Summary
Isolering av individuelle dopaminneuroner eller ventral tegmentale område med direkte eller indirekte immunhistokjemi er demonstrert ved hjelp av laser capture mikrodisseksjon. Parametere for isolering av vev fra en glassplate ved hjelp av en infrarød laser og fra membranplater under anvendelse av en kombinasjon av en infrarød og ultrafiolett laser blir diskutert.
Abstract
Laser fangst mikrodisseksjon (LCM) brukes til å isolere en konsentrert populasjon av individuelle celler eller presise anatomiske regioner av vev fra vevssnitt på et objektglass. Når det kombineres med immunhistokjemi, kan LCM brukes til å isolere enkelte celletyper basert på et bestemt protein markør. Her blir LCM teknikken beskrevet for oppsamling av en bestemt populasjon av dopaminneuroner direkte merket med tyrosinhydroksylase immunhistokjemi og for isolering av det dopamin-neuron inneholdende regionen i det ventrale tegmentale område ved hjelp av indirekte tyrosinhydroksylase immunhistokjemi på et avsnitt ved siden av de som brukes for LCM. Et infrarødt (IR) fangst laser brukes til både dissekere enkelte nevroner samt ventral tegmentale området utenfor glassplater og på en LCM cap for analyse. Komplett dehydrering av vevet med 100% etanol og xylen er kritisk. Kombinasjonen av IR-fangst laser og ultrafiolett (UV) cutting laser brukes til å isolere enkelt dopaminneuroner eller ventral tegmentale området når du bruker PEN membran lysbilder. En PEN membran slide har betydelige fordeler over et glass lysbilde som det gir bedre konsistens i å fange og samle celler, er raskere å samle inn store biter av vev, er mindre avhengige av dehydrering og resultater i fullstendig fjerning av vev fra raset. Selv om fjerning av store områder av vev fra en glassplate som er mulig, er det betydelig mer tidkrevende og ofte etterlater noen rester av vev bak. Data som er vist her viser at RNA av tilstrekkelig mengde og kvalitet kan oppnås ved hjelp av disse prosedyrer for kvantitative målinger PCR. Selv om RNA og DNA er de mest isolerte molekyler fra vev og celler samlet inn med LCM, isolasjon og måling av mikroRNA, protein og epigenetiske forandringer i DNA kan også dra nytte av forbedret anatomisk og cellulær oppløsning oppnådd ved bruk av LCM.
Introduction
Alle vev består av en heterozygot populasjon av celler. Dette er spesielt relevant for hjernevev, som består av forskjellige morfologisk og / eller neurochemically forskjellige neuroner omgitt av ulike typer av gliaceller (oligodendrocytter, astrocytter og microglia). I tillegg er forskjellige regioner i hjernen, slik som områder av hjernebarken eller hjernestammen kjerner, har bestemte funksjoner. Derfor er evnen til å isolere spesifikke populasjoner av celler eller svært små anatomisk forskjellige områder, når de kombineres med analytiske teknikker (dvs. Q-PCR, mikromatriser, RNA-sekvensering, og proteomikk), kan betydelig forbedre forståelsen av forskjellige biologiske prosesser. LCM er en teknologi som gir mulighet for å isolere meget diskrete anatomiske områder eller spesifikke celler fra vev på et objektglass som gir et mye mer homogen kilde for ytterligere analyse av diverse molekyler, slik som RNA, mikroRNA, DNA og proteiner.
t "> Siden LCM først ble introdusert, har flere forskjellige tilnærminger blitt brukt til å microdissect celler fra vev 1-3. De tidligste metoder inkludert direkte binding av vev på et objektglass ved hjelp av en infrarød (IR) laser og en termoplastisk film, og et ikke- kontaktmetode ved bruk av en ultrafiolett (UV) skjære laser for å løsne en celle eller vev og samling inn i et rør. Deretter har LCM blitt brukt på en rekke forskjellige vev og celletyper og vist å være kompatibel med isolering av forskjellige molekyler for genetisk analyse inkludert RNA, mikroRNA, DNA og proteiner, inkludert enzymatisk aktivitet 1,4-7. Her LCM er demonstrert ved hjelp av en LCM system som bruker en cutting UV laser og en fange IR laser for å kutte rundt celler eller vev og knytter den til en LCM lokket, henholdsvis. Dette LCM-systemet bruker både IR fangst laser for å smelte en plastfilm på en hette over cellen eller vevet av interesse som festes cellene til plastfilmen og fjerner den fra tHan vev med fjerning av hetten (figur 1). I tillegg, i kombinasjon med den infrarøde laser, er en UV-laser tilgjengelig for å skjære ut vev eller celler av interesse fra vev som er montert på objektglass med en membran og deretter isolert ved å feste til vev LCM hetten ved hjelp av IR-laser (figur 2). En kort oversikt over disse metoder finnes i figurene 1 og 2.Flere variasjoner av denne teknikken er beskrevet i enten isolere spesifikke celler ved hjelp av direkte fluorescerende immunhistokjemi og en indirekte immunhistokjemi styrt teknikk som brukes for isolering av en region av vev basert på ekspresjonen av et spesifikt protein. Nærmere bestemt, er isoleringen av dopamin-neuroner fra substantia nigra og isolering av det ventrale tegmentale område og den påfølgende isolering av RNA fra ferske, frosne hjernevev vist. Når RNA er den mest labile av molekyler målt (i forhold til DNA eller protein), steps å bidra til å bevare RNA integritet er inkludert og data vises på kvantitet og kvalitet av RNA oppnådd.
Protocol
MERK: Brain vev fra mus ble brukt i samsvar med National Institutes of Health Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr, og studieprotokoller ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité ved Mississippi State University.
1. Utarbeidelse av lysbilder og Tissue
- Bruk enten silan-prep lysbilder eller polyetylen napthalate (PEN) membran glass.
- For RNA isolering, dip lysbilder i RNase dekontaminering løsning, vask tre ganger med RNase-fritt vann og deretter tørke med en gradert serie av RNase-fritt etanol og vakuum tørke i 30 min.
- Skjær vevssnitt på 10 mikrometer tykkelse ved hjelp av en cryostat og montere på forberedt RNase frie lysbilder. Hold seksjonene frosset under seksjonering å bevare RNA kvalitet.
MERK: Pass på at vevet er ca 4 mm bort fra kantene av raset som LCM kan ikke fjerne vev som er for nær kanten av raset. In order for å fjerne vev fra en PEN membran lysbilde, sikre at vevet er 4 mm fra venstre, topp og bunn og 7 mm fra høyre side av raset som er målene membranen som ikke er knyttet til raset. - For isolering av enkelte cellepopulasjoner som bruker direkte immunhistokjemi, seksjon vev på enten silane-prep lysbilder eller PEN membran lysbilder. For isolering av regioner av vev ved hjelp av indirekte immunhistokjemi guidede teknikker, montere ett sett med seksjoner på en silan-prep lysbilde for immunhistokjemi og alternative deler på enten en PEN membran lysbilde og / eller et silan-prep lysbilde som skal brukes til LCM.
2. Vevspreoarerlng for Laser Capture - Rapid tyrosinhydroksylase Immunohistokjemi for Direct Laser Capture av immunoreaktiv Cells
- Skissere vev med en hydrofob penn og la tørke.
- Fiks vev i aceton-metanol (1: 1) oppløsning ved -20 ° C i 10 min.
MERK: Our erfaring har vist at den aceton-metanol fiksering resulterte i mye mer konsistente immunhistokjemi enn aceton eller metanol alene. - Skyll lysbilde i fosfat saltvann (PBS) med 1% Triton (RNase gratis).
- Cover seksjoner med 100-200 mL PBS med 1% Triton med tyrosinhydroksylase antistoff fortynnet 1: 100 med 400 U / ml RNasin. Inkuber i 5 til 10 min.
- Skyll kort i PBS to ganger og PBS-1% Triton.
- Dekk vev med 100-200 pl av geit-anti-kanin-IgG merket med Alexa Fluor 488 fortynnet 1: 100 i PBS-1% Triton sammen med 400 U / ml RNasin og 50 ng / ml DAPI. Inkuber i 5 min.
- Skyll to ganger i PBS og deretter tørke 30 s i en gradert serie av RNase gratis etanol (75% -75% -95% -95% -100% -100%).
- Inkuber i to vaskinger av xylen i 1 minutt og deretter 5 min.
- Fjern lysbilder fra Xylen umiddelbart før bruk for LCM og la det lufttørke.
3. Vevspreoarerlng for Laser Capture - TyrosinHydroksylase Immunhistokjemi for Indirekte Laser Capture av immunoreaktiv Regioner
- Prosessen ett lysbilde med seksjoner ved siden seksjoner montert på silan-prep og / eller PEN membran lysbilder for immunhistokjemi.
MERK: Prosedyrer som brukes her er lik de tidligere rapportert fem. For demonstrasjons bildene ble diaminobenzidin (DAB) chromagen reaksjon brukes til å visualisere tyrosinhydroksylase nevroner av interesse. - For lysbilder brukes til LCM, fikse for 5 min i 100% aceton ved 4 ° C.
- Dehydrere vev i en gradert serie av RNase Free etanol (75% -75% -95% -95% -100% -100%) i 1 minutt hver.
- Inkuber i to vaskinger av xylen i 1 minutt og deretter 5 min.
- Fjern lysbilder fra Xylen umiddelbart før bruk for LCM og la det lufttørke.
4. Bruke Laser Capture mikrodisseksjon System
MERK: LCM program har 10 Verktøy barer og to vinduer for å styremikrodisseksjon prosedyre. Verktøy Barer: 1. mikroskop, 2. Capture Laser, 3. Klippe Laser, 4. Study, 5. Navigation, 6. Materialer, 7. Capture grupper, 8. mikrodisseksjon, 9. Font, 10. merknader. Windows: 1. Live Video og 2. veikart.
- Åpne døren ved å velge "Åpne døren" -kategorien i Materials verktøylinjen i LCM systemprogramvaren.
- Last lysbilder på de tre tilgjengelige slots. For denne demonstrasjonen, last ett lysbilde med tyrosinhydroksylase immunhistokjemi visualisert med DAB, en silan-prep lysbilde og en PEN membran lysbilde hver merket for rask fluorescerende tyrosinhydroksylase immunhistokjemi. I et typisk eksperiment, kan du bruke enten umerkede aceton faste seksjoner med en referanse lysbilde merket for tyrosin hydroksylase bruker DAB eller lysbilder direkte merket med fluorescerende tyrosinhydroksylase for laser-fangst.
- Laste LCM caps i det tilgjengelige sporet.
MERK: Macro og HS LCM caps er tilgjengelig for bruk. Den type LCM cap å bruke deavhenger i høy på antall celler eller mengden av vev som skal samles inn. Makro lysbilder er oppført for å samle opp til flere tusen celler mens HS caps kan samle flere hundre. Makro slides tillate mer vevssamling men krever 50 ul lyseringsbuffer. HS hetten, når den brukes med adaptere, krever kun 10 pl av lyseringsbuffer som gir større proporsjonal gjenvinning av RNA. - Lukk døren.
- Laste raset for å aktivere Road Map vindu som gir en arbeids utsikt over hele lysbilde, gjør dette for valg av regionen av interesse (figur 3). Vis Veikartet på live videovinduet for å navigere til området av interesse.
- I Materials verktøylinjen, identifisere PEN membran lysbilder ved å krysse av i boksen ovenfor raset sporet. Å levere cap egenskaper, høyreklikk på caps i Materialer verktøy linjen og velg "Cap forsynings egenskaper". Sjekk boksene som angir plasseringen av caps og velg enten Macro eller HS caps.
- Velg "fluorescens" -kategorien i mikroskopet verktøylinjen for å slå på lysrør og la lysrøret å varme opp. Bruk den blå og UV-filtre for å visualisere Alex Fluor 488 og DAPI, henholdsvis. Bruk "Adjust Camera" -kategorien for å øke følsomheten på bildet for å se de fluorescensmerkede celler.
- I Materials verktøylinjen, høyreklikker du på en cap og flytte den til raset av interesse. Dobbeltklikk på en plassering i Veikartet for å velge området som vises i Live Video vinduet. Flytt lokket rundt på lysbildet ved å velge et område på Veikartet (dobbelt venstreklikk) og deretter høyreklikke og velge "Place cap midt regionen."
- Før du bruker IR-fangst laser, sikte og justere det for styrke. Plassere lokket i et område av sleiden bort fra vevet. På Capture Laser verktøylinjen, velg "Aktiver". Juster Power (3-100 mW), Pulse (100-1000000 μ; Sek) og # Hits av laseren. Fyre av IR laser når lokket er over en del av raset uten vev og sjekk for å se om laser smelter LCM cap membranen tilstrekkelig.
MERK: Dette kalles fukting som smelter polymermembran på hetten, slik at den kommer i kontakt glasset lysbilde. Tilstrekkelig fukting er synlig som en mørk ring smeltet til lysbildet med midten av ringen klar (se figur 4 for eksempler på tilstrekkelig og utilstrekkelig smelting). Dersom fukting ikke er tilstrekkelig, justerer strømmen og puls, og test brann igjen før dette er oppnådd. I tillegg kan flere branner av laser også brukes. - Når IR laser intensitet er justert, høyreklikk og velg "Capture laser er her" å sikte laseren.
MERK: Dette trinnet forteller datamaskinen der IR-fangst laser er rettet mot vevet. Dette trinnet med å rette laser er kritisk og må gjentas hver gang hetten flyttes eller målet er endret. 5. Laser Capture mikrodisseksjon av Individuell dopaminneuroner off av silane-prep Slides - Flytte til regionen av interesse å fange celler.
MERK: eksempel på isolere dopaminneuroner er vist her. - Å fange opp enkeltceller off av et silan-prep lysbilde, velger du "LCM" -fanen og deretter "single point" -ikonet i mikrodisseksjon verktøylinjen.
- I mikroskopet verktøylinjen, bruk "Shutter" -kategorien for å bytte mellom fluorescens og lyse felt med fluorescerende filtre kategoriene for å velge de riktige filtre og bruke mål kategoriene for å endre forstørrelsen. Når cellene av interesse er synlige i live videovinduet, justere spotstørrelsen som brukes for å markere celler av interesse for den omtrentlige størrelsen på cellene. Gjør dette ved å klikke på fanen Spot på Capture Laser verktøylinjen deretter klikke på den ene siden av en farget celle, etterfulgt ved å klikke på motsatt side.
MERK: Dette beregnerdiameteren av flekken, og viser verdien. - Markere cellene av interesse ved å klikke på dem mens de "Single point" -ikonet er valgt. Gjør dette for å plassere en flekk merke på hver celle. Her blir det blå filteret og 10X objektiv som brukes til å visualisere dopaminneuroner. Test på nytt og sikte IR-laser på hetten hvor det ikke er vevet under det som er beskrevet i trinn 4.9 og 4,10.
- Når cellene er merket, velger du "Gå - klipp og fangst" -kategorien på mikrodisseksjon verktøylinjen og IR-laser vil automatisk skyte i det hele tatt merket celler valgt. I tillegg, hvis nødvendig, brann IR laser manuelt på et punkt av interesse (Figur 5D).
- Flytt lokket bort fra seksjonen og inn på et åpent område av raset for å sjekke om cellene ble fanget på LCM cap. Sikre at celler av interesse er fjernet fra sleiden (figur 5B, E) og er festet til LCM hetten (figur 5C, F). Dokument ther prosessen ved å klikke på "Capture image" -kategorien i mikroskop verktøylinjen.
- Når du er ferdig å samle vev, fjerne hetten ved å høyreklikke på hetten og velg "Flytt til" og deretter "Losse."
- Å fange opp enkeltceller ut av PEN-membran lysbilder ved hjelp av både IR og UV-lasere, velg "Klipp og Capture" -kategorien i mikrodisseksjon verktøylinjen. Velg "single point" -kategorien for å markere cellene av interesse. Bruk "Cut linje" for å skissere hver celle. Sørg for å teste IR laser som beskrevet i trinn 4.9 og 4.10 og teste UV laser for å bestemme minimum intensitet nødvendig å kutte trodde PEN membran og vev (figur 4 og 5)
- Velg "Capture og Cut" -kategorien på mikrodisseksjon verktøylinjen. Ved innsamling av individuelle celler ved hjelp av denne teknikken, væresørge for å fyre av IR-laser først, etterfulgt av UV-laser som disse små stykker kan gå tapt dersom de er kuttet ut før de er festet til LCM hetten.
MERK: Denne prosessen kan også gjøres manuelt ved å skyte IR laser på et punkt av interesse og cellene individuelt skissert med UV-laser. - Etter oppsamling av cellene av interesse, beveger LCM hetten, som beskrevet ovenfor i trinn 5.7 for å bestemme om cellene ble fjernet og festet til hetten (figur 6).
- Når du er ferdig å samle vev, fjerne hetten ved å høyreklikke på hetten og velge "Flytt til" og deretter "Losse."
- Å identifisere regionen av interesse, kan du bruke glide behandlet for immunhistokjemi.
MERK: For denne demonstrasjonen ventral tegmentale Området er isolert (figur 7A). - Laste en LCM cap og teste lasere som i trinns 4.9 og 4.10.
MERK: Vanligvis er en Macro LCM cap brukes, men en HS cap kan også brukes (se figur 8). - Å isolere en region av vev (dvs. den ventrale tegmentale område) fra silan-prep lysbilde, velger du "LCM" -kategorien i mikrodisseksjon verktøylinjen, og velg deretter "polygon-utvendig" -kategorien. Skissere regionen av interesse i Live Video vinduet. Avhengig av størrelsen på området for innsamling, skissere regionen av interesse ved lav forstørrelse (2X Objective). For samlingen er imidlertid at instrument benytter 10X objektiv så justere og tar sikte på IR-laser under 10X objektiv forut for å ta.
- Velg "Gå - fangst og kutt" -kategorien i mikrodisseksjon verktøylinjen.
MERK: Datamaskinen vil automatisk utløse IR laser gjennom hele utvalgt område (Figur 7F, jeg). Hvis LCM membranen ikke har blitt smeltet tilstrekkelig i hele området, kan laseren bli skutt manni manuell eller hele prosessen gjentas. - Flytt LCM hetten av vevet for å bestemme hvor godt vev ble oppsamlet.
MERK: Ett drag med denne metoden vanligvis etterlater noen vev bak på lysbildet (Se Figure7G). Hvis dette skjer, må du gjenta valget og ta skrittet over. Gjenta dette trinnet kan øke mengden av vev samlet (figur 7J). - Når du er ferdig å samle vev, losse hetten ved å høyreklikke på hetten og velge "Flytt til" og deretter "Losse."
- Bruke skyve behandlet for immunhistokjemi som en guide for å velge regionen av interesse fra vevet på PEN membran lysbilde som ovenfor.
- Velg "Klipp og Capture" -kategorien i mikrodisseksjon verktøylinjen. Velg "Cut Line" -fanen og skissere regionen av interesse å bruke immunohistochemistry merket lysbilde som en guide.
MERK: Programmet vil automatisk legge spots for IR-laser for å feste vev til hetten. Bruk "single point" for å legge til flere steder for å bedre sikre vevet til hetten. - Under 10X objektiv, test brann og tar sikte på IR og UV laser som beskrevet i 4.9 og 4.10. Test at UV-laser kan trenge gjennom membranen på lysbildet og at dette kuttet tilsvarer plasseringen på dataskjermen. Bruke en UV-laser styrke som er akkurat tilstrekkelig til å skjære membranen og vev, men ikke skader vev (Figur 5).
- Velg "Gå - fangst og kutt" -kategorien i mikrodisseksjon verktøylinjen.
MERK: Datamaskinen vil automatisk utløse IR laser på alle merkede flekker i vevet å feste den til hetten deretter fyre av UV laser til å skjære raset PEN membran og vev (figur 7C). Ekstra IR smeltet flekker kan være nødvendig å tilstrekkelig feste tissaksøke til LCM cap, som også kan legges til manuelt. - Flytt LCM hetten av vevet for å bestemme om vev ble fjernet fra seksjonen (figur 7C), og festet til hetten (figur 7C).
- Når du er ferdig å samle vev, for å fjerne hetten, høyreklikk på hetten og velg "Flytt til" og deretter "Losse."
- For å samle RNA fra de innfangede celler eller vev, inkuber LCM hetten membran i RNA lysisbuffer i 30 min ved 37 ° C.
MERK: HS hetter, er en adapter tilgjengelig som tillater bruk av kun 10 pl av lyseringsbuffer på toppen og festes til et 0,5 ml mikrosentrifugerør. Makro caps krever 50 ul lysisbuffer og festes direkte til en 0,5 ml mikro tube. - Etter inkubasjon spinne lyseringsbuffer ned i 0,5 ml mikrosentrifugerør.
- For å sikre fullstendig lyse av alle cellene or vev, skrelle av LCM cap membran av lokket og plasser i lysis buffer.
- For å teste for RNA integritet, bruk RNA isolert fra vev igjen på lysbildet etter LCM å måle RNA integritet.
MERK: På grunn av begrenset prøve RNA oppnådd med LCM, er det vanligvis ikke praktisk å teste RNA integritet på LCM isolerte RNA, men RNA fra den gjenværende vevet gir en god indikator på en hvilken som helst RNA-degradering på grunn av fikseringen, immunhistokjemi og tid i løpet av LCM prosedyre.
6. Laser Capture of Individual dopaminneuroner ut av PEN Membran Slides
7. Fange Ventral tegmentale området fra silan-prep Slides
8. Fange Ventral tegmentale området fra PEN Membran Slides
9. Isolering av RNA
Representative Results
Den mikrograf i figurene 6 og 7 vise mulighetene for isolering av enkelt dopaminneuroner. Den nåværende anatomiske oppløsning er omkring 5 til 10 mikrometer som den minste punktstørrelse som kan konsekvent produsert på LCM hetter for å isolere en celle. Den eneste begrensning for isolering av spesifikke celletyper er evnen til å visualisere cellene. Selv LCM er i stand til å isolere individuelle dopaminneuroner, mest sannsynlig oppstår forurensning av deler av tilstøtende umerkede celler. Derfor er den endelige prøven en konsentrert samling av dopaminneuroner, ikke en ren populasjon av dopaminneuroner. Denne teknologien er også i stand til å isolere små områder av vev som adskilte kjerner eller områder i hjernen som vist med isolering av det ventrale tegmentale område. Tidligere publikasjoner har vist dette bruk i hjernevevet, samt å isolere patologisk vev fra normalt vev 5,11.
(figur 10A). For å måle mengden RNA med Q-PCR, en rekke konsentrasjoner av hele hjernen RNA og RNA fra dopaminneuroner ble revers transkribert og β-aktin-genet, ble målt ved bruk av Q-PCR som beskrevet tidligere 5. Basert på disse målinger, ble en konsentrasjon på 3,55, 6,82 og 20,58 pg / mL beregnet fra 50, 100 og 200 dopaminneuroner, respektivt (figur 10B).
For å demonstrere hvordan isolering av dopaminneuroner sammen til isolering av hele ventral tegmentale område med LCM, dopamin-neuron spesifikke gener (Nurr1, tyrosin-hydroksylase, og dopamintransport) ble målt med Q-PCR i disse to forskjellige typer av prøver, og sammenlignet med ekspresjon av β-aktin (figur 11). Siden lavere C-t-verdier som er generert med en høyere konsentrasjon av genet av interesse, en nedgang i A C T indikerer en økt ekspresjon av dopamin-neuron-gener i forhold til β-aktin. Dette viser hvor isoleringen av de enkelte dopaminneuroner konsentrater ekspresjon av dopamin-neuron spesifikke gener. I de ventral prøver tegmentale området, er dopamin nevroner spesifikke gener utvannet ut som andre celler (ikke-dopaminerge nevroner og gliaceller) vil også bli samlet inn som uttrykker β-aktin, men ikke uttrykker dopamin nevroner gener.
es / ftp_upload / 52336 / 52336fig11highres.jpg "/> 
Figur 2. Laser-fangst ved hjelp av den infrarøde (IR) fangst laser og ultrafiolett (UV) kutte laser. For å skaffe seg større deler av vev eller lette utvinningen av celler ved hjelp av UV-laser, er vev montert på et lysbilde med en membran koblet til lysbilde langs utsiden hjørnet (PEN membran lysbilder). LCM hetten er plassert på tHan vev og IR-fangst laser brukes til å smelte hetten membran og feste vevet til LCM hetten (trinn 1 og 2). UV-laser-skjære blir så brukt til å skjære gjennom sleiden membran og vev (trinn 3 og 4), slik at når hetten er fjernet vev fjernes fra sleiden og blir stående på LCM hetten (trinn 5). 
Figur 3. Laser Capture mikrodisseksjon System Road Map. Dette Laser Capture mikrodisseksjon System har plass til tre lysbilder om gangen. Når lysbildene er lastet inn i mikroskopet, er lav forstørrelse Road Kart bilder for hvert lysbilde generert. Velge et område på veikartet bilde beveger seg på Live bildevinduet til denne regionen. For demonstrasjonsformål, ble det muse mesencephalon delt inn i 10 mikrometer seksjon på tre lysbilder. Det første lysbildet ble merket for tyrosinhydroksylase immunoreactivity hjelp diaminobenzidin som en chromagen (A). Delene ble montert på enten silan-prep lysbilder (B) eller PEN membran lysbilder (C). Begge disse lysbildene ble merket ved hjelp av den raske fluorescerende tyrosinhydroksylase immunhistokjemi. Pilene i (C) viser feste av PEN membranen til glass-slide. Ingen vev utenfor denne grensen kan samles med LCM. 
Figur 4. Bruk av IR-fangst laser. IR-fangst laser brukes til å smelte LCM cap membran for å feste vev til LCM cap og fjerne det fra resten av vevet. IR fangst laser må være tilstrekkelig styrke til å smelte LCM hetten membranen tilstrekkelig til å kontakte den underliggende vev og glass-slide. Bildet ovenfor demonstrerer når laseren var utilstrekkelig til å smelte membranentil raset (venstre to plasser). Når smeltet membran berører glass lysbilde, kan en tykk svart ramme observeres (rett sted). Intensiteten av laseren kan justeres ved å endre strøm (3-100 mW) Puls (100-1,000,000 usek) og # treff av laseren. I tillegg gjentatt avfyring av IR-laser på samme sted kan også ytterligere smelte membranen. Hensikten med IR-laseren må justeres helst LCM hetten flyttes eller når målet er endret. Skala bar = 100 mikrometer. 
Figur 5. Ved hjelp av UV-kutting laser. UV skjære laser brukes til å skjære gjennom membranen PEN og vev. Før bruk minimumsintensitet er nødvendig for å skjære gjennom membranen, og vevet må bestemme ettersom UV-laser kan skade vevet. Ovenfor, er de tre flekker (piler) i forskjellige UV-laser intensiteter er vist med venstre spot størrelse tilstrekkelig for 10 mikrometer seksjoner, den midterste stedet for tykkere seksjoner og rett sted demonstrere en UV laser intensitet som er for høy. Skala bar = 100 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. 
Figur 6. Direkte isolering av tyrosinhydroksylase immunoreaktive neuroner ved hjelp av IR-laser. Dopaminneuroner er vist etter at en hurtig fluorescerende merking for tyrosin hydroksylase (A). Når IR-laseren er avfyrt smelter LCM hetten membran over disse neuronene (D), fjerning av hetten plukker disse cellene ut av sleiden (B, E). Disse neuroner kan deretter visualiseres som er festet til LCM lokket (C, F). Skala bar = 250 mikrometer.= "Https://www.jove.com/files/ftp_upload/52336/52336fig6large.jpg" target = "_ blank"> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. 
Figur 7. Direkte isolering av tyrosinhydroksylase immunoreaktive neuroner fra PEN membranplater under anvendelse av IR- og UV-lasere. Tyrosinhydroksylase merkede neuroner er vist ovenfor (A). Disse nevronene kan festes til LCM cap hjelp av IR laser og kuttet fra PEN membran lysbilde hjelp av UV-laser (B). Skala bar = 250 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. 
Figur 8. Indirekte isolering av ventral tegmentale området ved hjelp tyrosinhydroksylase immunoreaktivitets. Plasseringen av dopamin nevroner i ventral tegmentale området ble visualisert i en seksjon ved hjelp av standard immunhistokjemi teknikker (A og E). Dette immunhistokjemi merket delen ble brukt som en mal for å finne ventral tegmentale område i ufargede tilstøtende seksjoner (B og F). Ved hjelp av UV-laser, ble det ventrale tegmentale område festet til LCM hetten med den infrarøde lasers og kuttet fra sleiden med UV-laser (C og D), og er vist festet til en HS LCM hette (D). Ventral tegmentale regionen isolert fra silane-prep lysbilder bare ved hjelp av IR laser er også vist festet til en Macro cap (FK). Legg merke til at mer enn ett forsøk var nødvendig for å samle det meste av vev fra denne regionen (Sammenlign G og J). Skala bar = 500 mikrometer.pload / 52336 / 52336fig8large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. 
Figur 9. RNA kvalitet. Representative electropherograms og tilhørende gel bilder av kommersielt tilgjengelig hele hjernen RNA (A) og RNA isolert fra delene etter acetonfiksering og LCM (B) eller hurtig fluorescerende tyrosinhydroksylase immunhistokjemi og LCM (C). Selv om RNA kvalitet ble redusert i seksjoner behandlet for immunhistokjemi, i forhold til hele hjernen RNA, de electropherograms viser stort sett intakt RNA basert på tilstedeværelsen av rRNA S18 og S28 topper. Hele hjernen RNA konsentrasjonen var 6,487 pg / mikroliter med en RIN på 8,2. Aceton fast vev RNA konsentrasjonen var 5,036 pg / mikroliter med en RIN på 2,6. RNA oppnådd etter immunhistokjemi h annonsen en konsentrasjon på 4,474 pg / mikroliter og RIN var ikke tilgjengelig. 
Figur 10. RNA kvantitet. For å bestemme mengden av RNA i nevroner oppnådd med LCM, ble en standardkurve for RNA-konsentrasjoner produsert med en fluorospectrometer og Q-PCR. For fluorospectrometer målinger (A), den store graf viser høyere område av RNA mengder og den lille grafen viser sensitiviteten av denne analysen ned til 10 pg / mL. Konsentrasjoner av RNA oppnådd fra 50, 100 og 200 dopaminneuroner var 17,3, 24,8 og 50,9 pg / mL, respektivt. Ved hjelp av Q-PCR for å måle mengder RNA (B), konsentrasjonen av RNA erholdt fra 50, 100 og 200 dopaminneuroner var 3,55, 6,82 og 20,58 pg / mL, respektivt.
Figur 11. Konsentrasjon av dopamin-neuron spesifikke gener med isoleringen av de enkelte dopaminneuroner. Forskjellen i C t (A C t) mellom dopamin-neuron spesifikke gener (Nurr1, tyrosin-hydroksylase, og dopamintransport) og β-aktin i prøver av dopaminneuroner i det ventrale tegmentale område isolert med LCM sammenlignet med ekspresjon i dissections av hele ventrale tegmentale område er vist. Siden lavere C-t-verdier som er generert med en høyere konsentrasjon av genet av interesse, en nedgang i A C T indikerer en økt ekspresjon av dopamin-neuron-gener i forhold til β-aktin som andre celler (ikke-dopaminerge neuroner og gliaceller) vil samles i ventrale prøver tegmentale området som uttrykker β-aktin, men ikke uttrykker dopamin nevroner gener.
Discussion
LCM er en kraftfull teknikk for disseksjon av adskilte populasjoner av celler eller områder av vev fra vevssnitt på et objektglass, og den påfølgende isolering av RNA, mikroRNA, DNA og proteiner. Bruken av LCM i kombinasjon med analyse ved hjelp av høy-throughput teknologier som microarray, neste generasjon RNA-sekvensering, epigenetisk analyse av DNA og proteomforskning blir mer og mer vanlig da følsomheten av disse teknikkene øker og mengden av utgangsmateriale som trengs blir redusert 8-12. Med LCM, er en bedre anatomisk oppløsning oppnådd for en prøve, og forståelsen fra nedstrøms tiltak av disse prøvene er kraftig forbedret. En påminnelse med LCM er at den gir en konsentrert prøve av celler av interesse, men ikke nødvendigvis en ren populasjon av celler. Grensene for presisjons betyr at det vil bli en viss forurensning fra tilstøtende vev. Men gjør denne teknikken konsentrere cellene av interessefor å minimalisere effekter forbundet med omgivende vev og celler og maksimere de eksperimentelle effekter på cellene av interesse.
Direkte versus indirekte Immunohistokjemi
Siden LCM er for tiden anvendes hovedsakelig for isolering og måling av RNA, holde intakt RNA er et meget viktig kriterium. Opprettholdelse RNA integritet er hoved begrunnelsen bak bruken av indirekte immunhistokjemi for å lede vev disseksjon som fjerner nødvendigheten av å sette flekker vevet direkte som kan nedbryte RNA (figur 10). Når den eksperimentelle spørsmålet imidlertid krever isolering av en spesifikk populasjon av celler, så som dopamin-neuroner, er direkte fluorescerende immunhistokjemi nødvendig. Ved hjelp av en hurtig immunhistokjemi merking protokollen kan minimalisere degradering av RNA under prosedyren. De korte inkubasjonstider er på grunn av anvendelsen av høye konsentrasjoner av primær og sekundær antiorganer, konsentrasjoner som er rundt 10-20 ganger høyere enn det som er nødvendig for konvensjonell immunhistokjemi med en 2 timers inkubasjon. Hvis derimot, er lengre inkubasjonstid nødvendig, Brown og Smith brukte høye salt buffere for å hemme RNA degradering og få god kvalitet RNA med lange inkubasjonstid (opptil 20 timer) 13. Denne fremgangsmåten kan også brukes hvis det er betydelig tid som er nødvendig mellom merking av vev og få tilgang til et system LCM.
Valget av lysbilder - PEN-membran, silan-prep og ubestrøket glassplater
Bruken av ubelagte glassplater for LCM er blitt rapportert 14. I vårt laboratorium har Silan-prep lysbilder blitt funnet å være et optimalt valg, da dette belegg settes tilstrekkelig vevet til sleiden for immunhistokjemi uten tap av vev, men likevel gjør det mulig for feste av vevet til LCM caps og fjerning fra sleiden . Ubestrøket glassplater harviste noen vev tap med immunhistokjemi prosedyren. Hvis indirekte immunhistokjemi er brukt, men blir vevet oppbevaring mindre av et problem. Med riktig dehydrering, fange celler eller vev av av silan-prep lysbilder har ikke vært et problem. Hver av de ulike tilnærminger til å isolere nevroner eller områder av hjernen som er beskrevet i denne artikkelen har fordeler og ulemper. For isolering av de enkelte dopaminneuroner, har bruken av Silan-prep lysbilder fordelen av bedre optikk og er mindre kostbart enn de PEN membran lysbilder. Ulempen er at noen ganger fange celler kan være vanskelig hvis det ikke er tilstrekkelig dehydrering (se nedenfor) og noen vev kan stå på lysbildet. Fordelen av pennen membraner lysbilder er at ved å bruke en kombinasjon av IR-laser og UV-laser sikrer at dopaminneuroner vil bli oppsamlet. Unnlatelse av å samle celler fra en penn membran lysbilder nesten aldri forekommer, da det er mindre avhengig av dehydrering enn glassplater. En ytterligere fordel er at den UV-laser kan anvendes for nærmere å tilnærme formen av neuroner av interesse, sammenlignet med en sirkel for å fange neuroner av av glassplater med IR-laser. For isolering av regioner av vev, pennen membran lysbildene er langt overlegen og rettferdiggjøre den ekstra kostnaden. Dette resulterer i fullstendig fjerning av alt vev skåret ut på membranen, er mye raskere enn å fange opp et stort område av vev ved bruk av IR-laser alene og tykkere vevssnitt kan samles. Bare ved hjelp av IR-laseren krever at LCM hetten membranen er helt smeltet over hele vevsområdet. I tillegg er ufullstendig samling av vevet typisk og vanligvis krever flere forsøk. Selv om dette tar lengre tid enn å isolere vev fra PEN membran slide, hvis den tilgjengelige vev er allerede på et objektglass eller en UV-laser ikke er tilgjengelig, dette er et levedyktig alternativ i de fleste vev kan oppsamles (fig 8J).
ove_content "> Kritiske trinnDe 100% etanol inkubasjoner er en av de viktigste trinnene. For å samle celler fra Silan-prep slides kreves fullstendig dehydrering av vev. Derfor vil en hvilken som helst vann ikke fjernes, noe som er forbundet hovedsakelig med 100% etanol inkubering, påvirke evnen til å plukke opp celler fra skinnene. For å løse dette problemet, ofte endre de 100% etanol løsninger som absorpsjon av vann fra luften eller overføring fra tidligere vasketrinn kan påvirke dehydrering. I tillegg er molekylsikter anvendes for å absorbere noe vann forurensning. LCM-systemet bør ideelt sett være plassert i et lite rom med en avfukter for å opprettholde lav luftfuktighet.
Gode kryostatsnitt er avgjørende for riktig LCM. Seksjoner må være flat med folder i vev minimaliseres. Folder i vev vil øke avstanden mellom LCM lokket og hindre den fra å kontakte than vev. Det blir da vanskelig å smelte tilstrekkelig membranhetten på vevet. For glassplater, typisk seksjon tykkelse må være mellom 6 og 12 mikrometer. Tykkere seksjoner kan fanges med pennen membran lysbilder.
LCM tilbyr en teknisk kapasitet til å gjøre svært presise disseksjoner av vev og celler fra objektglass. Dette øker dramatisk oppløsningen av videre analyse i forhold til brutto disseksjon av vev stykker. Selv, LCM kan være tids- og arbeidskrevende, krever det ikke omfattende opplæring eller kompetanse og, når kombinert med andre high-throughput teknologier, kan i stor grad forbedre forståelsen av en biologisk prosess når diskrete celler eller anatomiske regioner blir brukt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Veritas Laser Capture Microdissection System | Life Technologies, Grand Island, NY | Newer model is now sold | |
| CapSure Macro LCM Caps | Life Technologies, Grand Island, NY | LCM0211 | |
| CapSure HS LCM Caps | Life Technologies, Grand Island, NY | LCM0213 | |
| PEN Membrane slides | Life Technologies, Grand Island, NY | s4651 | |
| Silane prep-slides | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | S4651 | |
| 95% Ethanol-RNase Free | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | E7148 | |
| 100% Ethanol-RNase Free | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | E7023 | |
| Rnase Free Triton | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | T8787 | |
| Molecular Sieve | EDM Millipore, Billerica, MA | MX1583D | |
| Anti-Tyrosine hydroxyase antibody | EDM Millipore, Billerica, MA | Ab152 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG | Life Technologies, Grand Island, NY | A-11008 | |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies, Santa Clara, CA | G2939AA | |
| Stratagene MX 3005P | Agilent Technologies, Santa Clara, CA | 401513 | |
| Nanodrop 3300 fluorospectrometer | Thermo Scientific | ||
| Quant-iT RiboGreen | Life Technologies, Grand Island, NY | R11490 | |
| RNaseZap | Life Technologies, Grand Island, NY | AM9780 |
References
- Emmert-Buck, M. R., et al.
- Schutze, K., Lahr, G. Identification of expressed genes by laser-mediated manipulation of single cells. Nature biotechnology. 16, 737-742 (1998).
- Schutze, K., Posl, H., Lahr, G. Laser micromanipulation systems as universal tools in cellular and molecular biology and in medicine. Cellular and Molecular Biology. 44, 735-746 (1998).
- Vandewoestyne, M., Van Nieuwerburgh, F., Van Hoofstat, D., Deforce, D. Evaluation of three DNA extraction protocols for forensic STR typing after laser capture microdissection. Forensic Science International Genetics. 6, 258-262 (2012).
- Eells, J. B., Wilcots, J., Sisk, S., Guo-Ross, S. X. NR4A gene expression is dynamically regulated in the ventral tegmental area dopamine neurons and is related to expression of dopamine neurotransmission genes. Journal of Molecular Neuroscience. 46, 545-553 (2012).
- Seelan, R. S., et al. Epigenetic analysis of laser capture microdissected fetal epithelia. Analytical Biochemistry. 442, 68-74 (2013).
- Kim, W., et al. miR-126 contributes to Parkinson's disease by dysregulating the insulin-like growth factor/phosphoinositide 3-kinase signaling. Neurobiology of Aging. 35, 1712-1721 (2014).
- Bohm, C., et al. Effects of antidepressant treatment on gene expression profile in mouse brain: cell type-specific transcription profiling using laser microdissection and microarray analysis. Journal of Neurochemistry. 97, Suppl 1. 44-49 (2006).
- Kadkhodaei, B., et al. Transcription factor Nurr1 maintains fiber integrity and nuclear-encoded mitochondrial gene expression in dopamine neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 2360-2365 (2013).
- Miller, R. A., et al. Quantitative Proteomics in Laser Capture Microdissected Sleep Nuclei From Rat Brain. Journal of Neurogenetics. , (2014).
- Roberts, E., et al. Application of laser capture microdissection and protein microarray technologies in the molecular analysis of airway injury following pollution particle exposure. Journal of Toxicology and Environmental Health. A. 67, 851-861 (2004).
- Yuferov, V., Nielsen, D., Butelman, E., Kreek, M. J. Microarray studies of psychostimulant-induced changes in gene expression. Addiction Biology. 10, 101-118 (2005).
- Brown, A. L., Smith, D. W. Improved RNA preservation for immunolabeling and laser microdissection. RNA. 15, 2364-2374 (2009).
- Curran, S., McKay, J. A., McLeod, H. L., Murray, G. I.
