Summary
Utilizzando due metodi per stimare l'espressione genica nei principali appendici gustative di Aedes aegypti, abbiamo individuato il set di geni putativamente sottostanti le risposte neuronali di composti amari e ripugnanti, come determinato da un esame elettrofisiologico.
Introduction
Composti come DEET, Picaridin, Citronellale e IR3535 hanno dimostrato di respingere in modo efficace le zanzare, comprese le importanti vettori della malattia Aedes aegypti 1,2. Registriamo potenziali d'azione dei neuroni sensoriali associati a specifici sensilla gustativa per determinare le cellule coinvolte con repellenza zanzare. Accoppiato con sequenziamento valle di geni espressi in questi tessuti, possiamo identificare i geni più probabile che mediano le risposte di queste cellule per lo screening di nuovi composti per le capacità repellenza migliorate.
RNA-Seq è uno strumento potente, diventando rapidamente standard per il rilevamento delle modifiche temporali e spaziali in espressione genica. RNA-Seq analisi di appendici chemosensoriali insetti e gli organi sono stati utilizzati per scoprire recettori molecolari in diverse specie di insetti 3-5, migliorando notevolmente il convenzionale PCR-ricerche gene per gene 6. Gli insetti rappresentano la classe degli animali più diversi, presentano molte opportunità di studiare la connessione tra geni e fenotipi unici. Tecnologia RNA-seq può essere impiegato su qualsiasi tessuto vivente insetto. Allo stesso modo, la registrazione elettrofisiologica da cellule sensoriali all'interno uniporous sensilli gustativi può essere raggiunto in molte diverse specie di insetti. L'abbinamento di queste due tecniche permette ai ricercatori di restringere i geni coinvolti set in un fenotipo chemosensory osservato. Diverse specie presenteranno sfide specifiche, ma possono informare il collegamento tra i geni dei recettori chemosensoriali e un adattamento chemosensory. Le dimensioni e la morfologia dei chemosensory sensilli è variabile e rendere necessario l'risoluzione dei problemi durante la registrazione di potenziali di azione per ridurre il rumore e identificare segnali ripetibili. Dissezioni di organi chemiosensoriali possono essere banale o delicati e richiede tempo, a seconda della morfologia e dimensioni dell'insetto. Recupero di RNA di alta qualità può richiedere un po 'di risoluzione dei problemi e, come ad esempio evitare alcuni pigmenti durantecollezione tessuti.
Mentre dimostrare gli effetti dei composti repellenti attraverso studi comportamentali è diretta e informativo, questo approccio è tempo intenso e largo rispetto al meccanismo d'azione. Elettrofisiologia accoppiato con RNA-Seq consente analisi più specifiche su ciò che spinge a comportamenti di evitamento insetti. Una volta che il "toolkit" della discriminazione chimico è stato identificato in una specie di insetti, i tentativi più specifiche per migliorare il repellenti conosciute sono possibili. Recettori e proteine associate a cellule sensoriali responsabili di questi comportamenti possono essere espressi heterologously per lo screening chimico diretta. Inoltre, modellistica molecolare in grado di prevedere quali sostanze chimiche si suscitare reazioni forti da questi recettori 7.
L'istantanea di tutti i geni attivi in una serie limitata di tessuti chemosensoriali può anche essere utile per identificare geni simili in altre specie. Utilizzando omologia di sequenza e di espressione similarities, i ricercatori possono formare gruppi di recettori molecolari più probabile che mediano le risposte a repellenti che sono ampiamente efficaci sugli insetti. Vi presentiamo il seguente protocollo per aiutare i ricercatori a decostruire percorsi chemosensoriali insetti e di convincere di più per approfondire la neuroetologia di non-modello e insetti economicamente importanti.
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Protocol
1. allevamento Ae. adulti aegypti
- Le uova si schiudono in circa ¾ di pollice in acque poco profonde cassetto. Sovraffollamento ridurrà la dimensione degli adulti.
- Larve posteriore a 25 ° C (12-HL: 12-HD) ed alimentare con cibo per pesci a terra.
NOTA: sovralimentazione può ridurre i tassi di sopravvivenza. - Rimuovere pupe individualmente da pipetta Pasteur quotidiano e trasferimento in piatti di plastica (9 centimetri × 5,5 centimetri) all'interno secchielli di contenimento con fini coperchi maglia, stabilendo così 24 gruppi di età hr.
- Mangimi zanzare adulte soluzione al 10% di saccarosio dal batuffolo di cotone collocato sulle pareti schermo di un contenitore gabbia le zanzare in una camera climatica a 27 ° C e 70% di umidità relativa sotto la stessa fotoperiodo come larve.
- Per elettrofisiologia, utilizzare 5-10 giorno animali vecchi. In generale, gli animali più grandi produrranno risultati migliori. Per l'isolamento di RNA, usare gli animali che si trovano all'interno di un unico 24 ore raggruppamento età nel vecchio campo di 5-10 giorni.
- Determinare una concentrazione adeguata di elettroliti (ad esempio 1-10 mm) suscita l'attività minima da neuroni sensoriali selezionati. 10 mM NaCl o 1mm KCl sono elettroliti ragionevoli per testare l'attività di base quando si inizia un esperimento.
- Sciogliere ogni chimica sperimentale nel solvente appropriato (se non l'acqua, usare etanolo o DMSO) che ha poco o nessun effetto sulla attività picco rispetto all'elettrolito sola. Le concentrazioni finali di 10% etanolo o 1% DMSO sono concentrazioni iniziali ragionevoli.
- Selezionare appropriata (ad esempio il chinino per amaro o di saccarosio per dolci) i prodotti chimici di controllo che sono ben descritti, deterrenti alimentazione o stimolanti negli insetti.
3. Elettrofisiologia (registrazione punta 8; Figura 1)
- Elettrodi di vetro Form tirando meccanicamente capillari di vetro. Ottimizzare il calore e tirare le impostazioni di tirare vetro per formare recordi opportunamente sagomataElettrodi ng. Rompere con cautela fine del elettrodo di vetro con pinze sotto un microscopio da dissezione per creare elettrodo punta apertura che è sufficientemente ampia per busta bersaglio sensillum, ma abbastanza piccolo per evitare il contatto con le strutture vicine.
- Al microscopio, identificare visivamente dalla morfologia e posizionare il target sensilla / sensillum per garantire la ripetibilità della registrazione punta. Animali Prep per consentire l'accesso gratuito al sensilla dall'angolo di entrata dell'elettrodo.
- Freddo insetti anestetizzare adulti in freezer a -20 ° C. Evitare danni ai neuroni periferici da sovraesposizione a temperature fredde. Tagliare sottili strisce di nastro adesivo con lama di rasoio sul vetrino. Immobilizzare intero insetto su un vetrino con strisce strette.
- Inserire un filo di tungsteno affilata chimicamente nel torace dorsale o occhio per servire come indifferente (terra) dell'elettrodo.
- Riempire elettrodo vetro fatto a passo 3,1 con una soluzione stimolante di interesse. Utilizzando una siringa inserita, compilare capIllary dalla fine tirato a Blunt fine. Rovesciare tutte le bolle d'aria, tenendo fine abbattuto. Inserire un filo d'argento (chloriding opzionale) nell'elettrodo di vetro fatto a passo 3.1 per servire come elettrodo di registrazione e stimolante.
- Collegare gli elettrodi ad un preamplificatore che è stato progettato per registrazioni da contatto chemoreceptive sensilli negli insetti. Questo preamplificatore (300 Hz-3 kHz filtro passa-banda) ridurrà il tempo di assestamento di catturare l'attività neuronale più vicino allo stimolo introduzione possibile. Raccogliere, archiviare e analizzare i segnali elettrici con un microcomputer dotato di software di registrazione picco.
NOTA: Messa a terra del sistema di registrazione correttamente può migliorare drasticamente il rapporto segnale-rumore. - Stimolare sensilla con una soluzione di controllo (solo elettrolita) per garantire la funzionalità. Conte picchi a partire 200 msec seguito l'artefatto stimolo per tutte le preparazioni.
- Casuale l'ordine di sostanze chimiche di prova per tutti gli esperimenti, tranne studi dose-risposta,per eliminare pregiudizi. Per gli studi dose-risposta, esporre sensilla ad aumentare concentrazioni della sostanza chimica sperimentale. Lasciare un minimo di 3 minuti tra stimoli al fine di garantire un adeguato recupero.
NOTA: Questo requisito può variare a seconda degli insetti e sensilli. Soglia è definita come quella concentrazione per cui errore standard non si sovrappone con l'errore standard per la concentrazione più bassa testata.
4. RNA Isolamento e Sequencing (Figura 2)
- Preparare i pestelli RNasi-free ermetici da loro raffreddamento in ghiaccio secco prima di tessuto disruption.Prepare accompagnano pestelli RNasi-free che si adattano provette con tappo a scatto saldamente. Tenere tubi di raccolta chiusi a meno dissezione attivamente per evitare eccessiva formazione di condensa.
- Utilizzando aspiratore filtrato, mettere da 30 a 40 le zanzare-anestetizzato freddo (15 sec in -20 ° C freezer) sul palco freddo e mostra per il sesso. Luogo animali dorsale lato negativo, afferrare le ali per non danneggiare appendici gusto.
- Utilizzando due coppie di pinza sottile, sezionare Paired Labella o tarsi da maschi o femmine sotto un microscopio da dissezione e limitare l'inserimento di tessuti adiacenti.
NOTA: 500 Labella accoppiato produce circa 800-1000 nanogrammi di mRNA totale. 400 tarsi individuale (5 segmenti ciascuno) produrranno 1,200-1,800 nanogrammi di mRNA totale. - Con un paio di Ansimare-pinze, leggermente cogliere proboscide zanzara solo prossimali di Labella esporre mandrini interni. Utilizzando altra coppia di raccolta-pinze, rimuovere Labella e aggiungere tessuto lato del tubo di raccolta a freddo.
- Con un paio di pinze, leggermente cogliere gamba zanzare allo svincolo di tibia e primo segmento tarsale. Utilizzando altra coppia di pinze, rimuovere tarsi e aggiungere tessuto lato del tubo di raccolta a freddo.
NOTA: Prendere in considerazione i tipi di cellule a livello di interfaccia del tessuto desiderato e indesiderati. Mentre è importante limitare l'inclusione di tessuto limitrofo, è altrettanto importante non omettere porzioni di tessuto desiderato. Il ficampione finale deve rappresentare accuratamente l'intero organo di interesse. Creare un confine preciso con le pinze di presa in modo tale che una pinza di raccolta possono liberare proprio raschiando o afferrare solo il tessuto desiderato. - Periodicamente, spin down tubo di raccolta brevemente 0 ° C centrifugare a 9.000 xg per mantenere il tessuto sul fondo della provetta. Se l'umidità si accumula nei tubi di raccolta durante la dissezione, aggiungere 50ul di freddo reagente Trizol per coprire il tessuto raccolti.
- Utilizzando anti-macchia marcatore laboratorio, etichetta chiaramente uno senza RNase 1,5 ml schiocco provetta con tappo per ogni tipo di tessuto per la raccolta. Usando 1,5 ml provetta rack e azoto liquido, congelare poi macinare tessuto in polvere fine (pezzi pregiati se in Trizol). Ripetere una volta. Portare il volume totale di Trizol a 1 ml e sospendere nuovamente il tessuto terra nel vortex.
- Aggiungere 200 ul di cloroformio e mescolare accuratamente. Dopo 5 min a temperatura ambiente, centrifugare a centrifugare a 4 ° C e 11.000 xg per 15 min. Attentamenteaggiungere strato acquoso direttamente ad una colonna filtro DNA genomico. Spin down a 11.000 x g per 5 min. Aggiungere uguale volume di RNase-free etanolo al 70% a flusso continuo e mescolare pipetta. Trasferire il liquido a una colonna collezione RNA e continuare l'estrazione di RNA secondo le istruzioni fornite.
- Quantificare e valutare la purezza di RNA totale su uno spettrofotometro di precisione e procedere con qualsiasi metodo di sequenziamento RNA standard.
5. quantitativa RT-PCR convalida di RNA Sequencing (Figura 3)
- Selezionare come molti geni come possibile confrontare i livelli di espressione genica relativi su una gamma dinamica, sia in previsto abbondanza sequenza e la funzione del gene chemosensory presunta.
- Coppie di progettazione di primer per ogni gene target per amplificare uno specifico prodotto della PCR 100-180 paio di basi. Escludi non specifico di amplificazione gDNA garantendo almeno un fondo per set estende un confine introne. In alternativa, utilizzare il trattamento DNasi per ridurre la contaminazione genomico.
- Raccoglieretessuto insetto come descritto nel paragrafo precedente. Calcolare la quantità di tessuto è necessario per fornire abbastanza RNA per completare tutte le reazioni qRT-PCR.
NOTA: triplice copia biologica e reazioni triplicate tecnici forniranno la massima fiducia nei risultati. - Calcola relativa quantificazione gene come X bersaglio - (Ct [destinazione] -Ct [riferimento]) per ogni gene target e media per ogni replica, sia biologico e tecnico. Utilizzare gene housekeeping (s) per normalizzare valori Ct tra i replicati biologici e di sradicare la scala Y in confronto di espressione relativa.
- Valutare la somiglianza di RNA-Seq e dataset qRT-PCR usando la procedura di equivalenza bootstrap basato regressione-9, in modo iterativo applicato, per i dati di ogni tessuto.
NOTA: Questa procedura identifica la più piccola "regione di somiglianza" che può essere costruito intorno alla dati RNA-Seq e qRT-PCR osservata, e consentire l'espressione genica relativa come misurato da qRT-PCR da considerare statisticamente equivalente alla misurazione dell'espressione genica relativa da RNA-seq.
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Representative Results
Le registrazioni in tracce di potenziali d'azione da Ae. aegypti sensilla gustativa (Figura 1) dimostrare l'efficacia della stimolazione diretta con una gamma di prodotti chimici. Questa tecnica può essere usata per quantificare risposte a qualsiasi sostanza chimica stimolante contando punte di una data ampiezza e durata in un intervallo di tempo ragionevole (generalmente inferiore a 500 ms). Registrazioni Trace devono essere facilmente riproducibili sotto un dato insieme di condizioni sperimentali. In caso contrario, le risposte fisiologiche osservate possono rappresentare fenotipi comuni tra gli individui della specie in esame.
Dati RNA-Seq Raw richiede filtrazione e la mappatura precisa, prima di essere presentato come RPKM arrotondato (il numero di mappato legge per lunghezza kilobase di trascrizione per milione letture mappati) o FPKM (il numero di frammenti di lettura per lunghezza kilobase di trascrizione per milione letture mappate) valori numerici (Figura 2). La distinzione traquesti due metodi di normalizzazione RNA-seq è stata descritta in due opere seminali 10,11. Un vantaggio di sequenziamento mRNA totale è la capacità di rilevare l'espressione di grandi famiglie di geni simultaneamente. La presentazione visiva dell'espressione di molti geni permette contemporaneamente per una comprensione unica del set di strumenti molecolare per un dato tessuto. Il confronto tra i sessi, stadi di sviluppo o tipi di tessuto possono essere fatte rapidamente.
Replicati biologici per dataset RNA-Seq possono essere limitate dal costo o la difficoltà di raccolta dei tessuti. qRT-PCR offre la possibilità di validare i piccoli sottoinsiemi di espressione genica globale a costi minori e richiede meno RNA fonte. Side by confronto dei dati collaterali (Figura 3A) consentire una maggiore fiducia nei risultati di RNA-Seq, come i due metodi si basano su differenti chimiche per la stima gene abbondanza. Funzioni di equivalenza statistica (Figura 3B) dimostrano i limiti di certezza in ogni caso.
Figura 1: Le registrazioni elettrofisiologiche da un sensillum di medie dimensioni sul labello di Ae. femmine aegypti, modificati dal lavoro citato 12. Le tracce mostrano risposte NaCl 100 mM, di saccarosio 100 mm, 1 chinina mM, 0,8% DEET, 0,8% Picaridin, 0,8% e 0,8% Citronellale IR3535. Le tre punte con ampiezze e forme diverse sono etichettati a, b o c. Questi tre picchi corrispondono ai tre sottotipi di neuroni sensoriali con sensibilità diverse: sale, zucchero, e amaro, rispettivamente.
Figura 2:. Tabella dell'espressione genica del recettore gustativo, come determinato da RNA-Seq per 8 campioni di tessuto, modificato dal lavoro citato 13 celle singole segnalare valori RPKM perciascuna annotazione gene gustativa, tessuti maschili (a sinistra) e tessuti femminili (a destra). I valori numerici sono arrotondati al decimo. Heat-map intensità del colore è limitato a massimo RPKM e il punto medio viene scalato per ogni famiglia di geni singolarmente. C'è solo un gene di famiglia mostrato in questo caso. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3:. Confronto dei dati qRT-PCR e dati RNA-seq, modificati dal lavoro citato 13 (A) Ogni gene chemorecezione dell'asse orizzontale è rappresentato da due colonne di dati. La colonna di sinistra rappresenta l'espressione relativa come determinato da RNA-Seq; Valori RPKM di geni chemorecezione sono stati divisi da quella gene housekeeping Aaeg LASP generare proporzioni numeriche in questo tessuto. Il dirittocolonna rappresenta espressione relativa come determinato da qRT-PCR. In primo luogo, repliche biologico valori Ct per i geni Labella sono stati normalizzati utilizzando Aaeg LASP come standard. In secondo luogo, replicare valori Ct per ogni gene sono stati utilizzati per calcolare i valori di espressione relativa (bersaglio E - (Ct [destinazione] -Ct [riferimento])). Le barre di errore indicano la deviazione standard dei valori relativi di espressione calcolati singolarmente. (B) RNA-Seq e qRT-PCR set di dati sono stati confrontati in un'analisi separata. Gli assi verticali rappresentano relativa abbondanza gene come dimostrato dai dati RNA-seq, con un valore di 1 è attribuito al gene housekeeping Aaeg LASP e tutti gli altri genica stati segnalati relativi a questo valore. Gli assi orizzontali rappresentano relativa abbondanza gene come previsto da qRT-PCR, con un valore di 1 è attribuito al gene housekeeping Aaeg LASP e tutti gli altri genica stati segnalati relativi a questo valore. Le linee rosse rappresentano l'equivalenza esatta. Le linee tratteggiate rappresentano confini della 'zona di somiglianza' per slope, calcolato l'algoritmo di equivalenza statistica 9. Linee nere continue rappresentano la minimi quadrati di regressione di qRT-PCR equivalenza RNA-Seq quantificazione dei 12 geni bersaglio e Aaeg LASP gene housekeeping, ognuno rappresentato da punto dati cerchio. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
L'aspetto più impegnativo di potenziali d'azione di registrazione da sensilla gustativa è decidere quali risposte sono "normali". Quando impiegando singolo sensillum gustativa punta registrando la prima volta per una determinata specie di insetti, il numero totale e sensibilità dei neuroni recettori gustativi (GRN) sono probabilmente sconosciuta. Molte registrazioni preliminari vengono prima tenuti a decidere la gamma e le concentrazioni di sostanze chimiche da testare. In questo caso, abbiamo cominciato con l'osservazione che un singolo GRN risposto a basse concentrazioni di DEET (Figura 1). Successivamente, abbiamo esaminato risposte all'interno dello stesso sensillum a un intervallo di concentrazioni di sostanze chimiche notoriamente amaro o repulsivo ad altri insetti e osservato un picco di forma simile e ampiezza (Figura 1). Queste osservazioni hanno suggerito che un unico sottotipo GRN risponde a questi composti avversi. Per confronto, abbiamo testato composti zuccherati noti per stimolare l'alimentazione in mosquitoes per vedere se si è verificato un picco simile. Abbiamo osservato un diverso, picco più grande in questo caso. Allo stesso modo, abbiamo osservato un terzo, picco intermedio di dimensioni in risposta alla stimolazione sale, portando il totale conteggio GRN sottotipo a tre.
Preparazioni di registrazione elettrofisiologici in insetti sono intrinsecamente variabile. Obiettivo sensilli gustativi sono in genere molto piccoli e deve essere posizionato ad angolo adeguato per accedere con l'elettrodo di registrazione senza toccare il vetro per la cuticola. Per stabilire un ponte conduttivo neuroni gustative, il poro terminale del sensillum deve essere aperta per la linfa contenuta di stabilire un contatto diretto con elettrolita dell'elettrodo di registrazione. Abbiamo osservato il blocco delle aperture sensilli sia da corpi estranei o escreti e materiale essiccato all'interno del sensillum bersaglio. Per evitare questi ostacoli, la cura deve essere presa quando l'allevamento e la manipolazione insetti per evitare il contatto con il sensilli bersaglio. Oltre alla scelta finalecantare intatti, insetti prova sane, fattori biologici come l'età, lo stato di alimentazione, accoppiamento stato e zeitgeber tempo dovrebbe essere considerato al momento di stabilire i controlli per ridurre la variabilità nelle registrazioni.
Può essere difficile ottenere una preparazione reattivo coerente. Molti studi può essere necessario per migliorare il rapporto abbastanza segnale-rumore per risolvere singoli picchi. Variazioni sperimentali sulle preparazioni summenzionate possono portare a risultati migliori. Si consiglia di stabilire una risposta forte sul vostro apparecchio di registrazione per la vostra specie di test utilizzando un comune picco elicitore insetto, come saccarosio o chinino. Una volta che un sensillum gustativa risponde, queste risposte dovrebbero essere riproducibile. La lunghezza minima di tempo tra stimoli deve essere determinato in via sperimentale l'esame dinamiche picco sotto diversi vincoli temporali. Stimolazione eccessiva dovrebbe essere evitato per preservare GRN salute e prevenire sensillum degrado linfa. Nel caso thasensibilità di risposta t diminuisce rapidamente dopo la prima stimolazione, un maggior numero di preparazioni deve essere ottenuto per fornire fiducia che queste risposte sono fisiologicamente tipico per specie esaminate.
La solubilità di alcune sostanze chimiche di prova può creare difficoltà a fare elettrodi stimolanti, come alcuni solventi possono influenzare l'attività GRN, anche a basse concentrazioni finali. Queste considerazioni possono essere affrontate attraverso prove ed errori e con controlli appropriati. Qualsiasi solvente utilizzato deve essere aggiunto l'elettrolita di controllo e altre soluzioni di test per garantire la coerenza delle risposte. Piccoli insetti immobilizzante, fornendo così un accesso diretto al bersaglio sensilla senza danneggiare i tessuti fragili, possono richiedere prove ed errori.
Il limite principale di elettrofisiologia è sfortunata separazione delle risposte neuronali osservati e potenziali risposte comportamentali a valle. Pertanto, è vantaggioso testare risposte a sostanze chimiche che hanno Been dimostrato di suscitare risposte comportamentali specifici, al fine di discutere il significato dei risultati in un contesto ecologico. Registrazioni Tip consentono la rilevazione molto accurata di attività cellulare, rendendo questa tecnica ideale per valutare gli animali transgenici o che manifestano differenze fenotipiche nel comportamento. Queste registrazioni offrono anche ulteriori informazioni sulle risposte neuronali, come la dinamica temporale e ampiezza, rispetto ai sistemi basandosi su giornalisti visive di attività neuronale. In alcuni casi, le risposte neurali possono essere quantificati più facilmente di dati comportamentali 12.
Collezione Tissue per RNA-Seq e qRT-PCR è semplice, ma richiede concentrazione continua e l'attenzione a preservare il materiale cellulare tramite celle frigorifere e di evitare l'umidità in eccesso. Attività RNasi può influenzare la qualità RNA; quindi il tessuto dovrà rivolgersi unicamente superfici pulite in tutta la raccolta e l'estrazione di RNA. Anche se la risoluzione dei problemi necessario per qRT-PCR is ben documentata, le più probabili insidie si verificano nelle prime fasi del processo durante la progettazione primer e la selezione di destinazione e di pulizia geni. I geni che rappresentano prevedibilmente punti uniformemente distanziati lungo una linea di livello di espressione relativa sono utili per confrontare RNA-seq e set di dati qRT-PCR (Figura 3). Ad esempio, selezionando geni per qPCR che mostrano valori RPKM di 0, 10, 20, 30, ecc, rispettivamente, offrono un ordine prevedibile di abbondanza da testare.
RNA-Seq è riuscito a mettere in luce umile espressione di geni nel nostro sondaggio dei tessuti gustative (Figura 2). La build gene affidabile per Ae. aegypti (AaegL1.3, http://aaegypti.vectorbase.org/GetData/Downloads/) e gene prima chemorecezione identificazione 14 fatto segnando genica relativamente facile. A tal fine, gli insetti con annotazioni gene disponibili e famiglie di geni identificati interesse sistemi modello di valore. Determinare una soglia precisaper l'espressione genica contro il rumore di fondo è speculativa, ma i metodi per determinare tagli ragionevoli sono disponibili 15-17. Qui abbiamo determinato un livello RPKM di totale fiducia e di un livello più basso di RPKM diminuita fiducia sulla base di un precedente 9 con cui incorniciato nostra discussione dei risultati.
In futuro speriamo di sezionare altri tessuti chemosensoriali sia la zanzara e altri insetti economicamente importanti per ampliare la nostra conoscenza dei geni che mediano insetto repellenza. Abbiamo stabilito diversi geni candidati gustative che sono molto probabilmente mediare le risposte a composti avversi confrontando sequenze di geni di specie con i dati funzionali disponibili 13. Stiamo generando linee transgeniche di zanzare mancanti questi singoli geni chemosensoriali. Useremo registrazioni punta per valutare il ruolo di questi geni sulla capacità degli animali di rilevare repellenti conosciute e valutare le risposte comportamentali di questi mutanti a REPEllents. Nel caso che questi geni non influenzano significativamente repellenza, più risoluzione può essere necessario determinare più precisamente espressione genica o la presenza della proteina in una singola sensillum o cella. Lowly recettori espressi possono essere bersagli critici per lo screening di nuovi repellenti, insieme ai co-recettori ubiquitariamente espresso. Purtroppo, ibridazione in situ e immunolocalizzazione è dimostrato incredibilmente difficile in insetto tessuto gustativa 18.
Una volta che abbiamo stabilito quali geni mediare queste risposte e comportamenti fisiologici, possiamo esprimere questi geni in sistemi cellulari che sono suscettibili di high-throughput screening repellenti candidati. In approcci in silico che usano la modellazione strutturale 7 maggio anche essere utile nel predire quali tipi di composti saranno suscitare forti risposte da specifici recettori.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass capillary | A-M Systems | 628000 | Standard, 1.5 mm X 0.86 mm, 4" |
| Silver wire | A-M Systems | 7875 | .015" bare |
| Tungsten wire | Alfa Products | 369 | 0.127 mm diameter |
| Fine forceps | Fine Science Tools | 11252 | #5SF Inox |
| Refridgerated stage | BioQuip Products | 1429 | Chill Table |
| Preamplifier | Syntech | Taste Probe | preamplifier |
| Software for electrophysiology | Syntech | Autospike | software for electrophysiology |
| TetraMin fish food | Tetra | Tropical fish food granules | fish food ground to fine powder |
| TRIzol | Life Technologies | 15596-026 | RNA isolation reagent |
| RNeasy Plus Mini Kit | Qiagen | 74136 | includes gDNA eliminator and RNeasy spin columns |
| Nanodrop spectrophotometer | Nano Drop Products | ND-1000 | tabletop spectrometer |
| R statistics | freeware (created by Robert Gentleman and Ross Ihaka) | www.r-project.org | Use the lm function of the stats package and the equiv.boot function of the equivalence package in the R computing environment. |
| 1.5 ml tube rack | Evergreen | 240-6388-030 | Pour liquid nitrogen into a few empty wells to freeze and grind tissue. |
| 1.5 ml collection tubes with pestle | Grainger | 6HAX6 | RNase free |
| Centrifuge | Thermo Scientific | 11178160 | Spin down frozen tissue to keep at bottom of 1.5 ml tube. |
| Primer-BLAST Primer Designing tool | NCBI | n/a |
References
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