방법 논문

마우스에있는 자기 공명 현미경 영상으로 실험자가 면역 심근염에있는 심장의 이상 유무 비 침습적 평가

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DOI:

10.3791/51654

⸱

2014년 6월 20일

 ,  ,  ,  ,  , 
1School of Veterinary Medicine and Biomedical Sciences, University of Nebraska-Lincoln, 2Department of Biological Systems Engineering, University of Nebraska-Lincoln

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

이 연구는 자가면역 심근염에 걸린 쥐의 심장 이상을 평가하기 위한 비침습적 도구로서 자기 공명 현미경 이미징의 성공적인 확립을 보여줍니다. 이 데이터는 이 기술이 살아있는 동물의 질병 진행을 모니터링하는 데 사용될 수 있음을 나타냅니다.

초록

심근염 심근의 염증이지만, 질병의 그러한 영향 쇼 임상 증상 만 ~ 10 %. 심근 손상의 면역 이벤트를 연구하기 위해, 심근염의 다양한 마우스 모델이 널리 사용되어왔다. 이 연구는 심장 마이 오신 중쇄 (Myhc)-α A / J 생쥐에서 334-352로 유발 된 면역 심근염 (EAM)를 포함; 영향을받는 동물은 림프 구성 심근염을 개발하지만 뚜렷한 임상 증상과 함께. 이 모델에서, 비 침습 양상으로 자기 공명 현미경 (MRM)의 유틸리티가 표시됩니다 Myhc-α 334-352으로 예방 접종을 동물의 심장 구조 및 기능 변화를 확인합니다. EAM 건강한 마우스는 9.4 T (400 메가 헤르츠) 4cm 노래기 무선 주파수 이미징 프로브와 100 G / cm 트리플 축 그라데이션을 갖춘 89mm 수직 코어 구멍 스캐너를 사용하여 몇 군데 있었다. 심장 이미지는 애니보기 구배 에코 기반 시네 펄스 시퀀스를 사용하여 마취 된 동물로부터 취득하고 있었다LS는 호흡과 맥박 산소 측정기에 의해 감시했다. 분석은 건강한 쥐에 비해 심실의 내부 직경에 상응하는 감소로, EAM 마우스의 심실 벽의 두께 증가를 공개했다. 데이터는 염증이 마음에 형태 학적 및 기능적 변화는 살아있는 동물에서 비 침습적 모니터링 MRM으로 할 수있는 것이 좋습니다. 결론적으로, MRM은 진행과 회귀 병원체에 의한 질병에 심근 부상뿐만 아니라 치료에 반응을 평가하는 이점을 제공한다.

서론

심장 마비가 사망의 주요 원인이며, 심근염 젊은 청소년 1 심장 마비의 하나의 주된 원인이다. 심근염으로 영향을받는 대부분의 환자는 증상이 남아 있고 질병은 저절로 2 해결됩니다. 그러나, 영향을받는 사람들의 10 ~ 20 %는 확장 성 심근증 (DCM) 3로 이어지는, 만성 질환을 개발할 수 있습니다. 다양한 동물 모델은 심근염의 면역 기전을 연구하기 위해 개발되었다. 질병은 심장 마이 오신 중쇄 (Myhc)-α 또는 immunodominant 펩티드 조각 또는 콕 사키 바이러스의 B3 4-9와 같은 병원체 감염에 의해 동물을 면역에 의해 심근염에 민감한 A / J와의 Balb / C 마우스에서 유도 할 수있다. 이 연구는 A / J 생쥐 334-352 유도 심근염을 Myhc가-α 포함한다. 심근 침입을 보여주는에도 불구하고, 심근염 영향을받는 동물은 임상 적으로 정상 표시; 진단은 염증 7에 대한 마음의 조직 학적 평가를 기반으로ND 심 초음파 10.

자기 공명 현미경 (MRM)을 분 혈관의 레벨 (최대 10 μm의 직경)에 기능적 세부의 평가를 허용하는, 고해상도 입체 평면 심혈관 이미징을 얻기 위해 일반적으로 사용되는 방법이지만, 해상력이 수준은 해상도는 일반적으로 1mm 11-14까지 수득되는 루틴 자기 공명 영상 (MRI) 스캔 절차로 달성하지. 이 질병 과정 (14)의 초기 시점에 성능 파라미터를 도출하는 것도 고해상도 이미지의 획득을 허용하는 상태로 MRM는 이점을 제공한다. 임상 적으로, MRM 영상은 광범위하게 병에 걸린 심장, 폐, 뇌 15-17의 기능 매개 변수를 연구에 적용하고있다. 본 연구에서는 면역 심근염으로 영향을받는 A / J 생쥐의 심장 이상을 확인할 수있는 비 침습적 인 도구로 MRM 기술의 사용이 표시됩니다. 특히, T그는 MRM 영상은 허용 등 합리적인 정확도 (18)와 좌심실 이완 기말 용적 및 박출계수 (EF) 등의 기능 매개 변수의 정량화. 각 파라미터의 정의는 : LV 단부 이완기 볼륨 이완기 사이클의 끝에서 좌심실에서 혈액의 양 및 박출계수, 행정 용적 / 이완 기말 볼륨. 데이터 분석은 자기 공명 스캐너 (19)에 의해 취득 처리 DICOM 호환 심장 혈관 이미지를 위해 개발 된 자유롭게 사용할 세그먼트 소프트웨어를 사용하여 수행됩니다. 데이터는 건강한 쥐에서 이러한 기능 매개 변수와 비교하여, 좌심실 이완 기말 용적, 뇌졸중 볼륨과 구혈률의 감소에 해당하는 myocarditic 동물의 좌심실 벽의 두께 증가를 공개했다.

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프로토콜

윤리 선언문 :

모든 동물의 절차는 실험 동물의 관리 및 사용에 대한 지침에 따라 실시 및 네브래스카 링컨, 링컨, 네브래스카의 대학에 의해 승인되었습니다.

실험자가 면역 심근염 1. 유도

  1. 이 mg/1.5 ml의 최종 농도 1X 인산 완충 식염수에 Myhc-α 334-352 용해시켜 펩티드 용액을 준비한다.
  2. 50 NG / μL의 스톡 농도를 구하는 동결 건조 PT 50 μg을 함유하는 바이알에 무균 1X PBS 1 ㎖를 첨가하여, 백일해 독소 (PT)을 준비한다. 멸균 1.5 ML 튜브에 주식의 20 μl를 타고 1 NG / μL의 작업 농도를 얻기 위해 멸균 1X PBS 980 μl를 추가합니다.
  3. 결핵균 H37Rv 40 밀리그램을 추가하여 완전한 프로 인트 보조제 (CFA)를 준비 (MTB)의 최종 농도를 얻기 위해 CFA 10 ㎖로 추출5 ㎎ / ㎖.
  4. 펩티드-CFA 에멀젼을 준비합니다. 참고 : EAM 유도를 들어, 펩티드 CFA 에멀젼 Myhc-α 동물 당 334-352의 100 μg을 함유하는 150 ㎕를 투여했다. 예를 들어, 열 마우스 Myhc-α 334-352 1 ㎎을 함유하는 펩티드-CFA 에멀젼의 1.5 ML를 사용하여 면역합니다.
    1. 에멀젼의 1.5 ML를 준비하려면, 나누어지는 750 개의 1.5 ML 튜브에 334-352 펩타이드 솔루션을 Myhc가-α의 μL 및 CFA는 또 다른 1.5 ML 튜브에 MTB 보충. 3 ㎖의 루어-LOK 주사기를 사용하여, CFA / MTB 엑기스이어서 제 펩티드 용액을 그린다.
    2. 3 방향 꼭지에 주사기를 연결하고 빈 3 ML의 주사기에 꼭지의 다른 콘센트에 연결합니다. 그래서 펩타이드 CFA 혼합물을 합리적으로 좋은 저항과 다른 하나의 주사기에서 흘러 크레인의 개통을 조정합니다.
    3. ~ 1 분 동안 반복하여 다른 하나의 주사기에서 내용을 추진 한 다음 2 ~ 3 분 동안 얼음에 전체 어셈블리를 배치하여 혼합. 이 과정을 반복합니다10 배의 절차에 최소.
    4. 주의 깊게 100 ㎖ 유리 비커에 아직도 물에 작은 방울을 배치하여 에멀젼의 일관성을 확인합니다. 방울은 물에 분산 할 것으로 예상되지 않습니다. 만약 그렇다면, 원하는 농도가 달성 될 때까지 계속 혼합한다.
    5. 1 mL의 주사기와 마개에 부착 된 두 개의 3-ML 주사기 중 하나를 교체하여 1 ㎖ 루어 코리아 주사기로 3 ㎖ 주사기에서 에멀젼의 내용을 전송하고 1 ML의 주사기에 27 ½ G 바늘을 연결합니다.
  5. 6 년에서 8 주 된 여성 A / J 마우스 (~ 75 μL 각)의 두 사타구니 지역에 분할 복용 피하에있는 펩티드-CFA 에멀젼 150 μl를 주입한다.
  6. 0 일 및 2 일 postimmunization에 복강 내 각 동물에 PT 서스펜션 (100 NG)의 100 μl를 관리 할 수​​ 있습니다.
  7. 피하 t의 양쪽에 분할 복용 펩타이드 CFA 에멀젼 150 μl를 투여하여 7 일째에 예방 접종 절차를 반복그는 흉골 (~ 75 μL 각). 신선한 등의 이상이 에멀젼을 준비합니다. 그 후, 21 일에, MRM 영상에 동물을 대상 3 단계를 참조하십시오.

2. 동물 취급

  1. 따뜻함을 유지하기 위해 아래에 배치 된 가열 패드 2 % 이소 플루 란 - 공기 혼합물을 포함하는 마취 유도 챔버 각 마우스를 배치하고 특별히 디자인 된 동물 홀더 (그림 1)에 동물을 전송합니다.
  2. 동물 홀더에 발생하기 쉬운 위치에 동물을 무력화 그래서 주둥이는 마취 (그림 1)를 유지하기 위해 코 콘에 맞는. 마우스의 앞니에 부착 된 물린 바로 마우스의 머리를 고정합니다.
  3. 실험 기간 동안 동물의 체온을 유지하기 위해 스캐너의 수직 구멍에 삽입의 출구 호스에 공기를 불어 히터의 전원을 켭니다.
  4. 촬상 전체 세션 동안 2 ㎖ / 분의 유속으로 0.5 내지 2 %의 이소 플루 란으로 마취를 유지한다. 확인발가락 핀치 방법을 사용하여 마취, 아무 움직임이 예상.
  5. 압축 공기를 넣은 베개 센서, 마우스 꼬리 / 발목 광섬유 맥박 산소 센서, 각각 호흡, 심장 박동과 체온, (그림 1)를 모니터링하는 직장 온도 프로브를 설정합니다. 참고 : 심장 게이팅이 동맥혈 산소 포화도의 비 침습적 모니터링을 허용 맥박 산소 측정기를 통해 수행된다. 산소 포화도 센서는 좌측 발목에 부착되어야하고, 다리 실 루프로 고정하고 센서의 발목을 유지하기 위해 녹화한다. MRM 촬상 어떤 조영제를 사용하지 않고 호흡과 심장 신호를 게이팅함으로써 달성된다.

3. 이미지 획득

  1. 동물 (도 1)를 제조 한 후, 자기장의 균질성이 최대가 시야 (FOV)의 중앙에 위치 마음 MRM 스캐너의 중심에 마우스를 배치. 참고 : 와이드 보어(89mm) 트리플 100 G / cm의 축 그라디언트 및 4cm의 무선 주파수 (RF) 촬상 코일 탑재 9.4 T 수직 보어 자석 고해상도 3 차원 (3D) 이미지를 얻기 위해 사용한다. 주 : MRI 스캐너를 사용하는 경우 비자로 제공해야합니다.
  2. 영상 인터페이스를 실행하고 "연구 옵션"메뉴에서 "새로운 연구"를 선택합니다. 명령 줄에서 "mtune"를 입력하고 "조정 GUI"를 끌어 실행합니다. "시작 프로브 조정"을 선택하고 "자동 스케일"버튼을 클릭합니다. 조정 GUI는 RFsignal를 표시하도록 변경됩니다. 튜닝 프로톤 공명 주파수 RF 코​​일 (400 MHz 이상)에서 코일의 단부에서 원격 튜닝 / 매치 노브를 사용. "시작"탭에서 관련 버튼을 클릭하여 주파수 및 전력 보정을 실행하려면 "설치 전"페이지로 이동합니다. shimming 페이지를 끌어 탭 '연구 심 "탭"'에 XYZ (빠른) 버튼을 누르십시오., 심 페이지로 이동 모든 반복을 선택하고 자동 shimming을 수행하기 위해 심 버튼을 누르십시오.
  3. 마우스 마음을 집중하는 영상 인터페이스의 "연구"탭에서 스카우트 순서를 선택합니다. "획득"탭에서 35mm 2 FOV를 변경하고 컴퓨터의 기본 설정을 유지합니다. 순서를 실행하려면 시작을 클릭하고 심장은 FOV의 중심에 있지 않은 경우, 동물 홀더의 위치를​​ 조정할 RF 코​​일 리튠 다시 정찰 이미지를 얻는다.
  4. "연구"탭에서 "GEMS"순서 버튼을 클릭 한 후 단축과 ​​마음 (20, 21)의 긴 축을 따라 두 개의 직교 평면을 얻기 위해 해당 "획득"탭을 획득 매개 변수를 입력합니다. 참고 : 그라데이션 에코 검사에 대한 일반적인 인수 매개 변수는 다음과 같습니다 슬라이스 두께 1 ㎜, 반복 시간 (TR), 200 밀리 초; 에코 시간 (TE), 2.67 밀리 초 (최소); 플립 각도 25 °; 면내 매트릭스 크기 128 x 128의; FOV, 22mm2; 인수의 수, 4; 1 분 30 초 대략 획득 시간.
  5. "전진"탭에서 LV 해부학 및 기능 매개 변수를 측정하기 위해 맥박 산소 측정기 - 게이트 짧은 축 시네 MR 이미지를 수집하기 위해 "CINE"순서를 선택합니다. 마우스를 가져 가면 및 드래그하여 심장의 긴 축보기를 기반으로 영상 조각의 위치와 각도를 조정합니다. 그라데이션 에코 시네 순서 얻기 위해 "획득"탭에서 다음과 같은 이미지 매개 변수를 입력 : TR, 500 밀리 초; TE, 5 밀리 초; FOV, 22mm 2; 인수 매트릭스, 256 X 256; 슬라이스 두께 1mm; 인수의 수, 8; 프레임 수, 10; 17 분 ~의 획득 시간. 획득을 시작하려면 시작을 클릭합니다.
  6. 이미징 소프트웨어의 "I / O"탭을 사용 DICOM 형식으로 획득 된 영상을 변환하고 처리를 위해 데이터 센터에 대응하는 파일을 전송.
  7. 촬상 과정의 끝에서, 모든오우 마우스는 필터 탑 케이지 내에서 마취에서 복구 할 수 있습니다. 그들은 흉골 드러 누움을 유지하고 필요에 따라 추가 연구를 위해 그들을 유지하기 위해 충분한 의식을 되 찾을 때까지 무인 쥐를 두지 마십시오.

심장 자기 공명 현미경 이미징의 4. 데이터 분석

  1. LV (19)의 해부학 적 및 기능적 매개 변수를 분석하는 세그먼트의 소프트웨어를 사용합니다. "열기 이미지 파일 (들)" "파일"메뉴의 하위 메뉴를 사용하여 소프트웨어에 DICOM 형식 시네 이미지를로드하여. GUI의 이미지 타입과 이미지 뷰 평면으로 '짧은 축 중반 심실'와 영상 기술, '씨네'로 'MRGE'를 선택합니다.
  2. 를 통해 최종 심장 확장 및 최종 수축기에 사용되는 시간 프레임을 지정하는 "다이 애스 털리을 끝으로 현재 기간을 설정"을 각각 "편집"메뉴의 하위 메뉴 "수축기을 끝으로 현재 기간을 설정합니다."
  3. 먼저 "LV"명령 단추를 클릭 한 다음 "엔도"과 오른쪽 하단 패널에 "EPI"명령 버튼을 수동으로 각각 좌심실 내막과 외막을 그립니다. 계산의 정확도를 증가시키기 위해 대응하는 커맨드 버튼을 눌렀을하여 유두근을 제거한다.
  4. 이러한 이완기 볼륨, 수축기 볼륨, 뇌졸중 볼륨, 그리고 오른쪽 상단 패널의 방출 분율로 정량화 된 LV 매개 변수를 참조하십시오. 같은 두께, 및 심실 직경 22로 LV 매개 변수를 측정하는 "기타"명령 버튼을 누른 다음, "측정 캘리퍼스"명령 단추를 클릭하십시오.
  5. 필요에 따라 이미지를 재 처리 '. 매트'형식의 세분화를 포함하여 이미지를 저장하기 위해 "파일"메뉴의 "이미지 스택 및 분할 모두 저장"메뉴를 클릭합니다.

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결과

이 보고서에서, EAM으로 영향을받는 동물의 마음의 구조와 기능의 변화를 결정하는 비 침습 양상으로 MRM 기술의 유틸리티가 표시됩니다. 심근염은 CFA 7 Myhc-α 334-352으로 동물을 면역에 의해 A / J 생쥐에서 유도하고, 동물은 21 일 후 예방 접종에 MRM 실험을 실시 하였다. MRM 영상은 트리플 축 기울기 (최대 강도 100 G / cm)가 장착 된 89mm 수직 구멍 자석을 사용하여 9.4 T (양성자 400 메가 헤르츠)에서 이소 플루 란 마취 살아있는 동물에서 수행 하였다. 스카우트의 이미지는 긴 축 4 실보기를 얻기 위해 축 이미지 뒤에 FOV의 중앙에 마우스 마음을 찾아 위치를 획득했다. 마음이 2 실보기 위해 몇 군데되는 각도는 그림 (a)에 표시됩니다. 심장 이미지는 구배 에코 기반 시네 펄스 시퀀스로 4cm 노래기 RF 이미징 프로브를 사용하여 획득 하였다. 심장 기능의 MEASurements (영상 : LV 두께, 출력 : 좌심실 이완 기...

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토론

이 연구는자가 면역 심근염으로 영향을받는 생쥐의 심장 이상을 확인할 수있는 비 침습적 인 도구로 MRM 절차 및 유틸리티를 설명합니다. EAM의 조직 학적 특징은 인간의 후 사구체 심근염과 유사하기 때문에, 마우스 모델은 일반적으로 심근 부상 23-25의 면역 메커니즘을 묘사하기 위해 사용된다. 그러나, 심근염 영향 동물은 임상 적으로 정상 나타나고, 진단은 실험 7의 종단에서 조직학을 기반으로 이루어진다. 동물은 일반적으로 21 일 postimmunization에 희생된다. 한 번에 이러한 방식으로 질병 과정을 평가하여 치료에 응답하여 질병의 진행의 모니터링이 중요한 요건이다 한계, 특히 제약 연구에서, 이러한 모델의 사용 포인트.

살아있는 동물에서 심장 이상을 확인하기 위해 MRM과 같은 비 침습 양식의 사용이 도움이됩니다. 여기에 설명 된 MRM 기술조영제를 사용할 필요없이 마음의 구조적 및 기능적 특성을 얻는 장점을 제공한다. 그...

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공개 사항

이해 상충은 선언되지 않았습니다.

감사의 글

이 연구는 미국 국립보건원(National Institutes of Health, HL114669)의 지원을 받았습니다. CM은 뉴저지주 심근염 재단(Myocarditis Foundation)에서 수여하는 박사후 연구 펠로우십 보조금을 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Myhc-a 334-352 (DSAFDVLSFTAEEKAGVYK)네오펩타이드, 케임브리지, 매사추세츠4 ° 스토어; C
CFASigma Aldrich, St Louis, MO58814 ° 매장; C
MTB H37Rv 추출물Difco Laboratories, Detroit, MI231141Store at 4 ° C
PT목록 Biologicals Laboratories, Campbell, CA181Store at 4 ° C
1x PBSCorning, Manassas, VA21-040-CVStore at 4 ° C
IsofluranePiramal Healthcare, 뭄바이, 인도NDC66794-013-25
암컷 A / J 마우스Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME646
Luer-lok sterile 1 ml syrringeBD, Franklin Lakes, NJ309628
Luer-lok sterile 3 ml syrringeBD, Franklin Lakes, NJ309657
멸균 바늘, 18 GBD, 프랭클린 레이크, NJ
멸균 바늘, 27 1/2 GBD, 프랭클린 레이크, 뉴저지305109
3방향 스토콕Smiths Medical ASD, Inc. 더블린, 오하이오MX5311L
Kerlix 거즈 붕대 롤Covidien, Mansfield, MA6720
KimwipesKimberly-Clark Professional, Roswell, GA34155
Protouch StockinetteMedline Industries, Mundelein, IL30-1001
멸균 수술용 가위 및 집게INOX 도구 주식회사
마이크로 오븐GE Healthcare, 
ThermiPAQ 온찜질 및 저온 요법 시스템 Theramics Corporation, Springfield, IL
파충류 난방 램프Energy Savers Unlimited, Inc. Carson, CA
3M Transpore 테이프Target Corporation, MN
Up and Up Polymyxin B sulfate/Bacitracin/Neomycin sulfate 항생제 연고Target Corporation, MN
North Safety DeciDamp-2PVC 폼 귀마개North Safety Products, 스미스필드, RI
코튼 팁 애플리케이터, 6' ’ 나무 줄기 Jorgensen Laboratories, Inc. Loveland, CO
마취 유도 챔버 Summit Anesthesia Solutions, Ann Harbor, MI
Summit 마취 흐름 조절을 위한 지원 시스템 Summit Anesthesia Solutions, Ann Harbor, MI
특별히 설계된 동물 홀더Agilent Technologies, Santa Clara, CA
Bickford  옴니콘 F/Air  마취 가스 필터 장치 A.M. Bickford, Inc. 웨일즈 센터, 뉴욕
맥박 산소 측정기 모듈, MR 호환 소형 동물 모니터링 및 게이팅 시스템 Small Animal Instruments, Inc. Stony Brook, NY
산소 실린더 Matheson-Tri Gas, North-Central Zone, Lincoln, NE
가스 조절기 Western Medica, West Lake, OH
신호 차단 모듈, MR 호환 소형 동물 모니터링 및 게이팅 시스템Small Animal Instruments, Inc. Stony Brook, NY
9.4 T (400 MHz) 89 mm 수직 코어 보어 MR 스캐너Agilent Technologies, Santa Clara, CA
4 cm 노래기 마이크로 이미징 RF 코일Agilent Technologies, Santa Clara, CA
SAM PC 모니터Small Animal Instruments, Inc. Stony Brook, NY
정량적 의료 이미지 분석 소프트웨어http://segment.heiberg.se;   세그먼트 v1.8 R1430,  Medviso, Oresunds 지역, 스웨덴
Matlab 소프트웨어The Mathworks, Inc.  Natick, MA
Computer-Unix 운영 체제
305195

참고문헌

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