14 determinado.
Como é evidente a partir das fotografias dos pulmões, o método de entrega baseado microcateter restringe o produto entregue a uma pequena região do pulmão. Assim, através da manipulação do microcateter para diferentes regiões do pulmão, uma série de experiências pode ser conduzida no mesmo pulmão. Assim, este método tem um impacto significativo sobre o número de animais necessários para um estudo completo. Os dados deste e de outros estudos apresentados utilizaram infusões múltiplas no mesmo pulmão 4,11,12,14,16. Enquanto há diferenças nas respostas das diferentes regiões foram evidentes devido à possibilidade de recirculação dos agentes infundidos através do perfusato no presente estudo, essa possibilidade deve ser considered no projeto experimental. Assim, quando utilizando diferentes regiões do mesmo pulmão para experiências, pode ser benéfico para determinar se a permeabilidade da linha de base é semelhante para as diferentes regiões do pulmão.
O sucesso do presente método depende criticamente sobre a criação de uma preparação de pulmão bem perfundidos. A preparação de pulmão deve ser de cor uniforme, sem manchas vermelhas, o líquido que sai do tubo traqueal, vazamento de sangue, ou pressão arterial pulmonar elevada, os quais indicam um pulmão danificado. Além disso, deve ser tomado cuidado durante a inserção do microcathether para o pulmão, como forçar a inserção irá levar a punção vénula e dano do pulmão.
O presente método limita pulmão intacto visualização de vasos pleurais e subpleural, e, assim, permite que as estimativas de permeabilidade de apenas um subconjunto dos vasos pulmonares. Para visualização dos vasos profundos, dois fótons de imagem microscópica pode ser uma alternativa possível. Inseriríon da microcatheter via da esquerda atriais limites cânula infusões em vênulas e capilares no sentido retrógrado. Um caminho possível para anular esta limitação será para inserir o cateter através da cânula da artéria pulmonar. A única modificação necessária para este processo alternativo é o de ligar um tubo de extensão para o cateter no lado de entrada do pulmão.
Estes procedimentos foram desenvolvidos usando o pulmão de rato como modelo. No entanto, os mesmos passos, com algumas pequenas modificações podem ser usadas para determinar as alterações de permeabilidade na microvasos do pulmão do rato. Para as experiências de pulmão de rato, o agonista e traçador pode ser adicionado à solução de perfusão e permeabilidade quantificada como semelhante ao dos pulmões de ratos. Além disso, um marcador de fluorescência diferente pode ser substituído de acordo com as capacidades do microscópio do usuário. O tamanho da molécula de dextrano pode ser alterada dependendo da magnitude de aumento de permeabilidade induzida por agonista e deve ser decididabaseado em dados de experimentos iniciais. Assim, de modo geral a preparação isolada de pulmão, juntamente com imagens de fluorescência fornece uma ferramenta poderosa para determinar a permeabilidade dos vasos único em modelos animais padrão de ALI.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Os estudos foram apoiados pelo NIH HL75503 para KP.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tygon Tubing | Fisher Scientific | #18 | |
| Pressure Transducer | Data Sciences International | P23XL | Need quantity 3 |
| Butterfly Needle | Greiner Bio-One | 450081 | 21 G |
| Peristaltic pump | Cole Parmer | Masterflex L/S | |
| PE-90 tubing | Becton Dickinson | 427421 | 30 cm needed |
| PE-10 tubing | Becton Dickinson | 427401 | 40 cm needed |
| Syringe Pump | Braintree Scientific | BS8000 | |
| O-ring | Custom made with a 20 mm diamter hole and a handle to secure O-ring to holder | ||
| Upright fluorescence microscope | Olympus America | BX61WI | |
| Image Acquisition Software | Molecular Devices | Metamorph | |
| FITC Dextran 20KD | Sigma Aldrich | 0.5 mg/ml (A dextran of different molecular size can be selected, if trial experiments indicate its suitability based on the calculated permeability index values) | |
| Lipopolysaccharide | Sigma Aldrich | Serotype 0111:B4 |
References
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