Name: 마우스 배아 줄기 세포에서 신경 조직 공학을위한 폴리의 전기 방사 섬유 발판 (글리세롤 dodecanedioate) (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 3 s
Description: 배우세요 생분해성 폴리머 PGD를 이용한 전기방사 섬유 제작법과 마우스 배아 줄기 세포 배양 기술을. 이 방법은 신경 세포로의 분화를 지원하여 조직 공학 및 재생 의학 연구에 활용됩니다.

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이 작품은 플로리다 국제 대학의 생명 공학 부서의 기능을 사용하여 실시 하였다.

1. 전기 방사 수집기 설치 <ol><li> 사각형 조각으로 알루미늄 호일을 잘라. </li><li> 직사각형의 스트립에 사각형 조각을 접어 테이프로 평평한 금속판 (그림 1)에 수직으로 장착. 주 : 섬유 매트의 사이즈는 스트립의 길이 및 폭에 따라 다르다. 필요에 따라서, 스트립의 크기는 조정될 수있다. </li></ol> 2. 고분자 용액의 제조 <ol><li> PGD​​ 폴리머를 얻기 위해 100 시간 동안 120 ° C에서 비커 1:1 몰비 글리세롤과 도데 산 (DDA)를 섞는다. </li><li> 15 ML 튜브에 1.5:3:95.5의 중량 비율로 65 % 에탄올에 폴리 (에틸렌 옥사이드) (PEO)와 젤라틴을 녹여 뚜껑을 강화하고 교반하면서 1 시간 동안 60 ° C의 오븐에서 혼합물을 가열 그것은 균일 용액 (기초 용액)이 될 때까지. </li><li> 전기 방사를 들어, PGD 중합체 4:6 중량비 기저 용액을 혼합한다. 참고 : PGD 농도는 양이G 섬유 직경에 효과. 30 % -50 %의 퍼센트 PGD는 더 이상 증가 된 섬유 직경 5cm 이상의 섬유를 생산할 좋다. </li><li> 고분자 용액에 0.1 % 리보플라빈을 넣고 잘 섞는다. </li></ol> 3. 전기 방사 <ol><li> 18 G에 5 ㎖의 표준 주사기로 폴리머 솔루션을 공급 스테인리스 바늘을 무디게. </li><li> 주사기 펌프에 주사기를 삽입합니다. </li><li> 금속판과 바늘 양전하 리드에 고전압 전원의 접지 리드를 부착. </li><li> 15cm에 바늘과 알루미늄 호일 지구 사이의 거리를 조정합니다. </li><li> 스트립의 전면에 섬유의 응집을 방지하기 위해 수평으로 약 15 °의 각도에서 주사기 펌프를 배치. </li><li> 주사기 펌프의 전원을 켜고 0.6 ㎖ / 시간에 펌프의 유량을 조정합니다. </li><li> 높은 전압의 전원을 켜고 14.6 kV의에 동작 전압을 설정합니다. </li></ol> 4.섬유 처리 <ol><li> 수집이 완료된 후, 가교, 60 분 동안 UV 광에 섬유 매트를 노출. </li><li> 100mm 페트리 접시에 알루미늄 호일 스트립으로부터 섬유 매트를 이동 및 살균을 또 다른 20 분 동안 UV 광에 노출. </li><li> 생물 안전 캐비닛에서 수술 블레이드와 동일한 크기의 원형 조각으로 섬유 매트를 잘라 24 - 웰 플레이트에 조각을 배치합니다. </li><li> 휴대 미리 파종 처리를 위해, 인산염 완충 생리 식염수 (PBS)의 1 ml의 섬유 샘플을 담가 하룻밤 37 ° C에서 알을 품다. </li><li> 다음 날, 대기음 PBS는주의 깊게, 각 웰 (재료 테이블의 레시피 참조) 분화 배지 1 ㎖ (DMEM/F12, N2, 및 FGF2)를 추가하고 3 시간 동안 37 ° C에서 알을 품다. </li><li> 기음 차별화 매체주의 깊게 각 섬유 샘플 리겔 0.2 mL를 넣고 30 분 동안 37 ° C에서 알을 품다. 참고 : 라미닌 또한 섬유 코팅에 사용될 수있다. 20 ㎍ / ml의 라​​미닌의 0.2 ML을 추가섬유 및 3 시간 동안 실온에서 배양한다. </li><li> 조심스럽게 각 우물에서 초과 리​​겔를 제거합니다. 한 번 분화 배지 2 ㎖로 씻어. 참고 : 섬유 샘플은 세포 배양을위한 준비가되어 있습니다. </li></ol> 섬유에 5. 셀 시드 <ol><li> MES 세포 배양 접시에 Accutase 1 mL를 넣고 37 ℃에서 10 분 동안 배양 </li><li> 10 분 후, MES 세포는 배양 접시에서 분리됩니다. 플레이트에 차별화 매체의 4 ML을 추가합니다. 식민지 (약 15 배)을 휴식을 위아래로 15 ML 튜브 및 피펫 세포에 떠있는 MES 세포를 수집합니다. </li><li> 분화 배지 4 ㎖에 5 분 후 다시 중단 세포 400 XG에 원심 분리기. </li><li> 혈구를 사용하여 세포를 카운트. 15 ML 튜브에 세포 현탁액 200 μl를 전송하고 차별화 매체와 그것을 10 배 희석. 장소에 커버 슬립과 혈구에 챔버에 희석 세포 현탁액의 15 μl를 전송합니다. 계산1mm의 중앙 광장과 현미경으로 혈구의 네 모서리의 사각형에있는 세포. 참고 : ㎖를 희석 계수 × 10 4 × 평방 당 평균 수를 = 셀 당 </li><li> 각 웰에 약 5 × 4 MES 세포를 놓습니다. 천천히 섬유 매트를 물기로부터 용액을 방지하기 위해, 대신에 웰의 측면으로 미끄러 져 건, 섬유 샘플들의 중간에 세포 현탁액을 드롭. </li><li> 물론 각각 차별화 매체의 1 ML을 추가하고, 37 ° C에서 인큐베이터에서 접시를 유지하고 5 % CO 2 세포 부착, 성장 및 분화를 허용 할 수 있습니다. </li><li> 또한 각에서 기존 매체를 대기음 매일 신선한 분화 배지 1 ㎖로 대체합니다. </li></ol> 6. 세포 생존 <ol><li> 각 우물에서 기존 매체를 대기음. </li><li> 문화 매체와 레사 주린 형광 시약의 1 / 10 번째 볼륨을 혼합하고 각 웰에 1 ㎖를 추가합니다. </li><li> Incub37 ° C와 직사광선으로부터 보호 4 시간, 5 %의 CO 2를 먹었다. </li><li> 4 시간 후, 96 - 웰 플레이트에 각 웰로부터 시약 100 μL 3X를 전송 한 다음 샘플 560EX nm/590EM 필터 설정을 사용하여 형광 분광 광도계로 측정 할 준비가되었다. </li></ol> 7. 리얼 타임 PCR <ol><li> 배양 14 일 후, 샘플을 용해 버퍼를 추가하고 섬유 샘플의 세포로부터 전체 RNA를 분리. </li><li> 역전사 20 ㎕의 반응 비늘의 cDNA를 합성하는 총 RNA의 4 μl를 사용합니다. </li><li> 10 ㎕의 마스터 믹스 (2 배), 0.2 ㎕의 염료, 8 μL의 nuclease가없는 물, 1 μL의 cDNA를, 1 μL 프라이머 (본 연구에서 사용 된 프라이머는 표 1에 나열되어 있습니다) : 각각의 광 튜브에 PCR 반응 혼합물을 준비합니다. </li><li> : PCR 프로그램을 설정합니다. 95 ° C의 2시 20분 분, 1주기 나. 95 ° C 3 초 → 60 ° C에서 1 분, 40주기 다. 95 ° C 15 초, 1주기 D. 60 ° C에서 1분, 1 사이클 전자. 95 ° C 15 초, 1주기. 상대적인 유전자 발현 수준을 결정하기 위해 비교 C T 방식을 선택한다. </li><li> PCR이 완료되면, StepOne 소프트웨어로 실시간 PCR 결과를 분석하고 Excel로 결과를 보냅니다. </li></ol>

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</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

간단한 수집 또는 현재 일부 응용 프로그램에 대해 원하는 길이와 섬유 매트의 크기를 획득하는 제한을 증가 전기 방사에 사용되는 수집 회전의 복잡성의 제한. 또한, 배양 접시 또는 다른 기판에 접지 집에서 섬유를 전송하는 것은 도전이다 5. 이 보고서에서, 접지 된 집에 알루미늄 호일 스트립을 부착하여 간단하게 만든 새로운 디자인의 집은, 한 번에 20cm에서 10cm로 대형 섬유 매트를 얻을 수 있었다. 1과 2는 설계 회로도 설정을 도시 10cm 제어 매트 폭이 긴 전기 방사 섬유까지의 제조. 니들 팁과 컬렉터 사이의 전계의 영향으로 전기 방사 섬유는 쉽게 다른들로 전송 될 수있는 부드러운 섬유 매트를 형성하고, 알루미늄 호일 스트립 및 접지 콜렉터 사이의 영역을 가로 질러 뻗어 있었다ubstrate. 전기 방사 섬유는 세포가 다리와 진정한 입체 환경에서 여러 섬유에 부착 할 수 있도록 다공성 섬유 구조를 제공합니다. 이 연구에서 생성 된 섬유 ...

전기 방사는 마이크로 - 투 - 나노 사이즈 섬유 지지체를 생산하는 효과적인 가공 방법의 하나이다. 전기 방사의 기본 원리는, 바늘의 팁과 컬렉터 접지 사이의 높은 전압을인가함으로써, 바늘의 구멍에 유지되어 용액의 테일러 콘을 포함한다. 용액의 정전 반발이 표면 장력을 극복 할 때, 충전 된 유체 제트는 니들 팁 밖으로 배출되고, 용매 증발과 공기를 통해 이동하고, 마지막으로 접지 콜렉터 상에 증착된다. 주사기 펌프은 방적 돌기로부터 나오는 용액의 연속적인 흐름을 제공하고, 전기 방사 섬유 이렇게 여러 사본은 단시간 내에 제조 될 수있다. 집 전체에 도착하는 방사 구금을 떠나는 과정에서 청구 제트는 고분자 용액의 점도 및 표면 장력을 포함 파라미터 electrostati의 개수에 따라 스트레칭 및 채찍 겪을 것이다C의 용액에서 시행하고, 외부 전계의 상호 작용 등이. 전기 방사 공정에서, 콜렉터는 마이크로에 나노 섬유가 증착 될 수있는 전도성 기판으로서 역할을한다. 본 연구에서는 섬유 컬렉터의 새로운 유형을 원하는 크기 (길이 x 폭)와 섬유 매트를 얻을 수 있도록 설계되었습니다. 전통적으로, 알루미늄 박을 집 전체로서 사용하지만, 다른 기판에 평면에서 섬유를 전송하는 것은 곤란하다. 전통적인 집에서 그대로 섬유 매트 수확의 어려움으로 인해 전기 방사 섬유가 콜렉터의 표면에 강하게 부착 사실을 주로했다. 따라서 직사각형 스트립으로 알루미늄 호일 조각을 접는 편평한 금속판에 수직하게 연결하여 집 전체를 변경됨. 전기 방사 섬유 스트립의 끝과 쉽게 다른 substrat로 전송할 수 금속판 사이의 영역에 걸쳐 확장된다전자. 열 가교 탄성 중합체에 대한 관심이 급격히 폴리 (글리세롤 세바 케이트) (PGS) 2002 년 3 가황 고무와 유사하다. PGS 유사 폴리 에스테르를 도입 로버트 랭거의 그룹의 선구적인 작업의 성장, 우리가 성공적으로 개발된다 폴리 (글리세롤 도데) (PGD) 글리세롤과 도데 산의 열 축합하고 독특한 형상 기억 특성 1을 보여 주었다. 딱딱한 합성 물질 폴리 (히드 부티레이트) 또는 폴리 (L-락 타이드) (각각 250 MPA는 660 MPA는,의 영률)와 달리, PGD는 온도가 37 ° 이상 1.08 MPa의 영률과, 고무와 같은 탄성 특성을 나타내고 원위치 말초 신경 (0.45 MPA는)에 가까운 일치 C,. 또, PGD는 생분해 성이며, 분해 시간은 글리세롤 및 도데 칸 이산의 비율을 변화시킴으로써 미세하게 조정될 수있다. 도데 칸 이산이 열두 카본 서브입니다두 터미널 카르 복실 그룹, HOOC (CH 2) 10 COOH와 자세. 세바 신산 및 도데 칸 이산 같은 짝수 디카 르 복실 산 아실-CoA는 아세틸 및 트리 카르 복실 산 (TCA) / (구연산)주기를 입력 대사 될 수있다. 디카 르 복실 산의 대사 생성물, 숙시 닐-CoA를는 gluconeogenetic 전구체와 TCA 사이클 (4)의 중간이다. 따라서, 일부 연구들은 특히 병적 상태에서 장내 및 비경 구 영양에 대한 대체 연료 기질로서 이용 될 수 있다고 제안했다. 유리 전이 온도가 31 ° C이므로, PGD, 따라서 실온에서 체온에서 별개의 기계적 특성을 나타낸다, 독특한 형상 기억 성을 나타낸다. 요컨대, PGD는 신경 조직과 유사한 기계적 성질을 가진 독특한 탄성 특성을 나타내는, 생분해 성 생체 적합성; 따라서 신경 조직 공학 응용 프로그램에 적합한 소재입니다. 이 프로토콜에서, 전기 방사큰 예금 영역에 걸친 긴 섬유는 PGD에서 새로 디자인 된 컬렉터를 통해 제작되었다. 섬유 지지체는 마우스 pluripotent 줄기 세포의 성장과 분화를 지원할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>글리세롤</td><td>: 시그마 - 알드리치</td><td>G7757</td><td></td></tr><tr><td>도데 칸 디오 산</td><td>: 시그마 - 알드리치</td><td>D1009</td><td></td></tr><tr><td>젤라틴</td><td>: 시그마 - 알드리치</td><td>D1890</td><td></td></tr><tr><td>폴리 (에틸렌 옥사이드) (PEO)</td> <td>시그마 - 알드리치</td><td>182028</td><td></td></tr><tr><td>리보플라빈</td><td>시그마 - 알드리치</td><td>132350250</td><td>0.10 %</td></tr> <tr><td>마우스 배아 줄기 세포</td><td>GlobalStem</td><td>GSC-5002</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Becton Dickinson</td><td>356234</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30272.02</td><td></td></tr><tr><td>N2 보충제</td><td>Invitrogen</td><td>17502048</td><td>1%</td></tr><tr><td>FGF2</td><td>Stemgent</td><td>03-0002</td><td>10 ng/ml</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Invitrogen</td><td>A11105-01</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate buffered Saline (PBS)</td><td>Invitrogen</td><td>10010-031</td><td></td></tr><tr><td>Resazurin 형광 염료</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>62758-13-8</td><td></td></tr><tr><td>SV 총 RNA 분리 시스템</td><td>Promega</td><td>Z3100</td><td></td></tr><tr><td>GoScript 역전사 시스템</td><td>Promega</td><td>A5000</td><td></td></tr><tr><td>GoTaq qPCR 마스터 믹스</td><td>Promega</td><td>A6001</td><td></td></tr><tr><td>주사기 펌프&nbsp;</td><td>Fisher scientific</td><td>14-831-200</td><td></td></tr><tr><td>고전압 전원&nbsp;</td><td>Spellman High Voltage Electronics Corporation</td><td></td><td>SL30</td></tr><tr><td>UV 광선</td><td>Philips</td><td>308643</td><td>15W/G15T8</td></tr><tr><td>Synergy HT 다중 모드 마이크로플레이트 리더</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Perkin Elmer GeneAmp PCR 시스템 9600</td><td>Perkin Elmer</td><td>8488</td><td></td></tr><tr><td>StepOne Real-time PCR 시스템</td><td>Applied Biosystems</td><td>4376357</td><td></td></tr></tbody></table>

마우스 배아 줄기 세포에서 신경 조직 공학을위한 폴리의 전기 방사 섬유 발판 (글리세롤 dodecanedioate)

Electrospun Fibrous Scaffolds of Poly(glycerol-dodecanedioate) for Engineering Neural Tissues From Mouse Embryonic Stem Cells

조직 공학 응용 프로그램의 경우, 생분해 성 및 생체 적합성 지지체의 제조가 가장 바람직하지만, 어려운 작업입니다. 다양한 제조 방법 중에서, 전기 방사는 단순함과 기능성으로 인해 가장 큰 매력입니다. 또한, 전기 방사 나노 섬유는 세포의 생존 및 성장에 대한 추가적인 지원을 보장 천연 세포 외 매트릭스의 크기를 모방. 이 연구는 전기 방사를위한 새로 디자인 컬렉터를 사용하여 폴리 (글리세롤 도데)라는 이름의 새로운 생분해 성 및 생체 적합성 고분자에 대한보다 큰 예금 영역 (PGD) 1 걸친 긴 섬유의 제조의 가능성을 보여 주었다. PGD​​는 따라서 신경 조직 공학 응용 프로그램에 적합합니다, 신경 조직과 유사한 기계적 성질을 가진 독특한 탄성 특성을 나타낸다. 섬유상 비계 재료를 만들기위한 합성 및 제조 셋업이 간단하고 재현성이 높은, 저렴이었다. 생체 적합성의테스트, 마우스 배아 줄기 세포에서 파생 된 세포에 부착하고 전기 방사 PGD 섬유에 성장 수 있습니다. 요약하면,이 프로토콜은 마우스 배아 줄기 세포 유래의 신경 계통 세포의 성장을 지원하기 위해 PGD의 전기 방사 섬유를 제조하기위한 다양한 제조 방법을 제공 하였다.

전기 방사의 주요 구성 요소는도 1에 나타낸다. 대형 섬유 매트는 일반적으로 수직으로 부착 된 알루미늄 호일 스트립 및 편평한 금속판을 얻었다.도 2는 콜렉터 설계 및 전기 방사 섬유 매트를 나타낸다. 폭과 길이는 서로 다른 애플리케이션에 조정될 수있다. PGD​​ 중합체 및 기저 혼합 용액으로 만든 섬유의 길이는 10cm까지이다. 전기 방사 된 섬유의 형태는도 3에 도시된다. 40 % PGD 농도로 만든 섬유의 직경이 마이크로 미터 범위이다. 섬유에 3, 6 일간 배양 MES 세포에서 파생 된 분화 된 세포의 공 초점 현미경 이미지는 그림 4에 나타내었다. 녹색 형광 신호가 세포에서 녹색 형광 단백질 (GFP)의 과발현에서왔다. 도 5 레사 주린 형광 시약의 결과는 MES 세포가 성장할 것으로 보여N 리겔과 라미닌과 PGD 섬유 코팅에 해당하는 세포 생존 능력이 있고 코팅되지...

폴리 (글리세롤 도데)라는 이름의 새로운 생분해 성 고분자에서 새로운 디자인의 컬렉터를 통해 더 큰 예금 영역에 걸쳐 전기 방사 장 섬유 (PGD)의 합성 및 제조가보고되었다. 마우스 섬유는 다 능성 줄기 세포로부터 유도 된 세포의 성장을지지 할 수 있었다.

For tissue engineering applications, the preparation of biodegradable and biocompatible scaffolds is the most desirable but challenging task. &#160;Among ...

이 절차는 폴리 글리세롤 도트 카노 8이라는 새로운 생분해성 폴리머로부터 전기로 방적된 긴 섬유를 제작합니다. 먼저 새로 설계된 집진기를 설정하고 주사기와 펌프를 사용하여 전기 방사를 위한 고분자 용액을 준비한 다음 용액을 집진기에 전달합니다. 그런 다음 생성된 섬유 매트를 가교를 위해 배양 접시로 옮깁니다.다음으로 절단된 섬유에 마우스 배아 줄기 세포를 파종합니다. 궁극적으로, 결과는 쥐 배아 줄기 세포가 살아남아 섬유 골격의 신경 세포로 분화할 수 있음을 입증할 수 있습니다. 오늘 영상에서는 syn cells 제작에서 생체 재료를 준비하는 방법과 최종적으로 세포 배양을 위해 전기 스팬 섬유를 사용하는 방법을 보여주었습니다.특히 우리가 폴리 및 염색 세포에서 파생 된 세포와 결합 할 때. 그들은 세포 전달과 모든 기능 조직을 만들기 위해 미래에 매우 중요한 응용 프로그램을 가질 수 있습니다. 티슈는 오늘 그녀가 당신을 위해 끔찍한 절차를 시연 할 것이라고 보이지 않습니다.그녀는 내 실험실에서 가장 위대한 존재입니다. 알루미늄 호일을 직사각형 조각으로 자릅니다. 직사각형 조각을 직사각형 스트립으로 접고 테이프로 평평한 금속판에 수직으로 부착합니다.스트립의 길이는 고분자 용액에 필요한 섬유 매트의 크기에 따라 다릅니다. 글리세롤을 혼합하고 데칸 디산을 섭씨 120도에서 100 시간 동안 1 대 1 몰 비율로 수행합니다. 폴리 글리세롤을 얻으려면 디카 노라 중합체가 15 밀리리터 튜브에 1.5-3-95.5의 중량 비율로 폴리에틸렌 옥사이드와 젤라틴을 65 % 에탄올에 용해시킵니다.뚜껑을 조이고 혼합물을 섭씨 60도의 오븐에서 1시간 동안 가열하고 기초 용액이 균일해질 때까지 15분마다 저어줍니다. 전기 방사의 경우 PGD 폴리머와 기저 용액을 혼합합니다. 4-6 중량 비율로 혼합물에 0.1 % 리보플라빈을 첨가하고 잘 섞습니다.고분자 용액을 18게이지의 무딘 스테인리스강 바늘이 있는 5ml 표준 주사기에 넣습니다. 그런 다음 주사기를 주사기 펌프에 삽입합니다. 높은 볼륨의 접지된 리드를 연결하십시오.tage 전원은 금속판에 연결하고 양전하를 띤 리드는 바늘에 연결합니다.또한 바늘과 알루미늄 호일 사이의 거리를 조정하십시오. 15cm로 스트립합니다. 이제 주사기 펌프를 수평과 약 15도 각도로 배치하여 스트립 전면에 있는 섬유의 응집을 방지합니다.주사기 펌프를 켜고 펌프의 유량을 시간당 0.6밀리리터로 조정합니다. 고전압 전원을 켜고 작동 전압을 14.6킬로볼트로 설정합니다. 수집이 완료된 후 섬유 매트를 자외선에 노출시켜 60분 동안 가교합니다.알루미늄 호일 스트립의 섬유 매트를 100mm 페트리 접시로 옮깁니다. 파이버 매트를 수술용 블레이드와 같은 크기의 둥근 조각으로 자르고 조각을 24웰 플레이트에 넣습니다. 그런 다음 플레이트를 자외선에 노출시켜 치료 전 세포를 위해 20분 동안 더 살균합니다.섬유 샘플을 1ml의 인산염 완충 식염수에 담그고 다음 날 밤새 섭씨 37도에서 배양합니다. PBS를 신중하게 흡인합니다. 각 웰에 1ml의 분화 배지를 추가하고 섭씨 37도에서 3시간 동안 배양합니다.분화 배지를 흡인시킨 후 각 섬유 샘플에 0.2ml의 마트리 겔을 조심스럽게 첨가하고 섭씨 37도에서 30분 동안 배양합니다. 각각에서 여분의 마트리 젤을 조심스럽게 제거합니다. 2 밀리리터의 분화 배지로 한 번 헹굽니다.10분 후, 섭씨 37도의 마우스 배아 줄기 세포 배양 접시에 1ml의 tase를 추가합니다. MES 세포가 분리되면 4ml의 분화 배지를 추가합니다. 부유 MES 세포를 15ml 튜브 원심분리기에 400Gs로 5분 동안 수집합니다.펠릿화된 세포를 4ml의 분화로 다시 현탁시킵니다. 보통. 200마이크로리터의 세포 현탁액을 15ml 튜브로 옮기고 10가지 부피의 분화를 추가합니다. 보통. 15마이크로리터의 희석된 세포 현탁액을 혈구 분석기의 챔버로 옮깁니다.커버 슬립을 제자리에 놓고 혈구 분석기의 1mm 중앙 정사각형과 4개의 모서리 정사각형에 있는 세포를 계산합니다. 이제 5 번 10에서 4 번째로 드롭합니다. 마우스 ES 세포를 섬유 샘플의 중앙으로 천천히 이동합니다.각 웰에 1ml의 분화 배지를 추가하고 섭씨 37도에서 배양하고 세포 부착을 위해 5% 이산화탄소를 배양합니다. 성장과 차별화. 격일로 1ml의 분화 배지를 보충하십시오.세포 생존율을 측정하려면 각 웰에서 기존 배지를 흡인하고 배양에 1/10 희석 abre 및 형광 시약 1ml를 추가합니다. 배지는 섭씨 37도에서 5% 이산화탄소에서 4시간 동안 직사광선으로부터 보호합니다. 그런 다음 각 웰에서 100마이크로리터의 삼중 샘플을 96웰 플레이트로 옮기고 형광 주사 전자 현미경 이미지를 측정하여 전기 방적 섬유의 형태를 평가하는 데 사용했습니다.40%PGD 농도로 만들어진 이 섬유의 직경은 여기에서 마이크로미터 범위에 있습니다. 분화된 마우스 배아 줄기세포를 섬유에서 3일 동안 배양하고 컨포칼 현미경을 사용하여 과도하게 발현된 녹색 형광 단백질을 시각화했습니다. 6일째에 녹색 형광 세포의 수가 증가한 것은 섬유 골격이 세포 접착과 세포 증식을 모두 지원할 수 있음을 나타냅니다.Zu 및 형광 측정은 마트리겔과 라미닌으로 코팅하면 세포 생존율이 동등하고 상대적으로 더 높은 증식을 가져온다는 것을 보여주었습니다. Flury potency 및 신경 세포 마커는 첫날에 real-time PCR로 정량화되었습니다. 섬유에서 배양된 MES 세포의 대다수는 다능성 마커를 발현했습니다.OCT 4 나노 및 SOX 2. 작은 부분 집합은 신경 줄기 세포 마커 PAC 6 및 neston을 발현했습니다. 배양 2주 후, 맵 2 및 DCX, 희소돌기아교세포 마커 올리고 1 및 성상세포 마커와 같은 일부 신경 세포 마커의 발현 수준이 증가했습니다.GFAP 한 번 마스터했습니다. 이 기술은 제대로 수행되면 2-3시간 안에 완료할 수 있습니다.

electrospun-fibrous-scaffolds-poly-glycerol-dodecanedioate-for

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

조직 공학 및 세포 배양을위한 폴리머를 electrospinning의 과정은이 문서에서 해결되었습니다. 특히 photopatterning 멀티 고분자 electrospinning의 추가 처리 능력과 photoreactive macromers의 electrospinning이 설명되어 있습니다.

조직 공학 및 세포 배양을위한 섬유 고분자의 공사장 공중 발판을 Electrospinning

정렬 electrospun 섬유는 체외에서 뉴런의 성장을 직접 신경 재생 공사장 공중 발판의 잠재적인 구성 요소입니다. 우리는 electrospun 섬유 기판 및 기본 쥐 E15 감각 (DRG)와 모터 뉴런의 혈청이없는 문화를 준비 절차를 설명합니다. immunocytochemistry에 의해 뉴런의 시각화도 포함되어 있습니다.

차 모터 및 Electrospun 폴리 - L - lactide Nanofiber 공사장 공중 발판을에 정의된 미디어 감각 뉴런의 문화

이 작품은 세부 3D 섬유소의 준비 culturing 및 plutipotent 줄기 세포를 구별을 위해 공사장 공중 발판. 이러한 공사장 공중 발판이 아니라 약물 전달 시스템을 포함하도록 수정으로 줄기 세포의 행동에 대한 다양한 생물 학적 화합물의 효과를 차단하는 데 사용할 수 있습니다.

3D 섬유소의 준비는 줄기 세포 배양 용도 공사장 공중 발판

여기서 우리는 자기 조립 3 차원 비계 문화에 인간 신경 전구 세포의 사용을 설명합니다. 우리는 유동세포계측법에 의해 연속적 예 분석하는 공사장 공중 발판에서 세포를 릴리스하는 프로토콜을 제시한다. 이 프로토콜은 상세한 mechanistically 연구를 수행하는 다른 세포 유형에 맞게 수 있습니다.

3 차원 자기 조립 펩티드 히드로겔에서 인간 신경 전구 세포의 배양

Electrospun의 공사장 공중 발판은 조직 공학 응용 프로그램을위한 포스트 프로덕션을 처리할 수 있습니다. 여기 불임 (무균 생산 또는 멸균 포스트 생산)을 달성하기 위해하고 적절한 biomechanical 속성을 달성위한 두꺼운 공사장 공중 발판을 (멀티 layering이 열을 사용하거나 증기가 풀림으로) 제작을 위해, 복잡한 공사장 공중 발판을 (연속 회전으로) 회전하는 방법을 설명합니다.

조직 공학을위한 Electrospun의 Fibres의 Postproduction 처리

이 프로토콜은 전기 방사와 마이크로 스피어를 결합하여 뉴런을 지시하는 조직 공학 골격을 개발합니다. 신경 성장 인자는 PLGA 미세구 내에 캡슐화되어 히알루론산(HA) 섬유 골격으로 전기 방사되었습니다.  단백질 생체 활성은 기본 병아리 Dorsal Root Ganglia를 골격에 파종하고 4-6일 동안 배양하여 테스트했습니다.

섬유 공사장 공중 발판으로 마이크로 스피어를 해제 전기 방사의 성장 인자

여기서 우리는 섬유의 계조 조직과 전기 방사 나노 섬유 지지체를 제작하고 세포 형태 / 방향을 조절하는 응용 프로그램을 탐구하는 프로토콜을 제시한다. 나노 섬유 지지체의 물리 화학적 특성에 관한 그라디언트는 생물 의학 분야에서 다양한 응용 프로그램을 제공합니다.

섬유 조직의 그라데이션으로 전기 방사 나노 섬유 공사장 공중 발판

뇌의 복잡한 행동에 대한 통찰력을 얻으려면 고급 연구 도구가 필요합니다. 여기에서 우리는 뇌와 유사한 구조를 닮은 신경 조직의 새로운 실크-콜라겐 기반 3D 엔지니어링 모델을 보여줍니다. 이 모델은 뉴런 네트워크 조립, 축삭 유도, 세포-세포 상호 작용 및 전기 활동을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

편광 신경 조직의 엔지니어링 3D 실크 콜라겐 기반 모델

여기, 우리는 쥐의 3D 문화에 대 한 프로토콜 이다, microglia, 및 oligodendrocytes를 포함 하 여 두뇌 파생 명과 셀을 제시. 1 차 세포 배양, methacrylated 히 알루 론 산 (하 마) 하이드로 겔 합성, HAMAphoto 중 합 및 셀 캡슐화 및 샘플 공초점 레이저 스캐닝 전자 현미경 이미징 처리 설명 합니다.

생체 외에서 Neuroinflammation의 모델링에 대 한 기본 Glial 세포의 3 차원 하이드로 겔 문화 개선

이 프로토콜 설명 줄기 세포 생체 외에서 전기 자극 및 줄기 세포 시드 비 계를 사용 하 여 후속 vivo에서 이식에 대 한 비 전도성 고분자 계에서의 시드 수 있도록 셀 문화 시스템의 제조를 최소 침 습 기법입니다.

변조 및 줄기 세포를 제공 하는 전기 전도성 비 계

배우세요 생분해성 폴리머 PGD를 이용한 전기방사 섬유 제작법과 마우스 배아 줄기 세포 배양 기술을. 이 방법은 신경 세포로의 분화를 지원하여 조직 공학 및 재생 의학 연구에 활용됩니다.

마우스 배아 줄기 세포에서 신경 조직 공학을위한 폴리의 전기 방사 섬유 발판 (글리세롤 dodecanedioate)

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