Abstract
De fleste morfogenetiske processer i fosterets tarmen er blevet udledt tynde snit af faste væv, der giver øjebliksbilleder af ændringer over udviklingsstadier. Tre-dimensionel information fra tynde serielle sektioner kan være udfordrende at fortolke på grund af vanskeligheder med at rekonstruere seriesnit perfekt og opretholde en ordentlig orientering af vævet over seriel sektioner. De seneste resultater fra Grosse et al. 2011 fremhæve betydningen af tredimensionale oplysninger i forståelsen morfogenese af udviklingen i villi i tarmen 1. Tre-dimensionel rekonstruktion af enkeltvis mærkede intestinale celler viste, at størstedelen af de intestinale epitelceller kontakt både de apikale og basale overflader. Endvidere tredimensional rekonstruktion af actincytoskelettet på den apikale overflade af epitel viste, at tarmlumen er kontinuerlig, og at sekundære lumen er en artefakt af filtreectioning. Disse to punkter, sammen med demonstration af interkinetic nuklear migration i tarmepitelet definerede udvikle tarmepitelet som pseudostratified epitel og ikke stratificeret som tidligere antaget 1. Evnen til at iagttage epithelet tredimensionelt var skelsættende at demonstrere dette punkt, og omdefinere epitelial morfogenese i foster tarmen. Med udviklingen af multi-foton billedbehandling teknologi og tredimensionale rekonstruktion software, evnen til at visualisere intakt, udvikle organer hurtigt bedring. To-foton excitation giver mindre skadelig indtrængen dybere ind væv med høj opløsning. To-foton-billeddannelse og 3D-rekonstruktion af hele føtale mus tarmene i Walton et al. 2012 bidraget til at definere mønsteret af villus udvækst 2. Her beskriver vi en hel organkultur system, der tillader ex vivo udvikling af villi og udvidelser af denne kultur til at muliggøretarmene være tredimensionalt afbildes under deres udvikling.
Protocol
BEMÆRK: Alle mus blev håndteret humant hjælp protokoller, der er godkendt af University of Michigan Medical School for Laboratory Animal Medicine og i overensstemmelse med retningslinjerne fra universitetet Udvalget om brug og pleje af dyr.
1. Hele Organ Culture System
- Udarbejdelse af medier og kultur plader
- I en vævskultur hætte, fjern 5 ml BGJb medier fra bestanden flasken og tilsættes 5 ml Pen / Strep. Forbered en arbejdsgruppe bestand af medier i en 50 ml konisk rør, ved at tilsætte 1 ml 5 mg / ml ascorbinsyre til 49 ml BGJb medier (med pen / Strep).
- Forbered en 6 godt kultur plade ved at tilsætte 1 ml under hver af de Transwells.
BEMÆRK: Hvis der ikke anvendes alle 6 Transwells flytte ekstra Transwells i en frisk steril 6 brønds plade til senere brug. Tilsæt 3 ml arbejder BGJb- medie til hver af tre 10 cm sterile petriskåle.
- Forberedelse til dissektion
- Soak dissekere værktøjer i 70% EthANOL og sørg for at holde de værktøjer ren, mens du arbejder.
- Opsætning af dissekere område med en stor is spand og placere 6 godt kultur plade og 10 cm petriskåle med BGJb medier på is. Arbejde på is så meget som muligt, mens dissekere og forberede tarmene for kulturen.
- Bedøver voksne hunmus i et kammer med isofluoran (100 ul) før aflivning ved cervikal dislokation for høstning af føtale tarmene.
- Efter høst af fostre fra deres mor, iscenesætte hver fosteret omhyggeligt ifølge Theiler staging diagram 13. Stol ikke på dage efter coitus til at bestemme alderen på hvert enkelt foster som variationer af op til 24 timer i udviklingsstadiet rutinemæssigt observeret inden for et enkelt kuld.
- Dissektion af føtale tarme
- Aflive fostre ved halshugning før fjernelse af indvolde.
- Skær hver tarmen i 1x Dulbeccos phosphatpufret saltvand (DPBS), og derefter place det ind i en 10 cm petriskål med arbejde BGJb medier.
- Fjern forsigtigt milten fra maven og bugspytkirtlen fra maven og den øvre duodenum.
- Forsigtigt adskille omentum tager sig at forlade omentum knyttet så meget som muligt og adskille forbindelser kun nok til at tillade, at tarmen skal rettes.
BEMÆRK: tarmene ældre end E14.5 eller dem dyrkes længere end 24 timer, forsigtigt adskille tarmen i 3 lige store segmenter for at muliggøre luminale indhold at flyde gennem tarmen og blive udvist fra de afskårne ender. Men for kulturer startet før E13.5 vente, indtil efter 24 timer af dyrkningen, før adskillelse af de tre segmenter i tarmen til at tillade serosa korrekt vokse over længden af tarmen. - Brug en mund pipette til at overføre den intestinale stykker onto Transwells af dyrkningspladen (1.1.2).
- Repositionere forsigtigt tarmene efter behov, så de er lige over transwell.
Bemærk: Når tarmene begynde at flytte luminale indhold gennem røret, vil eventuelle knæk i tarmen forårsage en backup og skader på tarmen.
- Kultur og behandling
- Fjern medierne fra under transwell, tilsættes 700 ul behandling medier (arbejdsgrupper medier tilsat rekombinante proteiner eller farmakologiske hæmmere) under transwell.
- Der tilsættes 300 pi behandling medier dråbevis oven på tarmene og gør det muligt at suge gennem trans-brønd. Flyt tarmene som nødvendigt.
- Skift behandling medier mindst en gang dagligt eller oftere afhængigt af halveringstiden af behandlingen reagens.
- Fremstilling af protein gennemvædet agaroseperler for en lokaliseret kilde til behandling reagens
- Resuspender agaroseperler i deres opbevaringsbeholder og overføre 100 ul agaroseperler i et 1,5 ml mikrofugerør.
- Fyld den resterende mængde af røret med steril 1x Phosphate-saltvand (PBS) og blandes perlerne at vaske dem. Placer mikrofugerøret i et stativ i et par minutter for at tillade perlerne sig på bunden, og derefter pipetteres fra PBS fra toppen af perlerne. Fyld mikrofugerøret med sterilt 1x PBS og gentage vaskeprocessen to gange mere.
- Forbered proteinet af interesse på to gange den ønskede til behandling koncentration.
- Bland 5 pi vaskede agaroseperler med 5 pi 2x proteinet materiel og ryst forsigtigt perlerne i proteinet. Glasset anbringes på is i 1 time, blanding forsigtigt hver 10-15 min.
- Skyl perlerne kortvarigt i sterilt 1x PBS før placere perlerne på tarmene.
- Placering af agaroseperler
- Anbring forsigtigt agaroseperlerne oven i tarmene ved hjælp af en mund pipette med trukket kanylerne. Placer perlerne med ekstrem forsigtighed, da hårdhændet behandling kan beskadige tarmen og forebygge villus udvikling i det skadede område.
- Placer dobbelt så mange perler, som er nødvendige for analyse, da tarmene vil undergå peristaltiske bevægelser og omkring halvdelen af perlerne placeret vil rulle væk fra tarmene over dyrkningstid.
- Fiksering af dyrkede tarme
- Fjern forsigtigt behandling medier fra under trans-brønd og tillade tarmene lufttørre i 3 min.
- Der tilsættes 1 ml fikseringsopløsning under trans-brønd i 2 min, og derefter dække den øverste del af tarmen med 2 ml fikseringsopløsning til resten af fiksering tid. Fix med 4% paraformaldehyd O / N-ved 4 ° C eller i 2 timer ved stuetemperatur.
2. Scanning af faste Tarmene
- Whole- mount billeddannelse
- Placer hele tarmene (med endogene fluorescens) på et dias med 100 ul 1x DPBS. Brug pincet til forsigtigt at arrangere tarmene.
- Brug en lab væv til forsigtigt at fjerne de DPBS og straks tilsættes 100 ul 70% glycerol til vævet more gennemsigtig og øge den mulige dybde billeddannelse.
BEMÆRK: Hvis der ønskes yderligere indtrængning af tarmen, i stedet for montering af tarmen i 70% glycerol, sættetid tarmen i et par dråber Focus klar opløsning 10-30 min. Pipette fra Focus Klar opløsning og montere tarmen med Mount Clear. - Dyp hver af de fire hjørner af et dækglas i modellervoks og afhente en lille mængde af ler til at bruge som afstandsstykker mellem dias og dækglasset at holde dækglasset fra udfladning tarmen.
- Forsegl dækglasset på dias med smeltet VALAP påføres med en vatpind.
- Billede tarmene på enten en opretstående eller omvendt konfokal mikroskop. Der henvises til diskussionen for yderligere detaljer.
- Vibratome sektionering af faste tarme (til tværsnit af intestinale strukturer)
- Integrer tarme i 7% agarose i små plast forme (10 x 10 x 15 mm), og lad agarose blokke tilafkøle og størkne.
- Fjern agarose blokke fra plast forme og lim agarose blokke til vibratome indsamlingen scenen med instant lim.
- Fyld indsamling scenen med iskold 1x DPBS.
- Snit på en tykkelse på mellem 100-150 um. For tykkere sektioner anvender clearing-løsninger (beskrevet i afsnit 2.1.2) for at visualisere dybere ind i tværsnit.
- Hæld vibratome sektioner fra samlingen scenen i en brønd på en 6-brønds plade til opbevaring ved 4 ° C.
- Immunofluorescensfarvning af faste, vibratome inddelte væv
- Placer 5-12 Vibratome sektioner per brønd i en 24-brønds plade med 1x DPBS.
- Fjern 1x DPBS, og der tilsættes 500 pi permeabilisering opløsning per brønd. Vip forsigtigt prøver til 25 minutter ved stuetemperatur.
- Efter permeabilisering vaskes prøverne 3 gange med 1x PBS.
- Bloker prøverne i mindst 30 minutter i 500 pi blokeringsopløsning.
- Efter blokering eXchange Den blokerende opløsning med 500 pi primære antistoffer fortyndet med blokerende opløsning og holde prøverne ved 4 ° CO / N.
BEMÆRK: det primære antistof fortyndinger, der fungerer godt på frosne og paraffinsnit fungerer generelt godt på vibratome sektioner Men også-antistoffer kræver nukleare hentning antigen generelt ikke arbejder godt sammen med denne protokol (f.eks BrdU). - Den følgende dag vaskes prøverne 3 gange i 15 minutter hver gang med blokerende opløsning.
- Efter vask påføres 500 pi af det sekundære antistof fortyndet med blokerende opløsning. Pak 24-brønds plade i aluminiumfolie for at beskytte fluoroforerne mod lys og rock prøverne i 45 min til 2 timer ved stuetemperatur.
- Vask prøverne 3 gange med 1x PBS i 15 minutter hver og montere vibratome afsnittene om dias, som beskrevet i afsnit 2.4.
- Montering vibratome sektioner
- Forbered slides til vibratome montage ved at skære tynde skiver af dobbelt-STIck tape og placere dem langs de lange sider af dias.
- Placer forsigtigt 5-10 vibratome sektioner mellem dobbelt-stick tape på dias i et fald på 100 pi 1x PBS.
- Fold alle sektioner og sprede dem ud i et enkelt lag på tværs af dias.
- Fjern overskydende agarose eller ujævne bits, der ville forhindre et dækglas fra sidder fladt.
- Brug forsigtigt en lab væv til at opsuge overskydende 1x PBS fra omkring vibratome sektioner.
- Tilføj en dråbe vandig montering medium på toppen af Vibratome sektioner og derefter dækglas.
- Forsegl dækglas på dias med smeltet VALAP påføres med en vatpind.
- Billede af vibratome afsnittene om enten en opretstående eller omvendt konfokal mikroskop. Der henvises til diskussionen for yderligere oplysninger om valget af et billedbehandlingssystem.
3. Levende Imaging af Whole Tarmene
Tarmene høstes fra fetuses efter E12.5, med den tilsluttede omentum tilbage intakt, med succes at udvikle villi i kultur ved hjælp af ovenstående system. Derfor er denne ex vivo systemet tillader indfangning af levende z-profil billeder af udviklingslandenes tarmene, der kan rekonstrueres for en tre-dimensionel visning af morfogenese over tid.
- Opsætning direkte billedvisning
- Brug instant lim til at klæbe en individuel polycarbonatmembran til et finmasket skærm. Dette giver en støtte stillads at holde tarmen på plads under dypning linse opretstående konfokalt mikroskop. Der henvises til diskussionen afsnit for yderligere oplysninger om udvælgelse af levende billeddiagnostiske mikroskoper.
- Placer mesh sigte i centrum brønd i en dyrkningsplade.
- Placer dissekeret tarmen på polycarbonatmembranen og en dråbe instant lim i hver ende. Brug kun nok lim til at fastgøre tarmen, men ikke frakke det!
- Tilføj dyrkningsmedier fri for phenolrødt under polycarbonatmembran i midten brønd i dyrkningspladen.
- Tilsæt vand til den ydre rand af dyrkningspladen for at give fugtighed.
- Da den føtale tarmen undergår peristaltisk-lignende bølger af sammentrækning i kultur, tilsættes 100 pi af en 1: 5 opløsning af xylazin i 1x PBS til 3 ml medier til at kontrollere bevægelsen af tarmen, mens billeddannelse. Denne dosis vil styre tarm bevægelser for omkring 8-10 timer uden at kompromittere villus udvikling.
- For et tværsnitsbillede af tarmen, indkapsle levende tarme i en 3-4% agaroseopløsning og skæres tykke sektioner (150-500 um) på et vibratom. Match stivheden af agarose med stivheden af tarmen bliver skåret og empirisk bestemt udviklingsstadiet. Generelt er en 3% agaroseopløsning fungerer godt for tarmene yngre end E14.5 og en 4% opløsning fungerer godt for tarmene E15-E16.
- Lim vibratome sektioner til en polycarbonatmembran fastgjort til en mesh skærm (som i afsnit 3.1.1) ogkultur som beskrevet i afsnit 3.1.2-3.1.6.
- Gennemføre den levende billeddannelse ved hjælp af en to-foton konfokal fluorescens mikroskop (excitation laser mellem 690-1,040 nm) på en opretstående stativ med en justerbar bord.
- To-foton laser tunet til 900 nm giver dyb indtrængen med den bedste opløsning til GFP signaler. Det reducerer skader på væv, mens billeddannelse. Hertil kommer, at sætte magt laser til den lavest mulige emission reducerer vævsskader. Typisk for at opnå en god excitation af GFP bruge 12% effekt på to-foton laser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kultur af hele eksplantater af føtale tarme giver mulighed for analyserne af det sted, distribution og varigheden af de signalstoffer, der koordinerer tarm udvikling, da dette system muliggør manipulation af signaleringen med farmakologiske reagenser eller rekombinante proteiner. Systemet transwell kultur (figur 1A, gengivet fra Walton et al., 2012) 2 giver en luft-væske grænsefladen, hvilket gør det muligt at placere narkotikarelaterede eller protein gennemblødt agarosekugler på vævet og derved etablere lokale signalsystemer kilder (figur 1B ). Tarmene høstet fra fostre på E10 til E18.5 overleve i kultur på Transwells og gennemgå peristaltisk-lignende bølger af bevægelse. Tarmene startede i kultur fra E13.5 overleve cirka 10 dage, eller groft til P3, den fase af udviklingen musen, når krypt dannelse er først observeret. Selvom stage tarmene tidlige overleve i kultur, tarme høstet førE12.5 ikke dukke villi pålideligt, sandsynligvis fordi de serøse hinder ikke er vokset til helt at dække tarmen på det tidspunkt. Mesenkymale dannes klynger og villi begynder at dukke op og forlænge i tarmene startede i kultur på E12.5, E13.5 eller E14.5, selvom udviklingen er lidt forsinket i forhold til ukultiverede, scene-matchede kontroller (Figur 1, gengivet fra Walton et al. 2012) 2. Uanset den fase af tarmen ved starten af kultur (E12.5-E14.5), tarmene vises altid have en omtrentlig forsinkelse på 24 timer. E14 tarme dyrkes i kultur i to dage viser væksten af villi, der er mere lig dem af E15 tarme end villi af E16 tarme dyrket i livmoderen (Figur 1C-F) 2.
Den regelmæssige mønster af mesenkymale klynger afsløres af tredimensionel rekonstruktion af optiske dele af en hel PDGFRα GFP / + tarmen ved E15.5 (figur 2 </ Strong>, gengivet fra Walton et al. 2012) 2. Dette billede består af z-stakke af 54 synsfelter, der blev syet sammen af Leica LAS-AF-software. Hver plet inde i tarmen er en mesenkym klynge visualiseret ved nuklear tagget GFP udtrykkes fra PDGFRα locuset 14. Den høje opløsning på billedet giver seeren at zoome ind på bestemte områder for at undersøge detaljerne, men alligevel indeholder detaljerede rumlige relationer, som ikke kan udledes enkelte synsfelter eller lavere effekt forstørrelse. Movie 1 er en serie stepping gennem syet z -stack billeder, der er 3D rekonstrueret i figur 2. De enkelte optiske sektioner muliggøre en yderligere visualisering af detaljer såsom enkelte celler i klynger.
Optiske sektioner af whole- mount immunofluorescens af intestinal karsystem med PECAM antistof (BD Pharmingen 557355; fortyndet 1: 1.000) blev taget med to-foton excitation og rekognosceringstrueret med Imaris softwaren (Figur 3). Denne tre-dimensionel visning af de intestinale blodkar afslører et indviklet netværk af vaskulatur, der ikke fuldt ud kan forstås af tynde afsnit præparater. Movie 2, en roterende tre-dimensionelle projektion af det rekonstruerede billede i figur 3, giver mulighed for yderligere vurdering af, hvordan øget information med forudsat tredimensionel rekonstruktion kan forbedre forståelsen af strukturelle mønster.
Vibratome sektionering tillader tredimensionel visning af tarmen fra en tværgående udsigtspunkt. I figur 4, forholdet mellem udviklingslandene klynger (markeret med PDGFRα GFP / +) 14 med epitel og omgivende mesenkym (markeret med membran Tomat (Rosa26 mT / mg) 15 overholdes.
Alternativt kan dette forhold ses af antistof immunofluorescence farvning (figur 5) af mesenchymale klynger (grøn, mærket med anti-PDGFRα (SantaCruz C-20; fortyndet 1: 200)) med epitelet (rød, mærket med anti-Ecadherin (BD Transduction Labs 610181, 1: 1.000 fortynding).
Hele denne orgel kultur Systemet kan også udvides til at give mulighed for to-foton billedbehandling udvikle føtale tarmene. I denne opsætning er den føtale tarmen limet til en polycarbonatmembran understøttes af en mesh sigte i en større kultur plade (figur 6). Den større og størrelse dyrkningspladen tillader det konfokale mikroskop linser til at kontakte tarmen inde godt.
Figur 1. Udvikling af hele føtale tarmene i et trans-brønd-kultursystem. (A) Føtal tarme placeret på en transwell membran i en 6 brønds dyrkningsplade med BGJb- medier. Top to tarme er E12.5, to nederste tarmene er E13.0. (B) Okseserumalbumin gennemblødt agarosekugler (lysere blå) placeret på en tolvfingertarmen i transwell kultur-systemet. Jo mørkere blå plet er X-gal farvning for Ptc LacZ / + i Hedgehog reporter mus stregmærket mesenkymal klynger 16. (CF) tværsnit af friskhøstede E14.0 (C), E15.0 (D) og E16. 0 (E), duodenal væv farvet med E-cadherin (grøn) og DAPI (blå). Ved E14.0 er unremodeled epitel stadig pseudostratified, mens E15.0 og E16.0, spirende villi er synlige. (F) En tarm segment er identisk med den, der ses i (C), men dyrket i to dage (E14 + to dage) viser, at villi udvikle sig i kulturen, men lidt forsinket. Paneler (CF) er genoptrykt fra Walton et al. 2012 2 sup>. Scalebars er 50 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Tre-dimensionel rekonstruktion af syede områder af z-stakke fra en E15.5 whole- mount PDGFRα EGFP / + tarmen. Billedet er en delvis rekonstruktion (fem 1 um snit fra centrum af 65 z-sektioner) fra 54 syede felter opfattelse taget med den motoriserede etape af LeicaSP5X konfokal mikroskop på en inverteret DMI 6000 stativ med to-foton laser excitation ved 900 nm. Leica LAS-AF-software syet Z-stakke sammen til dannelse af hele billedet. Scalebar er 1 mm.
n "src =" / filer / ftp_upload / 51817 / 51817fig3highres.jpg "width =" 500 "/>
Figur 3. Tre-dimensionel rekonstruktion af optiske sektioner viser whole- mount anti-PECAM immunfluorescens af intestinal karsystem i en E14 tolvfingertarmen. Optiske sektioner blev fanget på en LeicaSP5X konfokal mikroskop på en opretstående DMI 6000 stå med to-foton excitation ved 900 nm og tre dimensionelt rekonstrueret ved hjælp af Imaris 7.6.1 software. Scalebar er 200 um.
Figur 4. Konfokale billeder af vibratom snit E15.5 PDGFRα EGFP / +; Rosa26 mTmG jejunum viser den tætte associering af de PDGFRα EGFP / + celler af mesenkymale klynger (grøn) med deres overliggende epitel og omgivende mesenkym (rød; membran Tomat fra Rosa26 mTmG). < / Strong> Scalebars er 50 um i de øvre paneler og 25 um i de nederste paneler.
Figur 5. Tre-dimensionelle rekonstruktioner af konfokal billeder fra E15.5 vibratome sektioneret tarme, der var antistof immunofluorescens farves. Scalebar er 50 um.
Figur 6. Tilpasning af transwell dyrkningssystem til 2-foton direkte billedvisning. (A) mesh anbringes i en dyrkningsplade. (B) polycarbonat er limet til mesh sigte. (C) Tarmene er limet til polycarbonatmembranen og dyrket med phenol DMEM medier.
Film 2. Roterende film viser tredimensionale rekonstruktion af de optiske dele af PECAM farvet vaskulatur i E14 duodenum i figur 2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den dynamiske natur og komplekse væv vekselvirkninger udviklingslandene tarmen kræver 3D-visualisering til at få en fuld forståelse af disse morfogenetiske begivenheder. Med udvikling imaging-teknologi, evnen til at undersøge villus morfogenese i detaljer er ved at udvikle / forbedre og med det, er forståelsen af rumlige kommunikation og interaktion under organogenesen stærkt forbedret.
Alternative metoder til dyrkning hele tarme er også blevet testet, men det transwell systemet forbliver den mest pålidelige i længere kultur tider og for at opretholde normal klynge og villus mønster. Tre-dimensionel dyrkningssystemer (Matrigel eller kollagen) fungerer godt for kultur perioder korte (mindre end 24 HR) på yngre tarmene (E12.5-E15.5), men når tarmene begynder undergår peristaltisk-lignende bevægelser og udskille enzymer og affald ind i lumen, må de tredimensionale substrater ikke holder sig godt. Tarmene i flydende kulturs vil også udvikle imidlertid den manglende støtte eller henvisning til orientering i et fritsvævende kultur synes at ændre normale mønster for de klynger og villi. Derfor er transwell systemet foretrak at undersøge klynge mønster og villus opståen og udvækst.
En anden metode til whole- mount levende billeddannelse med en mindre streng sæt op er at bruge minutien ben at anbringe fostrets tarmen til et tyndt lag på 7% agarose på bunden af en 35 x 10 mm plade. Selv om denne metode er nemmere at sætte op, opmærksom på, at dens anvendelse er begrænset til yngre faser (E12.5-E15.5) eller kortere dyrkning gange siden matrigel ikke vil holde op til tarmsekreter.
Til fremstilling dyrkningspladerne, hæld nok smeltet 7% agarose til blot at dække bunden af et 35 x 10 mm plade. Placer en glaskapillarrør i centrum af agarosen mens den stadig er plastisk. Når agarosen er størknet, fjernes glaskapillar og placere than føtal tarm langs brønden skabt af kapillarrøret. Fyld kapillærrøret godt med Matrigel at omgive tarmen og placere dyrkningsskålen ved 37 ° C, indtil Matrigel sæt. Tilføj phenolrødt-frit DMEM dyrkningsmedier omhyggeligt. Placer 35 x 10 mm plade i en 60 x 15 mm plade og fylde 60 mm plade med vand for at skabe et fugtigt kammer.
Udvælgelse af monteringsmetode (whole- mount eller vibratome) til billeddannelse er baseret på den ønskede orientering af området, der skal visualiseres. For eksempel for at se ændringerne i epitelcelle form, Z-stakke gennem en wholemounted tarm vil give udsigt over de apikale og basale overflader. For at se interkinetic nukleare migrationen af de epiteliale celler i epitel ark, vibratome sektioner tillade en ende på (tværgående) at overholde de apikale og basale overflader.
Klargøring af prøverne er afgørende for opnåelse af de bedste imaging resultater. Når du bruger vibratome sektioner and standard konfokal mikroskopi, kan der opnås en god opløsning på op til dybder på 75 um uden en clearing reagens. I øjeblikket har en clearing reagens til levende prøver ikke blevet identificeret, så dybden af billeddannelse er begrænset. For faste prøver, kan anvendelse af en clearing-reagens i høj grad forbedre dybden af billeddannelse. Udligningen reagens sig at give den bedste morfologi og opløsning var Focus Klart 17. Efter 30 minutter af clearing i Fokus klar og montering i Mount klar, kan hele dybden af alle stadier af embryonale tarme skal afbildes med fremragende opløsning. En billigere clearing alternativ er 70% glycerol, men den maksimale indtrængningsdybde i embryonale væv er 150 m derefter opløsning og intensiteten af signalet mistes.
Et vigtigt punkt er, at signalerne mest defineret i prøver, der er monteret og afbildet på samme dag farvning blev gennemført. Montering med signal bevare vandigt monteringsmedium (såsom Forlæng guld anti-fade opløsning (Life Technologies P36930) hjælper med at bevare signal, men kun kortvarigt; de klareste billeder er altid fremstillet umiddelbart efter farvning og montering af prøverne.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fine dissecting forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | 2 pairs |
| 70% Ethanol | |||
| 1x sterile Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) | Gibco | 14040-133 | 500 ml |
| 6 well plates | Costar | 3516 | |
| 24 well plates | Costar | 3524 | |
| 60 x 15 mm petri dishes | Falcon | 451007 | |
| Transwell plates, 24 mm inserts, 8.0 mm polycarbonate membranes | Corning Costar | 3428 | 6 inserts per plate |
| BGJb media | Invitrogen | 12591-038 | 500 ml |
| PenStrep (10,000U/ml Penicillin; 10,000 mg/ml Streptomycin) | Gibco | 15140 | |
| Ascorbic Acid | Sigma | A0278 | make 5 mg/ml stock, filter, aliquot and store at -20 °C |
| Mouth pipet (Drummond 1-15 inch aspirator tube assembly) | Fisher | 21-180-10 | remove the aspirator assembly and replace it with a 1,000 µl pipet tip which acts as an adaptor to plug in a 6 inch glass Pasteur pipet. |
| 6 inch glass pasteur pipets | |||
| Capillary Tubes | World Precision Instruments | TW100F-4 | pull to needles |
| 4% Paraformaldehyde | made in 1 x PBS, pH to 7.3 | ||
| Culture plates | Falcon | 353037 | |
| Fine mesh stainless steel screen | purchase at hardware store | ||
| Polycarbonate membranes | Thomas scientific | 4663H25 | alternatively, cut Corning Costar 3428 membranes off of transwell supports |
| Instant glue | purchase at hardware store | gel based preferrably | |
| 35 x 10 mm plates | Falcon | 351008 | |
| 7% agarose | Sigma | A9414 | prepare w/v in 1x DPBS, heating to dissolve in a waterbath |
| minutien pins | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| Phenol red free media (DMEM) | Gibco | 21063-029 | |
| Xylazine (100 mg/ml) | AnaSed | 139-236 | |
| Matrigel | BD | 356231 | basement membrane matrix, growth factor reduced, phenol red-free |
| 3-4% agarose | Sigma | A9414 | prepare w/v in 1x DPBS, heating to dissolve in a waterbath |
| Imaging of fixed intestines | |||
| Name of Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| vaseline | purchase at pharmacy | used to make VALAP: equal parts vaseline, lanolin, paraffin | |
| lanolin | Sigma | L7387 | used to make VALAP: equal parts vaseline, lanolin, paraffin |
| paraffin | Surgipath | 39601006 | used to make VALAP: equal parts vaseline, lanolin, paraffin |
| 70% glycerol in 1 x PBS | |||
| Focus clear and Mount Clear | CelExplorer Labs Co. | F101-KIT | |
| Modeling clay | purchase at art supply store | ||
| double stick tape | |||
| cotton applicator swabs | |||
| plastic molds, 10mm x 10mm x 5 mm) | Tissue Tek | 4565 | |
| slides | |||
| coverslips | |||
| lab wipe | Kimberly Clark | 34155 | lint free delicate task wipe |
| Theiler staging chart | http://www.emouseatlas.org/emap/ema/theiler_stages/ downloads/theiler2.pdf | ||
| Leica SP5X confocal microscope | Leica | Used to conduct the live imaging | |
| Leica DMI 6000 stand | Leica | Used to conduct the live imaging | |
| Aqueous mounting medium (Prolong Gold) | Molecular Probes | P36930 | |
| Name of Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 24 well plate | Costar | 3524 | |
| Triton X-100 | Sigma | T-8787 | used to make Permeabilization solution: 0.5% Triton X-100 in 1 x PBS |
| Goat serum | used to make Blocking Solution: 4% Goat serum, 0.1% Tween20 in 1x PBS | ||
| Tween20 | Sigma | P9416 |
References
- Grosse, A. S., et al. Cell dynamics in fetal intestinal epithelium: implications for intestinal growth and morphogenesis. Development. 138, 4423-4432 (2011).
- Walton, K. D., et al. Hedgehog-responsive mesenchymal clusters direct patterning and emergence of intestinal villi. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 15817-15822 (2012).
- Wells, J. M., Melton, D. A.
- Hashimoto, H., Ishikawa, H., Kusakabe, M. Development of vascular networks during the morphogenesis of intestinal villi in the fetal mouse. Kaibogaku zasshi Journal of anatomy. 74, 567-576 (1999).
- Mathan, M., Moxey, P. C., Trier, J. S. Morphogenesis of fetal rat duodenal villi. Am J Anat. 146, 73-92 (1976).
- Burns, R. C., et al. Requirement for fibroblast growth factor 10 or fibroblast growth factor receptor 2-IIIb signaling for cecal development in mouse. Dev Biol. 265, 61-74 (2004).
- Pabst, O., Schneider, A., Brand, T., Arnold, H. H. The mouse Nkx2-3 homeodomain gene is expressed in gut mesenchyme during pre- and postnatal mouse development. Dev Dyn. 209, 29-35 (1997).
- Pabst, O., Zweigerdt, R., Arnold, H. H. Targeted disruption of the homeobox transcription factor Nkx2-3 in mice results in postnatal lethality and abnormal development of small intestine. Development. 126, 2215-2225 (1999).
- Kaestner, K. H., Silberg, D. G., Traber, P. G., Schütz, G. The mesenchymal winged helix transcription factor Fkh6 is required for the control of gastrointestinal proliferation and differentiation. Genes & Development. 11, 1583-1595 (1997).
- Madison, B. B., McKenna, L. B., Dolson, D., Epstein, D. J., Kaestner, K. H. FoxF1 and FoxL1 link hedgehog signaling and the control of epithelial proliferation in the developing stomach and intestine. J Biol Chem. 284, 5936-5944 (2009).
- Karlsson, L., Lindahl, P., Heath, J. K., Betsholtz, C. Abnormal gastrointestinal development in PDGF-A and PDGFR-(alpha) deficient mice implicates a novel mesenchymal structure with putative instructive properties in villus morphogenesis. Development. 127, 3457-3466 (2000).
- Mao, J., Kim, B., Rajurkar, M., Shivdasani, R., Mcmahon, A. Hedgehog signaling controls mesenchymal growth in the developing mammalian digestive tract. Development. 137, 1721-1729 (2010).
- Theiler, K. The house mouse. Development and normal stages from fertilization to 4 weeks of age. , 2, Springer-Verlag. (1989).
- Hamilton, T. G., Klinghoffer, R. A., Corrin, P. D., Soriano, P. Evolutionary divergence of platelet-derived growth factor alpha receptor signaling mechanisms. Mol Cell Biol. 23, 4013-4025 (2003).
- Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45, 593-605 (2007).
- Goodrich, L. V., Milenkovic, L., Higgins, K. M., Scott, M. P. Altered neural cell fates and medulloblastoma in mouse patched mutants. Science. 277, 1109-1113 (1997).
- Fu, Y. Y., et al. Microtome-free 3-dimensional confocal imaging method for visualization of mouse intestine with subcellular-level resolution. Gastroenterology. 137, 453-465 (2009).
