마우스 배아 줄기 세포에서 신경 조직 공학을위한 폴리의 전기 방사 섬유 발판 (글리세롤 dodecanedioate)

전기 방사는 마이크로 - 투 - 나노 사이즈 섬유 지지체를 생산하는 효과적인 가공 방법의 하나이다. 전기 방사의 기본 원리는, 바늘의 팁과 컬렉터 접지 사이의 높은 전압을인가함으로써, 바늘의 구멍에 유지되어 용액의 테일러 콘을 포함한다. 용액의 정전 반발이 표면 장력을 극복 할 때, 충전 된 유체 제트는 니들 팁 밖으로 배출되고, 용매 증발과 공기를 통해 이동하고, 마지막으로 접지 콜렉터 상에 증착된다. 주사기 펌프은 방적 돌기로부터 나오는 용액의 연속적인 흐름을 제공하고, 전기 방사 섬유 이렇게 여러 사본은 단시간 내에 제조 될 수있다. 집 전체에 도착하는 방사 구금을 떠나는 과정에서 청구 제트는 고분자 용액의 점도 및 표면 장력을 포함 파라미터 electrostati의 개수에 따라 스트레칭 및 채찍 겪을 것이다C의 용액에서 시행하고, 외부 전계의 상호 작용 ^등이.

전기 방사 공정에서, 콜렉터는 마이크로에 나노 섬유가 증착 될 수있는 전도성 기판으로서 역할을한다. 본 연구에서는 섬유 컬렉터의 새로운 유형을 원하는 크기 (길이 x 폭)와 섬유 매트를 얻을 수 있도록 설계되었습니다. 전통적으로, 알루미늄 박을 집 전체로서 사용하지만, 다른 기판에 평면에서 섬유를 전송하는 것은 곤란하다. 전통적인 집에서 그대로 섬유 매트 수확의 어려움으로 인해 전기 방사 섬유가 콜렉터의 표면에 강하게 부착 사실을 주로했다. 따라서 직사각형 스트립으로 알루미늄 호일 조각을 접는 편평한 금속판에 수직하게 연결하여 집 전체를 변경됨. 전기 방사 섬유 스트립의 끝과 쉽게 다른 substrat로 전송할 수 금속판 사이의 영역에 걸쳐 확장된다전자.

열 가교 탄성 중합체에 대한 관심이 급격히 폴리 (글리세롤 세바 케이트) (PGS) 2002 년 ³ 가황 고무와 유사하다. PGS 유사 폴리 에스테르를 도입 로버트 랭거의 그룹의 선구적인 작업의 성장, 우리가 성공적으로 개발된다 폴리 (글리세롤 도데) (PGD) 글리세롤과 도데 산의 열 축합하고 독특한 형상 기억 특성 ^1을 보여 주었다. 딱딱한 합성 물질 폴리 (히드 부티레이트) 또는 폴리 (L-락 타이드) (각각 250 MPA는 660 MPA는,의 영률)와 달리, PGD는 온도가 37 ° 이상 1.08 MPa의 영률과, 고무와 같은 탄성 특성을 나타내고 원위치 말초 신경 (0.45 MPA는)에 가까운 일치 C,. 또, PGD는 생분해 성이며, 분해 시간은 글리세롤 및 도데 칸 이산의 비율을 변화시킴으로써 미세하게 조정될 수있다. 도데 칸 이산이 열두 카본 서브입니다두 터미널 카르 복실 그룹, HOOC (CH _{2) 10} COOH와 자세. 세바 신산 및 도데 칸 이산 같은 짝수 디카 르 복실 산 아실-CoA는 아세틸 및 트리 카르 복실 산 (TCA) / (구연산)주기를 입력 대사 될 수있다. 디카 르 복실 산의 대사 생성물, 숙시 닐-CoA를는 gluconeogenetic 전구체와 TCA 사이클 ^(4)의 중간이다. 따라서, 일부 연구들은 특히 병적 상태에서 장내 및 비경 구 영양에 대한 대체 연료 기질로서 이용 될 수 있다고 제안했다. 유리 전이 온도가 31 ° C이므로, PGD, 따라서 실온에서 체온에서 별개의 기계적 특성을 나타낸다, 독특한 형상 기억 성을 나타낸다. 요컨대, PGD는 신경 조직과 유사한 기계적 성질을 가진 독특한 탄성 특성을 나타내는, 생분해 성 생체 적합성; 따라서 신경 조직 공학 응용 프로그램에 적합한 소재입니다. 이 프로토콜에서, 전기 방사큰 예금 영역에 걸친 긴 섬유는 PGD에서 새로 디자인 된 컬렉터를 통해 제작되었다. 섬유 지지체는 마우스 pluripotent 줄기 세포의 성장과 분화를 지원할 수 있습니다.

1. 전기 방사 수집기 설치

1. 사각형 조각으로 알루미늄 호일을 잘라.
2. 직사각형의 스트립에 사각형 조각을 접어 테이프로 평평한 금속판 (그림 1)에 수직으로 장착. 주 : 섬유 매트의 사이즈는 스트립의 길이 및 폭에 따라 다르다. 필요에 따라서, 스트립의 크기는 조정될 수있다.

2. 고분자 용액의 제조

1. PGD​​ 폴리머를 얻기 위해 100 시간 동안 120 ° C에서 비커 1:1 몰비 글리세롤과 도데 산 (DDA)를 섞는다.
2. 15 ML 튜브에 1.5:3:95.5의 중량 비율로 65 % 에탄올에 폴리 (에틸렌 옥사이드) (PEO)와 젤라틴을 녹여 뚜껑을 강화하고 교반하면서 1 시간 동안 60 ° C의 오븐에서 혼합물을 가열 그것은 균일 용액 (기초 용액)이 될 때까지.
3. 전기 방사를 들어, PGD 중합체 4:6 중량비 기저 용액을 혼합한다. 참고 : PGD 농도는 양이G 섬유 직경에 효과. 30 % -50 %의 퍼센트 PGD는 더 이상 증가 된 섬유 직경 5cm 이상의 섬유를 생산할 좋다.
4. 고분자 용액에 0.1 % 리보플라빈을 넣고 잘 섞는다.

3. 전기 방사

1. 18 G에 5 ㎖의 표준 주사기로 폴리머 솔루션을 공급 스테인리스 바늘을 무디게.
2. 주사기 펌프에 주사기를 삽입합니다.
3. 금속판과 바늘 양전하 리드에 고전압 전원의 접지 리드를 부착.
4. 15cm에 바늘과 알루미늄 호일 지구 사이의 거리를 조정합니다.
5. 스트립의 전면에 섬유의 응집을 방지하기 위해 수평으로 약 15 °의 각도에서 주사기 펌프를 배치.
6. 주사기 펌프의 전원을 켜고 0.6 ㎖ / 시간에 펌프의 유량을 조정합니다.
7. 높은 전압의 전원을 켜고 14.6 kV의에 동작 전압을 설정합니다.

4.섬유 처리

1. 수집이 완료된 후, 가교, 60 분 동안 UV 광에 섬유 매트를 노출.
2. 100mm 페트리 접시에 알루미늄 호일 스트립으로부터 섬유 매트를 이동 및 살균을 또 다른 20 분 동안 UV 광에 노출.
3. 생물 안전 캐비닛에서 수술 블레이드와 동일한 크기의 원형 조각으로 섬유 매트를 잘라 24 - 웰 플레이트에 조각을 배치합니다.
4. 휴대 미리 파종 처리를 위해, 인산염 완충 생리 식염수 (PBS)의 1 ml의 섬유 샘플을 담가 하룻밤 37 ° C에서 알을 품다.
5. 다음 날, 대기음 PBS는주의 깊게, 각 웰 (재료 테이블의 레시피 참조) 분화 배지 1 ㎖ (DMEM/F12, N2, 및 FGF2)를 추가하고 3 시간 동안 37 ° C에서 알을 품다.
6. 기음 차별화 매체주의 깊게 각 섬유 샘플 리겔 0.2 mL를 넣고 30 분 동안 37 ° C에서 알을 품다. 참고 : 라미닌 또한 섬유 코팅에 사용될 수있다. 20 ㎍ / ml의 라​​미닌의 0.2 ML을 추가섬유 및 3 시간 동안 실온에서 배양한다.
7. 조심스럽게 각 우물에서 초과 리​​겔를 제거합니다. 한 번 분화 배지 2 ㎖로 씻어. 참고 : 섬유 샘플은 세포 배양을위한 준비가되어 있습니다.

섬유에 5. 셀 시드

1. MES 세포 배양 접시에 Accutase 1 mL를 넣고 37 ℃에서 10 분 동안 배양
2. 10 분 후, MES 세포는 배양 접시에서 분리됩니다. 플레이트에 차별화 매체의 4 ML을 추가합니다. 식민지 (약 15 배)을 휴식을 위아래로 15 ML 튜브 및 피펫 세포에 떠있는 MES 세포를 수집합니다.
3. 분화 배지 4 ㎖에 5 분 후 다시 중단 세포 400 XG에 원심 분리기.
4. 혈구를 사용하여 세포를 카운트. 15 ML 튜브에 세포 현탁액 200 μl를 전송하고 차별화 매체와 그것을 10 배 희석. 장소에 커버 슬립과 혈구에 챔버에 희석 세포 현탁액의 15 μl를 전송합니다. 계산1mm의 중앙 광장과 현미경으로 혈구의 네 모서리의 사각형에있는 세포. 참고 : ㎖를 희석 계수 × 10 ⁴ × 평방 당 평균 수를 = 셀 당
5. 각 웰에 약 5 × ⁴ MES 세포를 놓습니다. 천천히 섬유 매트를 물기로부터 용액을 방지하기 위해, 대신에 웰의 측면으로 미끄러 져 건, 섬유 샘플들의 중간에 세포 현탁액을 드롭.
6. 물론 각각 차별화 매체의 1 ML을 추가하고, 37 ° C에서 인큐베이터에서 접시를 유지하고 5 % CO ₂ 세포 부착, 성장 및 분화를 허용 할 수 있습니다.
7. 또한 각에서 기존 매체를 대기음 매일 신선한 분화 배지 1 ㎖로 대체합니다.

6. 세포 생존

1. 각 우물에서 기존 매체를 대기음.
2. 문화 매체와 레사 주린 형광 시약의 1 / 10 ^{번째 볼륨을} 혼합하고 각 웰에 1 ㎖를 추가합니다.
3. Incub37 ° C와 직사광선으로부터 보호 4 시간, 5 %의 CO _2를 먹었다.
4. 4 시간 후, 96 - 웰 플레이트에 각 웰로부터 시약 100 μL 3X를 전송 한 다음 샘플 560EX nm/590EM 필터 설정을 사용하여 형광 분광 광도계로 측정 할 준비가되었다.

7. 리얼 타임 PCR

1. 배양 14 일 후, 샘플을 용해 버퍼를 추가하고 섬유 샘플의 세포로부터 전체 RNA를 분리.
2. 역전사 20 ㎕의 반응 비늘의 cDNA를 합성하는 총 RNA의 4 μl를 사용합니다.
3. 10 ㎕의 마스터 믹스 (2 배), 0.2 ㎕의 염료, 8 μL의 nuclease가없는 물, 1 μL의 cDNA를, 1 μL 프라이머 (본 연구에서 사용 된 프라이머는 표 1에 나열되어 있습니다) : 각각의 광 튜브에 PCR 반응 혼합물을 준비합니다.
4. : PCR 프로그램을 설정합니다. 95 ° C의 2시 20분 분, 1주기 나. 95 ° C 3 초 → 60 ° C에서 1 분, 40주기 다. 95 ° C 15 초, 1주기 D. 60 ° C에서 1분, 1 사이클 전자. 95 ° C 15 초, 1주기. 상대적인 유전자 발현 수준을 결정하기 위해 비교 C _{T 방식을} 선택한다.
5. PCR이 완료되면, StepOne 소프트웨어로 실시간 PCR 결과를 분석하고 Excel로 결과를 보냅니다.

전기 방사의 주요 구성 요소는도 1에 나타낸다. 대형 섬유 매트는 일반적으로 수직으로 부착 된 알루미늄 호일 스트립 및 편평한 금속판을 얻었다.도 2는 콜렉터 설계 및 전기 방사 섬유 매트를 나타낸다. 폭과 길이는 서로 다른 애플리케이션에 조정될 수있다. PGD​​ 중합체 및 기저 혼합 용액으로 만든 섬유의 길이는 10cm까지이다. 전기 방사 된 섬유의 형태는도 3에 도시된다. 40 % PGD 농도로 만든 섬유의 직경이 마이크로 미터 범위이다. 섬유에 3, 6 일간 배양 MES 세포에서 파생 된 분화 된 세포의 공 초점 현미경 이미지는 그림 4에 나타내었다. 녹색 형광 신호가 세포에서 녹색 형광 단백질 (GFP)의 과발현에서왔다. 도 5 레사 주린 형광 시약의 결과는 MES 세포가 성장할 것으로 보여N 리겔과 라미닌과 PGD 섬유 코팅에 해당하는 세포 생존 능력이 있고 코팅되지 않은 그룹에 비해 상대적으로 높은 확산을했다. 만능 줄기 세포와 신경 세포 마커의 유전자 발현 (그림 6) 실시간 PCR에 의해 정량 하였다. 세포의 소수 민족이 신경 줄기 세포가 PAX6와 네 스틴을 표시 표현하면서 섬유에서 배양 MES 세포의 대부분은 다 능성 마커 OCT4, Nanog를하고 SOX2를 표명했다. 2 주 동안 배양 한 후 섬유에 성장 MES 증가 등 MAP2 DCX와 같은 신경 세포 마크의 발현 수준뿐만 아니라 희소 돌기 아교 세포 마커 Oligo1 및 성상 세포 마커 GFAP를 보였다.

그림 1. 설정으로 전기. 고분자 용액이 무딘 바늘에서 배출됩니다. 고전압 전원 경내 편평한 금속판ND 알루미늄 호일 스트립은 그 사이에 마이크로 나노 미터 섬유 (블루)에 증착된다.

도 2. 수집기 디자인 및 전기 방사 섬유 매트. 섬유 매트의 너비와 길이는 쉽게 알루미늄 호일 스트립의 크기를 조정함으로써 변경 될 수있다. 이 매트 폭에는 제한이 없으며, 긴 섬유는 최대 10 ㎝ 길이 될 수 있습니다.

PGD의 전기 방사 및 기초 솔루션 4:6 그림 3. SEM 이미지 (W / W). 섬유의 평균 직경은 약 2 μm의 수 있습니다. PGD​​ 농도가 30 %로 감소 할 때, 섬유의 평균 직경이 나노 미터 범위에 빠진다. 흰색스케일 바는 10 μm의를 나타냅니다.

그림 4. 섬유에 대한 차별화 된 MES 세포의 공 초점 현미경 이미지. 자외선 범위에 푸른 빛에 노출되었을 때 GFP는 밝은 녹색의 형광을 전시 운반하는 세포. 6 일에 녹색 형광 세포 수의 증가는 섬유 지지체가 세포 부착 및 증식을 지원할 수 있음을 나타냅니다. 흰색 스케일 바는 100 μm의를 나타냅니다. (주 3 일 6).

도 5. PGD의 1로 마트 리겔과 라미닌으로 코팅 섬유, 3, 및 오일에 MES 세포의 세포 생존율에 레사 주린 fluore 의해 결정된내려와 시약. 셀 제어 (p <0.05)로서 사용 코팅 섬유에 배양 하였다.

그림 6. PGD 섬유에 대한 차별화 된 MES 세포에서 유전자 발현의 QRT-PCR 분석. 이주 후 분명 신경 세포 마커는 발판에 MES 세포가 신경 세포로 분화 한 것을 보여 주었다.

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.