방사성 트레이서와 식물에 미네랄 영양 성분 및 독성 물질의 플럭스를 측정

영양분과 독성 물질의 흡수 및 유통 강하게 식물의 성장에 영향을 미친다. 따라서, 기본 전송 프로세스의 조사가 특히 영양 최적화 및 환경 스트레스의 문맥에서, 식물 생물학 연구 및 농업 과학 ^1,2의 주요 영역을 구성한다 (예를 들어, 염 스트레스, 암모늄 독성). 식물체에서 플럭스의 측정을위한 방법들 중 최고 상당히 1950 개발 된 방사성 동위 원소 추적자의 사용 오늘날 널리 사용가되고 ^{(도 3} 등 참조)이다. 이러한 MIFE (자속 추정 이온 미세 전극)과 SIET (스캔 이온 선택성 전극 기법), 및 사용과 같은 조직에서의 루트 매체 및 / 또는 축적 이온 선택성 진동 미소 전극의 사용으로부터 영양분 고갈의 측정과 같은 다른 방법 이온 - 선택적 형광 염료는 또한 널리 적용되지만, 네트 독감을 검출 할 수있는 능력에 제한이XES (즉, 유입과 유출의 차이). 방사성 동위 원소의 사용은, 다른 한편으로는, 연구원 동역학 매개 변수를 해결하는 데 사용될 수있는 단방향 플럭스를 분리 및 정량화하는 독특한 능력을 허용한다 (예를 들면, K _M과 V _최대) 및 용량에 대한 통찰력을 제공 지학, 교통 시스템의 메커니즘 및 규제. 방사성 트레이서 만든 단방향 플럭스 측정은 반대 방향의 자속이 높은 조건에서 특히 유용하고, 세포 풀의 회전율은 ⁴ 급이다. 추적 동위 원소는 같은 원소의 다른 동위 원소의 배경에 대해 관찰되어 있기 때문에 또한, 추적자 방법 (아래, '토론'참조) 측정은 많은 다른 기술과는 달리, 상당히 높은 기질 농도에서 수행 할 수 있습니다.

여기서 우리는 단방향 및 N의 방사성 동위 원소 측정을위한 자세한 단계를 제공그대로 식물 등 미네랄 영양소의 플럭스 및 독성 물질. 중점 플럭스 칼륨 (K ^+)의 측정, 식물 영양소 ^(5), 암모니아 / 암모늄에 이루어집니다 (NH ₃ / NH ₄ ^+), 그러나, 예를 들어, 높은 농도 (에 존재하는 경우 독성이 다른 다량 영양소, 1 10 mM의) ^2. 우리는 방사성 동위 원소 ⁽⁴²⁾ K ⁺ (t ₂ = 12.36 시간)과 ¹³ NH _{13분의 ³} NH ₄ ⁺ (t ₂ = 9.98 분), 각각 모델 시스템 보리의 손상 모종 (Hordeum의 vulgare의의 L를 사용합니다 .), 두 가지 핵심 프로토콜의 설명 : 추적 유출 (CATE)으로 직접 유입 (DI) 및 compartmental 분석. 우리는이 문서가 단순히 각 프로토콜을 수행하는 데 필요한 단계를 설명합니다 처음부터주의해야한다. 각 기술의 적절한 계산과 이론에 대한 간단한 설명을 제공하지만, 자세한 아르 박람회의 배경과 이론은 주제 ^4,6-9에 대한 몇 가지 주요 기사에서 찾을 수 있습니다. 중요한 것은,이 프로토콜은 다른 영양소 / 독성 물질의 분석을 플럭스 광범위하게 양도 (예를 들어, ²⁴ 나 ^{+, 22} 나 ^{+, 86} 굽은 ^{+, 13} NO ₃ ^-) 및 다른 식물 종에 대한 몇 가지주의 사항이기는하지만 (아래 참조) . 우리는 또한 방사성 물질로 작업하는 모든 연구자가 기관의 이온화 방사선 안전 규제를 통해 제공 라이센스에 따라 작동해야 중요성을 강조한다.

1 공장 문화와 준비

1. (자세한 내용은 ^{10 참조)} 기후의 성장 챔버 7 일 동안 보리 모종 수경 성장.
   참고 : 영양 요구 사항이 시대에 따라 변화하므로, 개발 단계의 다양한에서 식물을 검사 고려하는 것이 중요합니다.
2. 하루 전에 실험으로, 하나의 복제 (DI에 대한 부당 3 식물, 기업용 번들 당 6 식물)를 만들기 위해 함께 몇 가지 모종을 번들. 촬영의 기초 부분의 주위에 타이곤 튜브의 2 cm 조각을 포장하고, "칼라"를 만들기 위해 테이프로 튜브를 고정하여 번들 모종.
   참고 : 부당 식물의 수는 실험 조건의 ^10,13,14에 따라 달라질 수 있습니다. 번들링 루트 질량 및 / 또는 특정 활동이 낮은 특히, 통계 및 측정 정확도를 개선하기위한 것입니다.

실험 솔루션 / 소재의 2 준비

1. 및 식물 물질과 비활성 [S _O를위한 샘플 바이알 ((공장 샘플의 스핀 - 건조) 원심 분리 튜브 ⁽¹¹ 참조, 자세한 내용) 예약 라벨, 라벨 및 탈착 해법; DI를 들어, 다음의 정보가 아래 참조). 에어레이션 모든 솔루션을 섞는다.
2. ⁽¹⁰ 참조, 자세한 내용은) 용출액, 식물 샘플 유출 유입 경로, (식물 샘플의 탈수 용) 원심 분리 튜브 및 샘플 유리 병 (잘 혼합, 폭기 라벨 및 용출 솔루션 및 : 케이트를 들어, 다음의 정보 S _오와 희석 배수의 결정 [D _f를, 아래 참조).

3 추적자를 준비

주의 : 다음의 안전 단계가 방사능으로 작업하기 전에주의해야한다.

1. 그 확인의 요구 radioacTIVE 재료 라이센스는 이해하고 따라야한다. 적절한 안전 장비 (즉, 고글, 장갑, 실험실 코트, 납 조끼 / 칼라)와 선량계 (예를 들어, TLD 링과 배지)를 착용 할 것. 차폐 설정 (즉, 플렉시 유리, 납 벽돌)과 뒤에 방사성 작업을 수행합니다. 가이거 뮬러 카운터가 정기적으로 오염을 모니터링하기 위해 존재 함을 확인합니다.
2. ⁴² K의 준비 ⁺
   1. 균형 깨끗하고 마른 비커를 놓습니다. 균형을 제로.
   2. 포장 (분말 형태로 ⁴² K ₂ CO _3의 20 mCi의) 추적의 병을 제거하고 비커에 추적을 붓는다. 질량에주의하십시오.
   3. 비커에 H ₂ SO ₄ 0.07 ㎖의 다음 dH보다 ₂ O의 피펫 19.93 ML,. 이것은 다음과 같은 화학 반응을 구동한다 :
      ⁴² K ₂ CO ₃ (들) + H ₂ SO ₄ (리터) + H ₂ O (리터) ⁴² → 2> 최대 SO ₄ (리터) + CO ₂ (V) + 2H ₂ O (리터)
   4. K ₂ CO _3의 질량과 분자량 주어진 방사성 스톡 용액의 농도 및 부피 (20 ㎖)을 계산한다.
      NOTE : ¹³ NH _{13분의 ³} NH ₄ ⁺ 트레이서을 물 산소 원자의 양성자 충격 통해 싸이클로트론에서 생성되는 작업 경우 (일반적으로 100 ~ 200 mCi의 활동의 결과, 생산 자세한 것은, ¹² 참조). ¹⁴ NH _{14분의 ³} NH ₄ ^+의 양이 이러한 솔루션에 매우 낮기 때문에, 원액의 N 농도는 무시할 수있다.

(4) 직접 유입 (DI) 측정

1. ⁴² K ^+의 경우, 라벨 용액에 K ^+의 원하는 최종 농도에 도달하는 데 필요한 방사성 스톡 용액의 양을 피펫.
   1. NH 13분의 3 13 NH 4 +, 피펫 라벨 솔루션으로 소량 (<0.5 mL)을 첨가 하였다. 라벨 솔루션 (폭기를 통해) 잘 혼합 할 수 있습니다.
2. 샘플 병에 라벨 솔루션의 한 ML의 서브 샘플을 피펫 (총 4 샘플)을 세 번 반복합니다.
   1. 감마 카운터를 이용하여, ( "분당 카운트"CPM에서) 튜브의 방사능을 측정한다. (이 같은 수명이 짧은 트레이서 특히 중요하다) 카운터가 노출 당 비용 (CPM) 수치는 동위 원소의 붕괴에 대해 보정되도록 프로그램되어 있는지 확인합니다.
   2. 4 개의 샘플의 개수 (노출 당 비용 (CPM)을 ^ML-1) 평균과 (μmol의 ML ^-1) 용액에 기판의 농도로 나누어 (노출 당 비용 (CPM) μmol의 ^-1로 표시) S _O를 계산합니다.
3. 볼 (시험 조건 하에서 식물을 미리 평형화, 5 분 동안 미리 라벨링 (비 방사성) 용액에 뿌리를 담금예를 들어, 사전 라벨 시간의 변화에 대한 ^10,13,14).
4. 5 분 동안 라벨 (방사성) 용액에 뿌리를 담가.
   참고 : 레이블 시간은 실험 ^3,4,7-10에 따라 차이가있을 수 있습니다.
5. 표면 부착 방사능의 대부분을 제거하기 위해 5 초 동안 탈착 용액에 뿌리를 전송합니다. 세포 외 추적자 더 명확 뿌리에 5 분 동안 탈착 솔루션의 두 번째 비커에 뿌리를 전송합니다.
6. 별도의 촬영, 기초 촬영, 뿌리는 해부합니다.
7. 낮은 속도에서 30 초 동안 원심 분리기 튜브의 뿌리와 스핀 샘플을 배치, 임상 수준의 원심 분리기 (~ 5000 XG)는 표면과 간질 물을 제거합니다.
8. 뿌리 (신선한 무게, FW)를 달아.
9. 식물 시료에서 방사능 카운트 (촬영, 기초 촬영, 루트를 스텝 4.2.1 참조).
10. 플럭스를 계산합니다. 공식을 사용하여 공장으로 유입을 계산
    Φ = Q * / S _O의 중량 _L
    여기서 Φ는 자속은(μmol의는 ^g-1의 시간 ^-1), Q * 조직에 축적 추적의 양 (보통 루트, 촬영, 노출 당 비용 (CPM), 그리고 결합 된 기저 촬영), S _o를 라벨 솔루션 (노출 당 비용 (CPM) μmol의 특정 활동 ^{- 1),} w는 루트 신선 중량 (g)이며, _{t는 L의} 표시 시간 (시간)이다.
    참고 :보다 정교한 계산이 CATE에서 얻은 매개 변수를 기반으로, 라벨 및 탈착시 뿌리에서 동시 추적 유출을 설명하기 위해 만들어 질 수있다 (; 자세한 내용은, ⁴ 참조 아래 참조).

추적기 유출 (CATE) 측정에 의해 5 Compartmental 분석

1. 라벨 솔루션 및 측정 S _O를 (- 위, 4.2 단계 4.1 참조) 준비합니다.
2. 희석 계수 (D의 _F)을 측정한다.
   NOTE : 종종 감마 카운터에서 검출기 샘플의 상대적인 위치에 영향을 미칠 수있는 수량방사선 측정했다. 자세한 내용은 설명을 참조하십시오.
   1. S _O를 측정 한 후, 각각의 샘플에 ₂ O H의 19 ML을 추가 (예 : 그 최종 부피 = 용출액 볼륨 = 20 ㎖). 각 20 ㎖의 시료의 방사능 량 (cpm)을 측정한다 (단계 4.2.1 참조).
   2. 20 ㎖의 샘플의 평균 CPM으로 1 ㎖의 샘플의 평균 CPM 나누어 D의 _F를 계산한다.
3. 1 시간 동안 라벨링 솔루션에 뿌리를 담근다.
4. 모든 루트 물질이 유입 내에 보장 깔때기를 유출하는 라벨링 솔루션 및 전송 식물에서 식물을 제거합니다. 플라스틱 칼라를 통해 테이프의 작은 스트립을 적용하여 유출 깔때기의 측면에 부드럽게 안전한 식물.
5. 조심스럽게 깔때기에 첫 번째 용출액을 붓는다. 타이머를 시작 (카운트 업).
6. 마개를 열고 15 초 후 샘플 병에서 용출를 수집 (참고 : 용출 시간이 달라집니다; 아래 참조). 마개를 닫습니다. 조심스럽게 깔때기에 다음 용출액을 붓는다.
7. 반복 하오첫째의 최종 용출액에 다음과 용출 시리즈의 나머지 t 단계 5.6 : 15 초 (사 회), 20 초 (세 번), 30 초 (2 회), 40 초 (한 번), 50 초 (한 번), 29.5 분의 전체 용출량에 대한 1주기 분 (25 시간),
   참고 : 탈착 시리즈는 실험 조건 ^{7-10,13,14에} 따라 차이가있을 수 있습니다.
8. 용출 프로토콜이 완료되면 수확 식물 (- 위의 4.8, 4.6 단계).
9. (5.2 참조, D _f를하여 각 용출액에 대한 읽기를 곱) 감마 카운터에서 용출액과 식물 샘플에서 방사능 량 (cpm)을 측정한다.
10. 용출 시간의 함수로 플롯 추적 자료 (노출 당 비용 (CPM) g (루트 FW) ^-1 분 ^-1). 정상 상태의 경우, 선형 회귀 분석 및 플럭스의 계산, 환율의 반감기 및 풀 크기를 (자세한 내용은 ^{6-9 참조)} 수행합니다.

그림 1은 높은에서 성장 그대로 보리 모종의 뿌리로 NH 3의 유입에 대한 (13 N)와 DI 기술을 사용하여 찾을 등온선을 보여줍니다 (10 mM)을 NH 4 +, 그리고 하나 (0.02 mM)을 높거나 낮은 (5 mM의 ) K +. (, 용액의 pH 13의 변화에 의해 조정 된 NH 3] 내선) NH 3 플럭스 외부 NH 3 농도의 함수로 플롯 할 때 등온선은 미카엘리스 - 멘텐 반응 속도를 표시합니다. NH 3 플럭스 높은 K의 +보다 낮은 K의 +에서 유의하게 높았다. 미카엘리스 - 멘텐 운동 매개 변수의 분석은 V 최대 강하게 높은 K + (205 대에 감소하는 동안 K M은 K + 수준 (각각 낮고 높은 K +,에서 150 대 90 μ M) 사이의 상대적으로 안정적으로 유지 것을 보여 주었다 80 μmol의 g -1의 시간 -1). 따라서, 데이터를 표시하는 K + 수준 regulatES 질소 수송 (V 최대 효과) 아니지만 수송차의 결합 부위에 대한 K + 및 NH 3 사이의 직접적인 경쟁 (K M 효과)에 의해. 오히려, K + (자세한 내용은, 13 참조) NH에게 같은 아쿠아 포린 활동의 변조를 통해 다른 수단에 의해 3 플럭스를 조절 할 수 있습니다.

DI 인해 영양 변화로도 유입이 상대적으로 빠른 변화를 포착하는 데 유용 또는 약리 에이전트의 응용 프로그램. 예를 들어, 그림이 하이라이트 - K + (0.1 mM)을 중간 및 높은 (10 밀리미터)로 성장 그대로 보리 모종의 뿌리에있는 K + -uptake 시스템의 급속한 소성 -NH 4 + 조건. 여기서 우리는 외부 솔루션에서 NH 4 + 철수의 5 분 이내에 K + 유입에 ~ 3백50% 증가 관찰했다. 이러한 "암모늄 금단 효과"( "AWE")는 K +에 민감한 것으로 밝혀졌다 +), 바륨 (바 2 +), 세슘 (세슘 +). 여러 애기 유전자형에 DI 및 전기 생리 측정을 사용하여, 우리가 할 수 있었던 결정적으로 애기 장대 K + 채널, AtAKT1, 높은 친 화성 K + 수송, AtHAK5 14의 활동 변화에 AWE의 대부분 돌리다.

그림 3은 낮은 (0.1 밀리미터) K +와 (1 mM)을 중간에서 성장 미리 라벨링 보리 모종의 뿌리에서 시간에 42 K +의 정상 상태 유출, NO 3 -. 이러한 추세는 케이트 방법은 다양한 약리 / 영양 에이전트의 응용 프로그램에 따라 유출에 신속하고 상당한 변화를 공개하는 방법을 보여줍니다. K + 유출의 실질적인 즉각적인 억제는 10 mM의 고사 +, K + - 채널 차단제, 또는 급격한 증가의 응용 프로그램 중 하나에 관찰되었다(0.1 ~ 10 mm까지) K + 제공한다. 이러한 결과는 K + 채널 (15)의 외향 정류 게이팅 고유 특성을 나타내는 분자 연구와 일치한다. 대조적으로, 10 mM의 NH 4의 적용은 빠르게 그리고 강하게 K +의 유출을 자극 +. 이 효과는 NH 4 + (17)의 도입시에 발생하는 것으로 알려져 루트 16 세포의 원형질막을 가로 질러 전위 구배의 탈분극을 통해 외향 정류 K + 채널의 활성화에 의해 설명 될 수있다. 따라서,이 방법을 사용하여, 우리는 K + 채널이 보리 (10)의 뿌리에서 K + 유출을 매개 것으로, 발바닥에, 입증 할 수 있었다.

마지막으로, 표 1은 42 K + 유출 ([K +] 내선 = 0.1 mM)을 보리 종자에서 정상 상태의 측정에서 추출 케이트 매개 변수를 보여줍니다10 mM의 NH 4 +, 후자는 독성 시나리오를 나타내는 - lings 중 하나를 1 ㎜ NO 3와 함께 성장. 높은 NH 4 + 조건은 모든 K + 플럭스의 억제 및 세포 내 K + 농도의 유의 한 감소를 초래 ([K +] CYT) 관찰 일반적으로 homeostatically (건강한 성장 조건 18 세 ~ 100 밀리미터로 유지된다, 예를 들어, 표 1에서, NO 3 이하 - 공급).

도 1 (13) 3 NH 유입 등온선 K + 질소 공급 장치가 전송을 조절하는 방법을 보여준다. NH 3 유입 NH 외부의 다양한 농도의 함수로서 4 +와 (빨간색 0.02 밀리미터) 낮거나 (파란색, 5 mM)을 높은 중 K + 높은 (10 mM)을 NH 3로 성장 보리 모종의 본래 뿌리> 3 ([NH 3] 내선). 미카엘리스 - 멘텐 높은 K +의 조항이 NH 3 -uptake 수송의 기판 친 화성 (즉, K M)에 상대적으로 적은 효과가 있지만, 크게 (즉, V 최대 전송 용량을 줄일 것으로 나타났다 등온선 분석, '대표 결과를 참조 '). 헨더슨 - Hasselbalch이 방정식에 따라, NH 4 + 비율 : 주, [NH 3] 내선의 변화에 따라서 NH 3 NaOH로 외부 용액의 pH를 변화에 의해 설립되었다. 오차 막대는 4-7의 SEM은 복제 나타냅니다. (COSKUN 등에서 재현. 쓸데없는 횡단 자전거에 대한 신속한 암모니아 가스 수송 계좌를 NH에서 식물 뿌리에서 3 / NH 4 + 독성. 공장 Physiol. 163, 1859에서 1867 사이 (2013).)

그림 2 NH 4 + 철수 크게 낮은 (0.1 밀리미터) K + 높은에서 성장 그대로 보리 모종의 뿌리에서, 정상 상태에서. K +의 유입 채널 매개 K + 유입을 자극하고, NH 4 +의 철수시 (10 mM)을 NH 4 +. 자극 K + 유입에 K + - 채널 차단제 (10 MM의 티 +, 5 mM의 바 2 +, 10 mM의 고사 +)의 효과는 발음. 일원 분산 분석과 Dunnett의 다중 비교 사후, 별표 * 0.01 <P <0.05, *** P <0.001 -NH 4 + 및 치료 쌍 (사이에 의미의 서로 다른 수준을 나타냅니다테스트). 괄호 안의 별표 제어 및 -NH 4 + 쌍 (학생의 t의 -test) 사이에 의미의 수준을 나타낸다. 오차 막대는> 4 회 반복의 SEM을 나타냅니다. (보리와 애기 장대. 공장 Physiol. 162, 496-511 (2013)의 뿌리 COSKUN 등. 용량 및 칼륨 채널과 높은 친 화성 수송의 가소성에서 재현.)

그림 3 K + 유출 채널 매개 낮은 K가 + 조건하에 정상 상태보기 (1 ㎜) 낮은 (0.1 밀리미터) K + 및 중간에서 성장 그대로 보리 모종의 뿌리에 42 K + 유출 NO 3 -.하고, (t에서 = 15.5 분, 화살표 참조) 즉각적인 효과를 10 mM의 웹 기반 협동 학습의, 5 mM의 K 2 SO4 및 5 mM의 (NH 4) 유출 2 SO 4. 각 플롯은 3-13 회 반복 (SEM <평균의 15 %)의 평균을 나타냅니다. (. COSKUN 등 규제 및 보리 뿌리에서 칼륨 방출 메커니즘에서 재현 :. 란타에서 42 K + 분석 새로운 피톨을 188, 1028에서 1038 사이 (2010)..)

표 1 정상 상태 K + 플럭스와 C다양한 N의 규정에 따라 ompartmentation 정상 상태 플럭스 및 0.1 mM의 K +에서 성장 보리 모종의 compartmental 분석, 중 중간 NO 3 -. (1 ㎜, 칼슘 염) 또는 높은 NH 4 + (10 mM의 같은 SO 4 2 소금). 오류> 8 회 반복의 ± SEM을 나타냅니다. 1028에서 1038 사이 (2010, 188 란타에서 42 K + 분석 새로운 피톨을) 및 COSKUN 등 용량 및 칼륨 채널과의 가소성 높은 :... (COSKUN 등 규제 및 보리 뿌리에서 칼륨 방출 메커니즘에서 재현. 보리와 애기 장대. 공장 Physiol. 162, 496-511 (2013)의 뿌리 친 화성 수송.)

저자는 공개할 것이 없습니다.