마우스 배아 줄기 세포에서 신경 조직 공학을위한 폴리의 전기 방사 섬유 발판 (글리세롤 dodecanedioate)

이 절차는 폴리 글리세롤 도트 카노 8이라는 새로운 생분해성 폴리머로부터 전기로 방적된 긴 섬유를 제작합니다. 먼저 새로 설계된 집진기를 설정하고 주사기와 펌프를 사용하여 전기 방사를 위한 고분자 용액을 준비한 다음 용액을 집진기에 전달합니다. 그런 다음 생성된 섬유 매트를 가교를 위해 배양 접시로 옮깁니다.

다음으로 절단된 섬유에 마우스 배아 줄기 세포를 파종합니다. 궁극적으로, 결과는 쥐 배아 줄기 세포가 살아남아 섬유 골격의 신경 세포로 분화할 수 있음을 입증할 수 있습니다. 오늘 영상에서는 syn cells 제작에서 생체 재료를 준비하는 방법과 최종적으로 세포 배양을 위해 전기 스팬 섬유를 사용하는 방법을 보여주었습니다.

특히 우리가 폴리 및 염색 세포에서 파생 된 세포와 결합 할 때. 그들은 세포 전달과 모든 기능 조직을 만들기 위해 미래에 매우 중요한 응용 프로그램을 가질 수 있습니다. 티슈는 오늘 그녀가 당신을 위해 끔찍한 절차를 시연 할 것이라고 보이지 않습니다.

그녀는 내 실험실에서 가장 위대한 존재입니다. 알루미늄 호일을 직사각형 조각으로 자릅니다. 직사각형 조각을 직사각형 스트립으로 접고 테이프로 평평한 금속판에 수직으로 부착합니다.

스트립의 길이는 고분자 용액에 필요한 섬유 매트의 크기에 따라 다릅니다. 글리세롤을 혼합하고 데칸 디산을 섭씨 120도에서 100 시간 동안 1 대 1 몰 비율로 수행합니다. 폴리 글리세롤을 얻으려면 디카 노라 중합체가 15 밀리리터 튜브에 1.5-3-95.5의 중량 비율로 폴리에틸렌 옥사이드와 젤라틴을 65 % 에탄올에 용해시킵니다.

뚜껑을 조이고 혼합물을 섭씨 60도의 오븐에서 1시간 동안 가열하고 기초 용액이 균일해질 때까지 15분마다 저어줍니다. 전기 방사의 경우 PGD 폴리머와 기저 용액을 혼합합니다. 4-6 중량 비율로 혼합물에 0.1 % 리보플라빈을 첨가하고 잘 섞습니다.

고분자 용액을 18게이지의 무딘 스테인리스강 바늘이 있는 5ml 표준 주사기에 넣습니다. 그런 다음 주사기를 주사기 펌프에 삽입합니다. 높은 볼륨의 접지된 리드를 연결하십시오.tage 전원은 금속판에 연결하고 양전하를 띤 리드는 바늘에 연결합니다.

또한 바늘과 알루미늄 호일 사이의 거리를 조정하십시오. 15cm로 스트립합니다. 이제 주사기 펌프를 수평과 약 15도 각도로 배치하여 스트립 전면에 있는 섬유의 응집을 방지합니다.

주사기 펌프를 켜고 펌프의 유량을 시간당 0.6밀리리터로 조정합니다. 고전압 전원을 켜고 작동 전압을 14.6킬로볼트로 설정합니다. 수집이 완료된 후 섬유 매트를 자외선에 노출시켜 60분 동안 가

알루미늄 호일 스트립의 섬유 매트를 100mm 페트리 접시로 옮깁니다. 파이버 매트를 수술용 블레이드와 같은 크기의 둥근 조각으로 자르고 조각을 24웰 플레이트에 넣습니다. 그런 다음 플레이트를 자외선에 노출시켜 치료 전 세포를 위해 20분 동안 더 살균합니다.

섬유 샘플을 1ml의 인산염 완충 식염수에 담그고 다음 날 밤새 섭씨 37도에서 배양합니다. PBS를 신중하게 흡인합니다. 각 웰에 1ml의 분화 배지를 추가하고 섭씨 37도에서 3시간 동안 배양합니다.

분화 배지를 흡인시킨 후 각 섬유 샘플에 0.2ml의 마트리 겔을 조심스럽게 첨가하고 섭씨 37도에서 30분 동안 배양합니다. 각각에서 여분의 마트리 젤을 조심스럽게 제거합니다. 2 밀리리터의 분화 배지로 한 번 헹굽니다.

10분 후, 섭씨 37도의 마우스 배아 줄기 세포 배양 접시에 1ml의 tase를 추가합니다. MES 세포가 분리되면 4ml의 분화 배지를 추가합니다. 부유 MES 세포를 15ml 튜브 원심분리기에 400Gs로 5분 동안 수집합니다.

펠릿화된 세포를 4ml의 분화로 다시 현탁시킵니다. 보통. 200마이크로리터의 세포 현탁액을 15ml 튜브로 옮기고 10가지 부피의 분화를 추가합니다. 보통. 15마이크로리터의 희석된 세포 현탁액을 혈구 분석기의 챔버로 옮깁니다.

커버 슬립을 제자리에 놓고 혈구 분석기의 1mm 중앙 정사각형과 4개의 모서리 정사각형에 있는 세포를 계산합니다. 이제 5 번 10에서 4 번째로 드롭합니다. 마우스 ES 세포를 섬유 샘플의 중앙으로 천천히 이동합니다.

각 웰에 1ml의 분화 배지를 추가하고 섭씨 37도에서 배양하고 세포 부착을 위해 5% 이산화탄소를 배양합니다. 성장과 차별화. 격일로 1ml의 분화 배지를 보충하십시오.

세포 생존율을 측정하려면 각 웰에서 기존 배지를 흡인하고 배양에 1/10 희석 abre 및 형광 시약 1ml를 추가합니다. 배지는 섭씨 37도에서 5% 이산화탄소에서 4시간 동안 직사광선으로부터 보호합니다. 그런 다음 각 웰에서 100마이크로리터의 삼중 샘플을 96웰 플레이트로 옮기고 형광 주사 전자 현미경 이미지를 측정하여 전기 방적 섬유의 형태를 평가하는 데 사용했습니다.

40%PGD 농도로 만들어진 이 섬유의 직경은 여기에서 마이크로미터 범위에 있습니다. 분화된 마우스 배아 줄기세포를 섬유에서 3일 동안 배양하고 컨포칼 현미경을 사용하여 과도하게 발현된 녹색 형광 단백질을 시각화했습니다. 6일째에 녹색 형광 세포의 수가 증가한 것은 섬유 골격이 세포 접착과 세포 증식을 모두 지원할 수 있음을 나타냅니다.

Zu 및 형광 측정은 마트리겔과 라미닌으로 코팅하면 세포 생존율이 동등하고 상대적으로 더 높은 증식을 가져온다는 것을 보여주었습니다. Flury potency 및 신경 세포 마커는 첫날에 real-time PCR로 정량화되었습니다. 섬유에서 배양된 MES 세포의 대다수는 다능성 마커를 발현했습니다.

OCT 4 나노 및 SOX 2. 작은 부분 집합은 신경 줄기 세포 마커 PAC 6 및 neston을 발현했습니다. 배양 2주 후, 맵 2 및 DCX, 희소돌기아교세포 마커 올리고 1 및 성상세포 마커와 같은 일부 신경 세포 마커의 발현 수준이 증가했습니다.

GFAP 한 번 마스터했습니다. 이 기술은 제대로 수행되면 2-3시간 안에 완료할 수 있습니다.