Abstract
Candida albicans biofilm utvikling på biotiske og / eller abiotiske overflater utgjør en konkret trussel for innlagte pasienter. Hittil C. albicans biofilmer har blitt studert overveiende in vitro, men det er et viktig behov for en bedre forståelse av denne dynamiske prosess under in vivo-betingelser. Vi har utviklet en in vivo subkutan rottemodell for å studere C. albicans biofilmdannelse. I vår modell flere (opptil 9) Candida -infected enheter er implantert i den bakre delen av dyret. Dette gir oss en stor fordel i forhold til det sentrale venekateter modellsystem som gjør det mulig for oss å studere flere uavhengige biofilmer i ett dyr. Nylig har vi tilpasset denne modellen til å studere C. albicans biofilm-utviklingen i BALB / c-mus. I denne modellen, modne C. albicans biofilmer utvikle innen 48 timer og demonstrere typisk tredimensjonale biofilm arkitektur. Kvantifisering av sopp biofilmer tradisjonelt analysert post mortem og krever vert offer. Fordi dette krever bruk av mange dyr til å utføre kinetiske studier, søkte vi non-invasiv Bioluminescens imaging (BLI) til langs oppfølging in vivo modne C. albicans biofilm utvikling i vår subkutan modell. C. albicans-celler ble konstruert for å uttrykke Gaussia princeps luciferasegenet (Gluc) festet til celleveggen. Bioluminescens signal frembringes av luciferase som konverterer det tilsatte substrat coelenterazine til lys som kan måles. Den BLI signal lignet celletall hentet fra eksplanterte katetre. Non-invasiv bildediagnostikk for å kvantifisere in vivo biofilmdannelse gir umiddelbare programmer for screening og validering av soppdrepende medisiner under in vivo forhold, samt for studier basert på verts-patogen interaksjoner, herved bidra til en bedre forståelseing av patogenesen av kateterinfeksjoner.
Introduction
Candida albicans er en kommensal organisme, som kan bli funnet på ulike steder av friske individer, for eksempel på huden eller som en del av mage og vaginal flora. Men i sykehus, og spesielt immunsupprimerte pasienter, kan det føre til et bredt spekter av infeksjoner 1. I slike individer, lar svekket immunsystem Candida celler til å spre ut i blodet og for å invadere dypere vev forårsaker livstruende infeksjoner. I tillegg er tilstedeværelsen av ikke-biologiske substrater så som sentralvene og innsetting av kateter, kan kunstige hjerteklaffer og ledd gi en nisje for Candida vedlegg 2. Adhesjon til slike substrater er en forutsetning for videre utvikling av biofilm, som representerer et lag av gjær og hyphal celler innleiret i ekstracellulært polymerisk materiale, vesentlig bestående av polysakkarider 2 C.. albicans kateter -associated infeksjonerer forbundet med høy dødelighet. En generell karakteristikk av biofilm er deres nedsatt følsomhet overfor kjente soppmidler, for eksempel azolene 3,4. Bare nyere klasser av soppdrepende stoffer, for eksempel echinokandiner og liposomformulering av amfotericin B viste seg å være aktiv mot kateterassosierte infeksjoner 5-7. På grunn av biofilm elastisitet til soppmidler, er terapeutiske tilnærminger svært begrenset, ofte fører til kateterfjerning og dens påfølgende erstatning som eneste løsning.
Mesteparten av vår nåværende forståelse av C. albicans biofilm-utviklingen stammer fra in vitro-studier på ikke-biologiske substrater, så som polystyren, eller plast som brukes for fremstilling av ovennevnte enheter, det vil si, silikon, polyuretan 2. Disse modellene er ganske avansert og prøver å etterligne in vivo situasjon så tett som mulig. Men disse systemer ikke involverer kontinuerlig blodstrøm og than immunsystem av verten. Dette førte til utviklingen av in vivo-modellsystemer, slik som det sentrale venekateter (CVC) modell 8-10, gebiss stomatitt modell av oral candidiasis 11 og en murin modell for kateter forbundet candiduria 12. I tillegg C. albicans biofilm-utviklingen ble studert in vivo på slimhinneoverflater, slik som de fra skjeden 13 og munnhulen 14. Vårt laboratorium bidratt med etablering av en subkutan C. albicans biofilm-modellen, som er basert på implantatet av infiserte kateterstykker på baksiden av Sprague Dawley-rotter 15. Denne modellen ble brukt i vårt laboratorium for å teste biofilm mottakelighet for flukonazol og echinokandin- narkotika 5,16, for å studere effekten av kombinatorisk behandling av diklofenak og caspofungin 17. Mer nylig har vi tilpasset dette system for bruk i BALB / c-mus 18,19. Isammenligning med andre in vivo-modeller, er den største fordelen med denne subkutan modellen mulighet til å studere flere biofilmer per dyr utviklet inne i lumen av implantert kateter stykker.
For å redusere antall forsøksdyr, har vi tilpasset denne modell for å studere utviklingen av C. albicans biofilmer non-invasiv ved hjelp Bioluminescens imaging (BLI) 18,19. Denne fremgangsmåte viste seg å være en kraftig teknikk, som kan brukes til å kvantifisere biofilmer ved å måle den spesifikke BLI signal ved området av interesse (i vårt tilfelle området implantert kateter), unngå dyreoffer. I forhold til bakterier, som kan uttrykke både genet og substratet som er nødvendig for Bioluminescens reaksjon på grunn av innføring av et bestemt lux operon 20, de fleste av de eukaryote organismer, inklusive C. albicans, er avhengig av heterolog ekspresjon av et luciferase-gen sammen med denekstern administrasjon av et bestemt underlag, for eksempel D-luciferin eller coelenterazine 21. Sannsynligvis på grunn av tilstedeværelsen av soppcelleveggen og C. albicans morfogenese, den intracellulære leveringen av substratet for luciferase-enzymet var en hovedutfordring 21. For å løse dette problemet, Enjalbert et al., 22 konstruert for en belastning, hvor en syntetisk C. albicans kodon-optimalisert versjon av genet for den naturlig utskilt Gaussia princeps luciferase (Gluc) ble fusjonert til til C. albicans PGA59 gen, et GPI- forankret celleveggprotein. På grunn av tilstedeværelsen av luciferase på celleveggen, kan problemer vedrørende den intracellulære tilgjengelighet av substratet unngås. Dette spesielle systemet ble benyttet for å studere overflate infeksjoner forårsaket av C. albicans 22. Ganske nylig, BLI ble også brukt til å følge utviklingen av orofaryngeal candidiasis og dens possible behandling 23. Slike funn støtter bruk av BLI som en lovende teknikk for å studere infeksjoner forårsaket av frittlevende celler, men også enhetsassosierte infeksjoner.
I denne studien, beskriver vi C. albicans biofilm utvikling på polyuretan kateter stykker i BALB / c mus og dens kvantifisering ved hjelp BLI. Vi gir en detaljert protokoll for in vitro-kolonisering av polyuretan katetre i løpet av adhesjon, fulgt av implantering i mus og påfølgende biofilm-utviklingen i levende dyr. Bortsett fra å måle BLI signal som sendes ut av C. albicans celler, vi også bestemme kolonidannende enheter for sammenligning med standard teknikk for biofilm sopplast kvantifisering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
MERK: Alle dyreforsøk ble godkjent av etisk komité av KU Leuven (prosjektnummer 090/2013). Opprettholde dyr i henhold til KU Leuven retningslinjer dyr omsorg.
1. C. albicans Vekst
- Tjuefire timer før initiering av dyreforsøk, forberede YPD platene ved tilsetning av 10 g gjærekstrakt granulert, 20 g bakteriologisk pepton og 15 g granulert agar. Gjøre opp volumet til 900 ml med Milli-Q vann og autoklav.
- Tilsett 50 ml steril 40% glukose. Bland godt og hell i petriskåler. La agarskålene å avkjøle og stivne.
MERK: I denne studien benytter to stammer, nemlig villtype C. albicans SC5314 - Gluc negativ belastning (referert til som WT) og C. albicans SKCA23-stamme, som er en villtype C. albicans SC5314 transformert med Clp10 :: Act1p-gLUC59 plasmid 22 .I denne belastningen (oppkalt SKCA23- ACTgLuc) Gluc ble fusjonert til det endogene PGA59-genet under kontroll av ACT1 (aktin) promoter (denne promotor er aktiv i gjær, samt hyphal stadium av fungal vekst). Denne belastningen kan bli bedt om fra laboratoriet til professor Patrick Van Dijck, KU Leuven, Leuven, Belgia. Plasmid Clp10 :: Act1p-gLUC59 plasmid 22 ble vennlig donert av professor C. d'Enfert, Institute Pasteur, Paris, Frankrike. - Opprettholde begge stammer i glyserol lager og butikk ved -80 ° C.
- Før noen eksperiment strek stammer på en YPD plate. Inkuber platen ved 37 ° C over natten.
2. Kateter Pieces Forberedelse
- Før eksperimentet, bestemme hvor mange katetre er nødvendig. Det er mulig å implantere opptil 6 kateter stykker per mus (3 katetre til venstre og tre kateter på høyre side av dyret (figur 2A).
- Tjuefire timers før dyret kirurgi, åpner pakkenalder som inneholder trippel-lumen kateter under biologisk sikkerhetskabinett. Fjern alle unødvendige deler med sterile pinsetter og kutte en del festet til kateter med en steril skalpell. Plassere hersker under plast pakke og kutte polyuretan kateter biter av nøyaktig 1 cm i henhold til skalaen på linjalen (figur 1).
MERK: Det er viktig å nevne at denne type kateter stykket er ikke lysende og derfor egnet for BLI 18,19. - Plassere maksimalt 15 kutt kateter stykker (trinn. 2.2) i 2 ml mikrosentrifugerør. Alltid fremstille tre stykker ekstra, som brukes til å spesifisere mengden av Candida-celler festet på enheten etter perioden for adhesjon.
- Supplere katetre med omtrent 1,8 ml av 100% føtalt bovint serum (FBS).
- Kraftig vortex og legge til ytterligere 100-200 mL av 100% FBS. Dekke alle kateter stykker med serum.
- Inkuber ved 37 ° C over natten.
3. Dyr og undertrykkelse av immunsystemet
- Hold BALB / c mus (ca 8 ukers alder) i individuelt ventilerte filter topp bur med fri tilgang til standard mat og vann ad libitum.
- Initiere undertrykkelse av immunsystemet 24 timer før dyret operasjon ved tilsetning av dexamethason (0,4 mg / l) til drikkevann for dyr. For å unngå enhver bakteriell forurensning av verten, supplere drikkevannet med antibiotika, f.eks, natrium-ampicillin-pulver (0,5 g / l).
- Hold immunsuppresjon av dyr under hele eksperimentet (opp til 6 dager).
4. Ex vivo C. albicans Vedheft på FBS-belagt Polyuretan Underlag
- Overføre hvert serum-belagt kateter stykke inn i en fersk 1,5 ml mikro tube.
- Skrape av noen C. albicans-celler dyrket på YPD-plater (trinn 1), og suspendere dem i 1 ml PBS.
- Fortynnet CanDida celler (1: 100) i en egen mikrosentrifuge tube. Ta 10 mL av den fortynnede prøven og anvende den på en celle telling kammer. Telle minst 16 små firkanter.
- Forbered Candida-celler (hver strekk separat) i RPMI 1640-medium til en sluttkonsentrasjon på 5 x 10 4 celler / ml.
- Tilsett 1 ml av cellesuspensjon til hver serum-belagt kateter stykke.
- Kraftig vortex og sikre at katetre er neddykket i mediet og ikke flytende på toppen.
- Inkuber kateter ved 37 ° C i 90 min (periode adhesjon).
- Fjern katetre med sterile pinsetter og vaske dem to ganger med 1 ml PBS. Under dette trinn sørge for at vaskevæsken går gjennom hulrommet ved å holde kateteret i vertikal stilling, mens meget forsiktig skylling av katetre. Viktigere, ikke bruk en sterk strøm som kan føre til fjerning av vedlagte celler.
- Overføre hver vasket kateter til en ren mikro tube (ett stykke per tuvære).
- Plasser på is og beholde der til kirurgi.
5. Anesthesia
- Forbered anestesi ved å blande 75 ul av ketamin (100 mg / ml) med 100 ul av medetomidin (1 mg / ml) og 825 ul sterilt saltvann. Administreres intraperitonealt (ip) 60 til 80 ul av anestesi cocktail per 10 g kroppsvekt, noe som resulterer i en dose på 45-60 mg / kg ketamin og 0,6 til 0,8 mg / kg medetomidin.
- For reversering av anestesi, fortynne 50 pl atipamezol (5 mg / ml) i 4,95 ml saltoppløsning, administreres ip 100 ul per 10 g kroppsvekt som motgift, noe som resulterer i en dose på 0,5 mg / kg.
- Etter injeksjon av anestesi, legg hunden i et eget bur og vente til det er helt sover.
- Bekreft riktig anesthetization av dyret ved lys hud klype og tå klype, som ikke forårsaker noen skade på huden. Alle observerte bevegelse indikerer at dyret ikke er tilstrekkelig bedøvet for å utføre operasjonen. Hvis dette skjer, vent en couple minutter lengre før dyret ikke viser noen tegn til bevegelse ved hud eller tå klype.
6. Animal Surgery
- Overføring bedøvet dyret fra buret på en ren vev plasseres på varmeputen, pre-oppvarmet til 37 ° C (figur 2A, (1)).
MERK: Et billigere alternativ er å bruke elektrisk oppvarmede tepper. Det er også mulig å anvende isoterme pads, som skal varmes opp i mikrobølgeovn før dyret kirurgi. - Påfør oftalmisk salve på øynene.
- Barbere den nedre ryggen på dyret med en elektrisk barbermaskin. Fjern alle dyrehår og overføre dyr på en ren vev. Desinfiser huden (for eksempel med 1% jod isopropanol eller 0,5% klorheksidin i 70% alkohol) og la det desinfiserte området tørke i ca 1 min (Figur 2A, (2)).
- Foreta et lite innsnitt i huden (en på venstre og en på høyre side av dyret) (ca. 0,5 &# 8211; 1 cm) (figur 2A, (3)).
- Dissekere underhuden med en saks for å lage to subkutane tunneler. Hver tunnel skal være ca 1,5 cm lang og 1 cm bred.
- Sett tre kateter stykker, tidligere infisert med Candida, i hver tunnel. Sikre at katetre ligge ved siden av hverandre i et horisontalt arrangement, og at de ikke dekker hverandre for å muliggjøre innsetning av seks kateter fragmenter totalt (figur 2A, (4)).
- Lukke snittene med sting. Alternativt kan du bruke Dermabond å lukke såret.
- Desinfisere såret meget forsiktig med 0,5% klorheksidin i 70% alkohol eller med jod isopropanol (1%).
- Anvende lokal bedøvelse (xylocain gel, 2%) direkte på såret.
- Administrere reversering av anestesi (protokoll 5, trinn 2): intraperitonealt 100 ul per 10 g kroppsvekt.
- Overføring dyr til et rent bur tidligere plassert på en varmeplate. Holde dyretseparat og varm før dyret er helt våken. I mellomtiden fortsetter med driften og implantat av neste dyr. Når alle opererte dyr er helt våken. Overføre til ett bur. Overvåke dyr regelmessig.
7. Bioluminesens Imaging: Utarbeidelse av Coelenterazine (CTZ), den Substrat for G. princeps luciferase
- Forbered fersk coelenterazine (CTZ) lager løsning ved å løse 5 mg / ml CTZ i syrnet etanol eller i henhold til produsentens instruksjoner.
- Forberede 1,2 mm Arbeids løsning ved å fortynne stamløsning 1:10 i steril PBS.
MERK: Sprøyt 100 pl CTZ arbeidsløsninger subkutant i området rundt kateter. Bruke insulinsprøyter for subkutan injeksjon av CTZ. - Alltid holde CTZ i mørket (f.eks dekke mikrosentrifugerør inneholder CTZ med aluminiumsfolie). Oppbevar stamløsning ved -80 ° C i løpet av forsøkene. 8. Bioluminesens Imaging
- Initialisere BLI kamera.
- Bedøve dyrene ved hjelp av en induksjons boks. Bruke en gassblanding av isofluran i oksygen, N 2 O / O 2, eller luft ved 2-3%.
- Etter induksjon, opprettholde anestesi i induksjons boksen og i avbildningskammeret på 1,5-2%.
- Før du starter bilde sesjon, plasserer bildeplate i posisjon A, noe som tilsvarer en FOV på 10 cm. Sørg for at riktig posisjon av anestesi uttak og dyr ved å plassere en sovende dyr i boksen.
- Ta noen få bilder til dyr er i den ønskede bildeposisjon, i FOV rett under kameraet.
- Forbered to insulinsprøyter som hver inneholdt 100 ul av den CTZ arbeidsløsning.
- Plasser ett dyr på benken og holde den i søvn ved hjelp av en nese kjegle gi gass anestesi.
- Bringe nålene i sprøytene på et sted rundt kateter subkutant og injisereden CTZ samtidig på toppen av kateter.
- Umiddelbart etter injeksjon, plasserer dyret på den varme platen i kameraet boksen og starte Bioluminescens image oppkjøpet.
- Erverve påfølgende avsøkninger med innhentingstider fra 20 til 60 sekunder (alt etter signalintensiteten) inntil det maksimale signalintensiteten er nådd. Ved kjøp av neste ramme, måle BLI signalintensitet av de tidligere ervervede rammer ved å plassere en ROI over hver katetre trio og måle foton flux gjennom denne ROI.
- Gjenta fra trinn 7 for det neste dyret (e).
- Etter bildebehandling, returnere dyr til buret sitt. Gjenta BLI i løpet av et eksperiment for langsgående, ikke-invasiv oppfølging av biofilmdannelse.
- Analysere BLI data ved hjelp av Levende bildeprogramvare. Plasser en rektangulær avkastningen av fast størrelse over hver kateter trio og måle foton flux (utstråling) gjennom hvert ROI. Gjenta dette for hvert dyr.
- Rapporterden BLI signalstyrken for hver kateter trio som foton flux per sekund. Representere BLI data på en logaritmisk skala ved å plotte gjennomsnittet og SD av fotonet flux per sekund for hver gruppe. Utføre statistisk analyse på log 10 transformerte data.
- Forbered mikrosentrifugerør inneholdende 1 ml PBS, en for hver kateteranordningen og holde dem på is.
- Avlive dyrene ved cervical dislokasjon (figur 2B, (1)).
- Desinfisere huden på ryggen med 0,5% klorheksidin i 70% alkohol eller med jod isopropanol (1%).
- Lage et snitt (ca. 3 cm) over kateter.
- Skjær underhud og fjerne kateter fragmenter en etter en fra under subcutaneous vev ved hjelp av sterile pinsetter (figur 2B, (2)).
- Håndtak kateter forsiktig i vertikal stilling og vasker den to ganger med 1 ml steril PBS. Plassere hver kateterstykket i en separat mikrosentrifugerør (fremstilt i trinn 1).
- Sonikere katetre som tidligere er lagt inn 1 ml PBS i 10 min ved 40 000 Hz i et vannbad sonikator og plassere dem på is.
- Etter ultralyd, kraftig vortex i 30 sek og sted igjen på isen.
- Forbered to ekstra mikrosentrifugerør inneholder 900 mL PBS.
- Gjør 1:10 og 1: 100 fortynninger fra din opprinnelige prøven (den som inneholder kateter) og holder alle Mikrosentrifugerør på is.
- Plate 100 ul av de opprinnelige prøver, 1:10 og 1: 100 fortynninger på YPD-agar-plater i duplikat.
- Inkuber platene i 2 dager ved 37 ° C og telle CFU.
- Telle koloniene dyrket på YPD agarplatene (tellbar mengde av kolonier, maksimum 300 kolonier / plate) og multiplisere dem med riktig Dilusjon faktor (1x-original, 10x eller fortynning 100x). Videre multiplisere hvert kateter stykke ved 10x, som svarer til den endelige mengde av kolonier i 1 ml rør inneholdende kateteret. Bringe det endelige beløpet av koloniene å logge 10 celler / kateter stykke med standardavvik (SD). Uttrykke data som en gjennomsnittlig ± SD.
- Plassere alle verdier for hver kateteret og spesifikk gruppe til et regneark og / eller statistiske program, for å utføre de ovennevnte beregninger og statistiske analyser. Indikere spesifikke grupper for å sammenligne, dvs. WT vs. mutant eller to dager vs. 6 dager biofilmdannelse og utfører uparet t-test og ANOVA med Tukey post-test på log10-transformerte data.
- Uttrykke nivået av betydning ved en p-verdi. I denne studien indikerer betydning dersom p-verdi <0,05, representert som følger: * p <0,05, ** p <0,005, *** p <0,0005.
9. Kateter Eksplantering
10. Kvantifisering av Biofilm-assosierte celler ved Colony Forming Units Count (CFU) og statistiske analyser av resultater
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I denne studien viser at det kirurgiske inngrepet av kateter implantatet og eksplantasjon under in vivo C. albicans biofilm-utviklingen i en mus. Videre viser vi kvantifisering av modne biofilmer ikke bare av klassisk CFU oppregning, men også ved å BLI.
Som vist i Figur 1A, ble det ikke-fosfor polyuretan kateter stykker skåret i 1 cm enheter, og deretter belagt med serum. Dette trinnet er svært viktig fordi det gir Candida celler til å feste til underlaget raskere sammenlignet med ikke-serum belagt implantater 15. Det er viktig å nevne at før enhver C. albicans eksperiment vi først dokumentert bakgrunnen luminescens av våre enheter 18. Dette trinnet er avgjørende før du utfører BLI fordi høy phosphorescence av enheten vil forstyrre med evalueringen av de spesifikke bioluminescente signalstyrke og signalkinetikk fra gLuc-uttrykke celler. Neste, C. albicans-celler blir inkubert med serum-belagt kateter stykker. Kateter fragmenter blir deretter implantert i den bakre delen av dyret etter subkutan snittet (figur 2A). I denne in vivo satt opp, blir to innsnitt utføres (en til høyre og en annen på den venstre siden av baksiden av en mus), etterfulgt av dannelse av subkutane tunneler inne i hvert innsnitt (figur 2A (3)). Deretter ble tre enheter, som tidligere infisert med Candida-celler, er implantert inne i hver operasjonssted (figur 2A (3 og 4)). Dette satt opp gjør at vi kan studere opp til seks biofilmer per dyr. Det er bemerkelsesverdig at to operasjonsstedene gir en mulighet til å studere biofilmdannelse av to forskjellige stammer av interesse, for eksempel villtype og mutant i det samme dyr. Figur 2B viser såret holdige katetre forut for eksplantering og etterfølgende vasketrinn.Biofilmer som er utviklet inne i bakre del av dyret ble vurdert for Bioluminescens signalmålinger. En av de representative dyr viser Bioluminescens signalet sammen med rektangler som karakteriserer de regioner av interesse (ROIs) er vist på figur 3. Etter den siste BLI tidspunkt, blir katetere eksplantert, sonikert og deretter vortex-blandet og videre undersøkt for biofilm-dannende celler kvantifisering av CFU. Data analyser demonstrere Logg 10 CFU innhentet fra hver kateter stykke etter biofilm utvikling og explantation er vist i figur 4A. I tillegg, ble CFU sammenlignet med BLI signalintensitet, og disse data er vist i figur 4B. Nitti minutter etter implantasjon en klar BLI signal blir produsert av ACTgLuc -expressing biofilmer mens det i villtypestammen, knapt noe lys blir produsert; Intensiteten av lyset detekteres fra ACTgLuc -expressingbiofilmer er betydelig øker som biofilmen dannes, her ved å følge samme mus (figur 4C). Denne økning i lyst følger den samme trend som økning i CFU per biofilm (figur 4A). I våre forsøk har også observert at en vanlig vill-type stamme (ikke konstruert for å uttrykke luciferase) også resulterer i produksjon av lys ved tilsetning av substratet. Imidlertid foton fluks var betydelig lavere enn det som ble oppnådd for den konstruerte belastning.
Til sammen våre data viser at BLI er en kraftfull teknikk for å overvåke og kvantifisere in vivo modne C. albicans biofilmdannelse i en subkutan musemodell.
Figur 1: Fremstilling av polyuretan-enheter Polyuretan del av kateteret skåret i 1 cm store stykker.. Plast pocKet inneholder kateter er åpen under sterile forhold og alle deler, unntatt kateter er fjernet fra pakken. Dernest plasserer hersker under plastlomme og kuttet nøyaktig 1 cm polyuretan stykker. Slike anordninger blir deretter distribuert til mikrosentrifugerør (max 15 stykker / rør) og neddykket i 100% føtalt bovint serum, etterfulgt av inkubasjon over natten ved 37 ° C.
Figur 2: Store steg under dyret kirurgi. (A) Fremgangsmåte for kateter implantatet. (1) Plasser bedøvet dyret på en varm pad som inneholder papir vev og anvende oftalmisk salve på øynene. (2) Barber nedre del av ryggen og desinfisere. (3) Lag to små (ca. 0,5 cm) innsnitt gjennom huden på venstre og på høyre side av ryggen. Lag subkutan tunnel inne hvert innsnitt og plassere tre katetre inne. (4) Lukk wo und med sting og sted dyr på en varm pad for å komme seg. (B) Prosedyre for kateterfjerning. (1) Plasser ofret dyr på en pad og desinfisere de opererte side inneholder kateter. Skjær såret rett ovenfor katetre. (2) ta ut hvert kateter forsiktig og vaskes to ganger med 1 ml PBS. Plasser til egen mikrosentrifugerør.
Figur 3:. Bioluminesens signal måling In vivo BLI bilde fra en representant mus avbildes etter seks dager med biofilm utvikling. Kvantifisering av signalintensiteten blir utført ved å plassere en region av interesse (ROI) (rektangulær) rundt kateter, etterfulgt av måling av foton fluksen per sekund gjennom hver ROI.
fig4highres.jpg "/>
Figur 4: Kvantifisering av modne Candida albicans biofilm av kolonidannende enheter (CFU) og ved BLI. (A) I vivo modne C. albicans SKCA23- ACTgLuc og SC5314 (WT) biofilm kvantifisering av Log10 CFU etter 90 min, 2 dager og 6 dager av biofilm utvikling. (B) Bioluminesens signalintensitet kvantifisering fra in vivo biofilm dannes av SKCA23- ACTgLuc og C. albicans WT. Signal ble bestemt etter 90 minutter (perioden av adhesjon), 2 dager og 6 dager av biofilm utvikling. Som kontroll brukte vi mus som var implantert med ikke-kolonisert katetere og som ble subkutant injisert med CTZ. Fotonet flux oppnådd i disse musene resulterer i vår bakgrunn signal (BG). Data ble uttrykt som gjennomsnitt ± standardavvik (SD). Statistisk signifikans er angitt som følger: * p <0,05, ** p <0,005, *** p <0,0005.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bruk av dyremodeller, og spesielt gnagermodeller, for studier dedikert til mikrobiell biofilm er svært viktig som vert immunsystemet er en viktig faktor i biofilmdannelse som in vitro modeller ikke kan gjøre rede for. I denne studien, beskriver vi en relativt enkel subkutan C. albicans biofilm musemodell, som lett kan vedtas i et forskningslaboratorium, og krever ikke sterke tekniske ferdigheter. Denne modellen ble opprinnelig utviklet for å studere Staphylococcus epidermidis biofilmdannelse i en rotte 24.
I det presenterte modellen ble serum-belagte katetere polyuretan utfordret med Candida-celler ex vivo i løpet av adhesjon (90 min, 37 ° C). Denne første in vitro trinn kan betraktes som en begrensende faktor på grunn av mangel på immunsystemet i de aller første stadiene av biofilm infeksjonsprosessen. Etter heft og førKateteret implantat, er ikke-enhet tilknyttet cellene fjernes ved vasking. Unngå vasketrinn etter at perioden med vedheft kan skape ukontrollerbar mengde celler knyttet til enheten. På grunn av denne grunn foreslår vi å vaske katetre før implantatet, og derfor, for å initiere utviklingen fra holdes celler. Etter denne første periode adhesjon, katetre inneholder ca. 2,0 til 2,5 log 10 CFU / enhet spredt langs kateterets lumen 15. I løpet av denne fasen Candida danner bakterie rør, som er festet på substratet.
For å ligne situasjonen i innlagte pasienter, hvorav immunforsvaret er ofte kompromittert, vi immunsupprimerte rottene i vår subkutan modellsystem 15. Partiell nedskrivning av immunsystemet hos en rotte, før enheten implantasjonen og gjennom hele perioden av biofilm utvikling resulterte i økt reproduserbarheten av biofilm-dannende celler som er hentet frakatetre implantert i samme vert og også fra enheter hentet fra flere dyr. På grunn av disse funnene foreslår vi å immunosuppress musene før kateter implantat og også i løpet av biofilmdannelse. Men resultatene viser at variasjonen i immunkompetente mus er mye mindre sammenlignet med det som ble observert i rotter, noe som gjør at mus-modellen system også er egnet for å studere rollen til vertens immunsystem i biofilmer. I vår opprinnelige rottemodell og også i den samme modellen oversatt til mus, modne C. albicans biofilmer utvikle innen 48 timer demonstrert av den tilsvarende mengde CFU og biofilm arkitektur mellom 2 og 6 dager 15,18,19.
Subkutan biofilm modellen ble brukt til å følge biofilm utvikling av flere mutanter 15. Det er blitt vist tidligere av Nobile et al. 25 at C. albicans BCR1 Δ / BCR1 Δ ikke klarte åskjema biofilmer i et sentralt venekateter (CVC) modell. Denne stammen vist rudimentære biofilm funksjoner i vårt subkutan modellen peker mot det faktum at de fenotypiske forandringer funnet i CVC-modellen kan bli reprodusert i det subkutane modell 15.
I sammenligning med andre eksisterende modeller, f.eks., CVC modell eller protese stomatitt modell 8,9,11, lar det subkutane modellen for å følge biofilm-utviklingen i flere kateter stykker oppnådd fra ett dyr, for derved å redusere antall dyr er nødvendig for biofilm studier. Til tross for disse fordelene, kan en brist være mangel på blodstrøm som kan føre til visse tap av næringsstoffer i biofilmen. Derfor, på sikt av nærings forsyninger og miljøforhold, er det subkutane modellen mer knyttet til enhetsassosierte infeksjoner utviklet på felles proteser, taleproteser og pacemakere enn de som er dannet på intravenøse katetre. Enda viktigeresette rotte subkutan biofilm system til mus laget denne dyremodell kompatibel med BLI, noe som ytterligere reduserer kostnadene og viktigst, antall nødvendige dyr. Videre sette rottemodellen til mus muliggjør bruk av transgene musemodeller for å studere vertsfaktorer som er relevante for kateterassosiert infeksjon studier.
Den store fordel med å bruke BLI å kvantifisere biofilmer i levende dyr ligger ikke bare i den ikke-invasive karakter av denne metoden, men også i dens evne til å tilveiebringe dynamisk informasjon om utviklingen av en infeksjon. I denne studien, Gluc uttrykt på celleveggen C. albicans tillatt bedre tilgjengelighet og direkte interaksjon med underlaget coelenterazine, som er avgjørende for en påvisning av selvlysende signal in vivo. I studiet av Vande Velde et al. 18, var vi i stand til å følge den bioluminescent signal fra C. albicans biofilmer utviklet på foreiGN kropper in vitro. Den BLI signalintensitet sterkt korresponderte med data innhentet fra flere biofilm kvantifisering teknikker, dvs. CFU målrettethet og XTT reduksjon analyse. Ved siden av disse resultatene, vi viste at bioluminescent signal fra in vivo biofilm var i samsvar med mengden av biofilm-assosierte celler utvinnes fra eksplanterte biofilm. I tillegg Vande Velde et al. 18 viste at BLI kan brukes til å følge biofilm utvikling av en villtype og også av C. albicans bcr1Δ / bcr1Δ (biofilm-manglende stamme) i det samme dyr samtidig. Slike funn sterkt støtter bruk av BLI under studiene dedikert til å vurdere den tiden løpet av biofilm utvikling og infeksjon i samme dyr.
Herved, beskrev vi en eksperimentell prosedyre for in vivo subkutan implantat av Candida -infected enheter med påfølgende overvåking of in vivo biofilm utvikling av BLI. Til sammen BLI viste seg å være en pålitelig teknikk, som tillater oss å følge en infeksjon over tid unngå dyreofre på hvert tidspunkt av dataanalyser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne hevder at de ikke har noen konkurrerende økonomiske interesser.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Yeast extract granulated | Merck | MERC1.03753.0500 | |
| Bacteriological peptone | Oxoid | LP037B | |
| Agar granulated | Difco | 214530 | |
| D-(+)-glucose | Fluka | 49159-5KG | |
| Phosphate buffered saline | Prepared in the laboratory | for 1L of 10x PBS: 80 g NaCl, 2 g KCl, 14.4 g Na2HPO4, 2.4 g KH2PO4 | |
| RPMI1640 with L-glutamine and without sodium carbonate | Sigma | R6504-1L | Prepare according the protocol for Candida albicans drug susceptibility testing |
| 3-(N-Morpholino)propanesulfonic acid (MOPS) | Sigma | M1254 | MOPS is used to adjust the pH of RPMI medium (pH 7.0) |
| fetal bovine serum (FBS) | Sigma | F7524 | |
| Polyurethane tripe-lumen intravenous catheter piece (2.4 mm diameter, Certofix Trio S730) | BBraun | CV-15703 | Polyurethane part cut into 1 cm pieces |
| Dexamethasone | Fagron SAS, France | 611139 | Immunosuppressant (stock solution 10 mg/ml) |
| Ampicillin | Duchefa Biochemie, The Netherlands | A0104 | Antibacterial prophylaxis |
| Ketamine 1000 | Pfizer | 804 119 | Anesthetic |
| Domitor | Pfizer | 134737-1 | Anesthetic |
| Antisedan | Pfizer | 134783-2 | Reversal of anesthesia |
| Xylocaine gel (2%) - this is Linisol | AstraZeneca | 352 1206 | Local anesthetic for the skin |
| Terramycin/ polymyxin-b ophthalmic ointment | To prevent drying and infection of eyes | ||
| Coelenterazine | Prolume (Nanolight) | NF-CTZ-FB | Light sensitive agent (must be kept in the dark) |
| Iodine isopropanol (1%) | 3M™ DuraPrep™ | Disinfectant for the skin | |
| 0.5 % chlorhexidine in 70 % alcohol. | Cedium | Disinfectant for the skin | |
| Equipment | |||
| Cell counting chamber | |||
| Insulin syringes (0.3 ml) | Terumo Myjector 29G | 324826 | For injection of coelenterazine |
| Electric razor | For small animals | ||
| Sterile surgical tools | Scissors, 2 pairs of tweezers, scalpel | ||
| Heating pad | Leica | 14042321474 | |
| Skin suture | Johnson&Johnson | K890H | Surgical thread, needle |
| Water bath sonicator | Branson 2210 | ||
| BLI camera (IVIS Spectrum) | Perkin Elmer, Alameda | IVISSPE | |
| Living Image software | Perkin Elmer, Alameda | (version 4.2) |
References
- Yapar, N. Epidemiology and risk factors for invasive candidiasis. Ther Clin Risk Manag. 10, 95-105 (2014).
- Tournu, H., Van Dijck, P. Candida biofims and the host: models and new concepts for eradication. Int J Microbiol. 2012, 845352 (2012).
- Taff, H. T., Mitchell, K. F., Edward, J. A., Andes, D. R. Mechanisms of Candida biofilm drug resistance. Future Microbiol. 8 (10), 1325-1337 (2013).
- Mathé, L., Van Dijck, P. Recent insights into Candida albicans biofilm resistance mechanisms. Curr Genet. 59 (4), 251-264 (2013).
- Kucharíková, S., et al. Activities of systematically administered echinocandins against in vivo mature Candida albicans. biofilms developed in a rat subcutaneous model. Antimicrob Agents Chemother. 57 (5), 2365-2368 (2013).
- Kuhn, D. M., George, T., Chandra, J., Mukherjee, P. K., Ghannoum, M. A. Antifungal susceptibility of Candida biofilms: Unique efficacy of amphotericin B lipid formulations and echinocandins. Antimicrob Agents Chemother. 46 (6), 1773-1780 (2002).
- Ramage, G., et al. Liposomal amphotericin B displays rapid dose-dependent activity against Candida albicans biofilms. Antimicrob Agents Chemother. 57 (5), 2369-2371 (2013).
- Andes, D., et al. Development and characterization of an in vivo central venous catheter Candida albicans biofilm model. Infect Immun. 72 (10), 6023-6031 (2004).
- Schinabeck, M. K., et al. Rabbit model of Candida albicans biofilm infection: liposomal amphotericin B antifungal lock therapy. Antimicrob Agents Chemother. 48 (5), 1727-1732 (2004).
- Lazzell, A. L., et al. Treatment and prevention of Candida albicans biofilms with caspofungin in a novel central venous catheter murine model of candidiasis. J Antimicrob Chemother. 64 (3), 567-570 (2009).
- Nett, J. E., Marchillo, K., Spiegel, C. A., Andes, D. R. Development and validation of an in vivo Candida albicans biofilm denture model. Infect Immun. 78 (9), 3650-3659 (2010).
- Wang, X., Fries, B. A murine model for catheter associated Candiduria. J Med Microbiol. 60 (10), 1523-1529 (2011).
- Harriott, M. M., Lilly, E. A., Rodriguez, T. E., Fidel, P. L. J., Noverr, M. C. Candida albicans forms biofilms on the vaginal mucosa. Microbiology. 156 (12), 3635-3644 (2010).
- Dongari-Bagtzoglou, A., Kashleva, H., Dwivedi, P., Diaz, P., Vasilakos, J. Characerterization of mucosal Candida albicans biofilms. PloS One. 4, e7976 (2009).
- Ricicová, M., Kucharíková, S., Tournu, H., Hendrix, J., Bujdáková, H., Van Eldere, J., Lagrou, K., Van Dijck, P. Candida albicans biofilm formation in a new in vivo rat model. Microbiol. 156, 909-919 (2010).
- Kucharíková, S., Tournu, H., Holtappels, M., Van Dijck, P., Lagrou, K. In vivo efficacy of anidulafungin against Candida albicans mature biofilms in a novel rat model of catheter-associated candidiasis. Antimicrob Agents Chemother. 54 (10), 4474-4478 (2010).
- Bink, A., et al. The nonsteroidal antiinflammatory drug diclofenac potentiates the in vivo activity of caspofungin against Candida albicans biofilms. J Infect Dis. 206 (11), 1790-1797 (2012).
- Van de Velde, G., Kucharíková, D., Schrevens, D., Himmelreich, U., Van Dijck, P. Towards non-invasive monitoring of pathogen-host interactions during Candida albicans biofilm formation using in vivo bioluminescence. Cell Microbiol. 16 (1), 115-130 (2014).
- Van de Velde, G., Kucharíková, S., Van Dijck, P., Himmelreich, U. Bioluminescence imaging of fungal biofilm development in live animals. Methods in Molecular Biology. 1098, 153-167 (2014).
- Gahan, C. G. The bacterial lux reporter system: applications in bacterial localisation studies. Curr Gene Ther. 12 (1), 12-19 (2012).
- Doyle, T. C., Nawotka, K. A., Kawahara, C. B., Francis, K. P., Contag, P. R. Visualizing fungal infections in living mice using bioluminescent pathogenic Candida albicans strains transformed with the firefly luciferase gene. Microb Pathog. 40 (2), 82-90 (2006).
- Enjalbert, B., et al. A multifunctional synthetic Gaussia princeps luciferase reporter for live imaging of Candida albicans infections. Infect Immun. 77 (11), 4847-4858 (2009).
- Mosci, P., et al. A novel bioluminescence mouse model for monitoring oropharyngeal candidiasis in mice. Virulence. 4 (3), 250-254 (2013).
- Van Wijngaerden, E., et al. Foreign body infection: a new rat model for prophylaxis and treatment. J. Antimicrob. Chemoth. 44 (5), 669-674 (1999).
- Nobile, C. J., Mitchell, A. P. Regulation of cell-surface genes and biofilm formation by the C. albicans transcription factor Bcr1p. Curr. Biol. 15 (12), 1150-1155 (2005).
