Summary
Spørsmålet om hvordan kromatin regulatorer og kromatin stater påvirker genomet in vivo er nøkkelen til vår forståelse av hvor tidlig celle skjebne beslutninger fattes i utvikling av embryo. ChIP-Seq-den mest populære tilnærming for å undersøke kromatin funksjoner på et globalt nivå-er skissert her for Xenopus embryoer.
Protocol
MERK: All Xenopus arbeidet er helt i samsvar med den britiske Dyr (vitenskapelige prosedyrer) Act 1986 som gjennomføres av MRC National Institute for Medical Research.
1. Forberedelser
- Beregne antall embryoer som kreves for ChIP eksperimentet (se diskusjon).
- Forbered følgende løsninger som er lagret på RT: 500 ml 10x Marc modifiserte Ringers (MMR) uten EDTA, pH justert til 7,5 og steriliseres ved autoklave (1 M NaCl, 20 mM KCl, 20 mM CaCl 2, 10 mM MgSO4, 50 mM HEPES pH 7,5) 10 1 ml av SDS elueringsbuffer (50 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM EDTA, 1% SDS) og 1 ml 5 x DNA ladningsbuffer (0,2% Orange G, 30% glycerol, 60 mM EDTA pH 8,0).
- Fremstille de følgende løsninger som er lagret ved 4 ° C: 50 ml av HEG-buffer (50 mM HEPES-KOH, pH 7,5, 1 mM EDTA pH 8,0, 20% glyserol), 500 ml av uttreknings E1 buffere (50 mM HEPES-KOH, pH- 7,5, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA. 10% glycerol, 0,5% Igepal CA-630, 0,25% Triton X-100), E2 (10 mM Tris-HCl pH 8,0, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,5 mM EGTA) og E3 (10 mM Tris-HCl pH 8,0, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% Igepal CA-630, 0,25% Na-deoxycholat, 0,1% SDS), 500 ml RIPA-buffer (50 mM HEPES-KOH, pH 7,5, 500 mM LiCl, 1 mM EDTA , 1% Igepal CA-630, 0,7% Na-deoksykolat) og 50 ml TEN-buffer (10 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM EDTA, 150 mM NaCl).
- Resultat og klippet en 15 ml konisk polystyren rør på 7 ml-merket. Bruk dette røret for å inneholde kjernefysiske ekstrakter gjennomgår lydbehandling.
- For post-sekvense analysen bruker en flerkjernet Unix-stil drifts datamaskin med minst 8 GB RAM og 500 GB ledig diskplass. Installere følgende programvare lokalt hvorav de fleste er brukt på kommandolinjen: FastQC, Illumina casava-1.8 kvalitet filter, Bowtie 11, SAMtools 12, HOMER 13, MACS2 14, IGV 15,16, Cluster3 17, Java Utforsker, BLAST + 18, og b2g4pipe
- Bygg en Bowtie indeks for å samkjøre kort NGS leser til Xenopus genom. Et eksempel er vist her for X. tropic genom v7.1 (november 2011), som kan lastes ned som en FASTA fil (genome.fa) fra Xenbase ftp server (/ pub / Genomics / JGI). Flytt FASTA fil til indeksen underkatalog av Bowtie.
- Bruk følgende kommandolinje (her etter rask tegnet>) for å generere xenTro7 indeksfiler:
> Bowtie-build /path/to/bowtie/index/genome.fa xenTro7
> Eksport BOWTIE_INDEXES = / sti / til / bowtie / index /
- Last ned genet merknadsfil (GTF) fra UCSC Genome Browser eller speilet nettsted på Nimr server for siste genom versjoner (genomes.nimr.mrc.ac.uk) via Verktøy / Table Browser. Bruk genomet FASTA filen og GTF-filen til å tilpasse HOMER for Xenopus (f.eks X. tropic genom v7.1, - navnet xenTro7).
- Alternativt kan du bruke forhåndsbygde HOMER pakker for noen eldre versjoner av Xenopus genom.
> LoadGenome.pl -name xenTro7 -ORG null -fasta /path/to/genome.fa -gtf sti / til / genes.gtf
- Lag et genom spor (.genome fil) for genomet leseren IGV ved å laste opp en indeksert FASTA fil (genome.fa med genome.fa.fai filen i samme mappe) og merknaden fil (genes.gtf). Lag et genom stillas indeks (genome.fa.fai) for Xenopus genomet som følger:
> Samtools faidx /path/to/genome.fa- Bruk BLAST + å passere Gene ontologi (GO) termer fra flere modellarter (menneske, mus, sebrafisk, bananflue og gjær) på Xenopus gener som følger:
- Laste ned alle kodende sekvenser (CDS) som en enkelt FASTA fil (cds.fa) fra UCSC Genome Browser via Tools/ Tabell Browser og oppdatering BLAST + med den pre-formatert BLAST database med ikke-redundante proteiner (NR):
> Update_blastdb.pl nr - Søk etter menneskelig (txid9606), mus (txid10090), sebrafisk (txid7955), bananflue (txid7227) og gjær (txid4932) proteiner fra NCBI nettstedet via den avanserte søkefunksjonen (http: //www.ncbi.nlm.nih. gov / protein / avansert) og sende den resulterende GI (sekvens identifikator) liste (sequence.gi.txt) til datamaskinen.
- Tildele Xenopus gener til de mest lignende proteiner fra GI liste ved å utføre BLASTx med en viss forvente (E) verdi cutoff (her 10 -20). Kontroller at utgangsformatet er xml (-outfmt 5 utsjekking blastx_results.xml). Gjøre bruk av tidsbesparende tråder (-num_threads) som korrelerer med antall tilgjengelige data kjerner.
> Blastx -db / sti / til / nr -gilist /path/to/sequence.gi.txt -query / sti / to / cds.fa -evalue 1e-20
-outfmt 5 utsjekking /path/to/blastx_results.xml -num_threads [# tråder] - Åpne b2gPipe.properties fil av b2g4pipe mappe med en teksteditor og oppdatere databasen egenskaper til Dbacces.dbname = b2go_sep13 og Dbacces.dbhost = publicdb.blast2go.com. Kjør b2g4pipe fra installasjonsmappen.
> Java Xmx1000m -cp *: ext / *: es.blast2go.prog.B2GAnnotPipe -i /path/to/blastx_results.xml
utsjekking resultater / xenTro7 -prop b2gPipe.properties -v -annot
MERK: Dette programmet ekstrakter GO vilkår for hvert BLAST hit og tildeler dem til tilsvarende Xenopus gener (xenTro7.annot). De mest oppdaterte databaseinnstillingene finner du under Verktøy / Systeminnstillinger / Dataaccess innstillinger på Blast2GO Java Web Start applikasjon (se 9.11.1).
- Bygg en Bowtie indeks for å samkjøre kort NGS leser til Xenopus genom. Et eksempel er vist her for X. tropic genom v7.1 (november 2011), som kan lastes ned som en FASTA fil (genome.fa) fra Xenbase ftp server (/ pub / Genomics / JGI). Flytt FASTA fil til indeksen underkatalog av Bowtie.
2. Chromatin Cross-linking
- Gjødsle Xenopus egg, de-gelé og kultur embryos henhold til standard protokoller 20.
- Overføre dejellied embryoer (maks 2500 X. laevis eller 10.000 X. tropic) på utviklingsstadiet av interesse for en 8 ml glass prøveglass med lokk og vaske dem en gang kort med 0.01x MMR.
- Fix embryoene med 1% formaldehyd i 0.01x MMR (f.eks legge til 225 mL av 36,5 til 38% formaldehyd til 8 ml 0.01x MMR) for 15 til 40 min ved RT (se diskusjon for fiksering tid og antall embryoer som kreves per ChIP eksperiment).
MERK: Formaldehyd er etsende og svært giftig. Det er farlig i tilfelle av øyne og hud, dårlig fordøyelse, og innånding. Bruk avtrekksskap når du legger formaldehyd til hetteglasset. - Stopp fiksering av kort vaske embryoene tre ganger med kaldt 0.01x MMR. Ikke la Embry os ta kontakt med væskeoverflaten fordi overflatespenningen får dem til å sprekke.
- Delmengde embryoene til 2 ml mikrosentrifugerør på ismed maksimalt 250 embryoer per tube, som opptar et volum på ca 250 pl (X. tropic) eller 600 ul (X. laevis) før klekking.
- Pipette bort så mye 0.01x MMR som mulig. Hopp følgende trinn hvis du fortsetter umiddelbart med § 3.
- Likevekt embryoene i 250 ul kald HEG buffer. Når embryoene har lagt seg på bunnen av røret fjerne så mye væske som mulig og snap-fryse i flytende nitrogen. Lagre ved -80 ° C.
3. Chromatin Extraction
MERK: Følgende utvinning av tverrbundet kromatin fra Xenopus embryo fungerer mest effektivt med festetidene i trinn 2.3 og 50 til 80 X. tropic eller 25-40 X. laevis embryoer pr ml ekstraksjonsbuffer E1, E2 og E3. Hvert ekstraksjonstrinn gjentas, slik at to ganger det beregnede volum av buffer er nødvendig. For oppskalering, bruker flere 2 ml microcentriFUGE-rør eller 50 ml sentrifugerør. Hold prøver og buffere på is i løpet av kromatin utvinning.
- Supplere tilstrekkelige volumer av buffere E1, E2 og E3 med 1 mM DTT og proteasehemmer tabletter. Ved å utføre brikke med en fosfo-spesifikt antistoff, ytterligere supplement buffere med 5 mM NaF, 2 mM Na-3-VO 4.
- Homogen faste embryoer med E1 ved å pipettere opp og ned. Sentrifuger homogenater i en avkjølt sentrifuge (4 ° C) ved 1000 x g i 2 minutter (eller 5 min i tilfelle av anvendelse av 50 ml rør). Aspirere supernatanten og eventuelle lipider som er festet til veggen.
- Suspender pellets i E1. Holde prøvene på is i 10 min. Sentrifuger og kast Supernatantene som i trinn 3.2.
- Suspender pellets i E2. Sentrifuger og kast Supernatantene som i trinn 3.2.
- Gjenta trinn 3.4, men holde prøvene på is i 10 minutter før sentrifugering.
- Suspender pellets i E3. Holde prøvene på is i minst 10 min. Sentrifuger og kast supernatants som i trinn 3.2.
MERK: På dette stadiet, bør resuspensions blitt ganske gjennomsiktig. De anioniske vaskemidler i E3 trekke krysskoblede kjerner ved å gjengi de fleste av de gjenværende plomme blodplater løselige. - Resuspender og basseng pellets av tverrbundne kjerner (vanligvis farget brun fra de uoppløseliggjorte pigmentgranulater) i et totalt volum på 1 ml av E3. Fortynn prøven med E3 til 2 eller 3 ml hvis det virker meget viskøs og vanskelig å pipette. Hold på is eller ved 4 ° C for å gå videre med trinn 4 på samme eller neste dag. Snap-fryse i flytende nitrogen og oppbevares ved -80 ° C for senere bruk.
4. Chromatin Fragmentering
MERK: Sonikering blir brukt både til å oppløseliggjøre og å skjære tverrbundet kromatin. Her er parametere for å kjøre Misonix sonicator 3000 utstyrt med en 1/16 tommers konisk mikrotip og lyd kabinett. Hvis du bruker andre sonicators, følger produsentens anbefalinger for å klippetverrbundet kromatin eller bruke 6 til 12 W, fra 4 til 8 minutter totalt.
- Overføre kjernefysisk prøve fra trinn 3.7 inn i en spesialbygd tube for lydbehandling (trinn 1.4). Holde prøven avkjølt under sonikering ved at røret er festet til et 800 ml plastbegerglass fylt med isvann via en kort termometer klemme.
- Plasser begeret på et laboratorium jack. Juster kontakten slik at sonicator mikrotip er nedsenket i prøven til om lag to tredjedeler av dybde volum og sentrert uten å berøre rørveggen.
- Sonikere prøven for 7 min totalt, avbrutt hvert 30 sek med 1 min pauser. Sette makt til 1,0. Start lydbehandling og umiddelbart øke effektinnstillingen (normalt 2 til 4) for å nå en lesning av 9 til 12 W. Pause umiddelbart hvis prøven begynner å skumme. Omplassere rør og start på nytt når skummet er helt forsvunnet.
- Overfør skåret kromatin i på forhånd nedkjølte 1,5 ml mikrosentrifugerør og spinn på full hastighet (> 15,000 xg) i 5 min ved 4 ° C.
- Overfør supernatanten til pre-avkjølt 1,5 ml mikrosentrifugerør. Samle 50 mL av supernatanten (ideelt inneholder kromatin på rundt 400 000 eller flere kjerner) for å visualisere graden av kromatin fragmentering (§ 5). Bruke resten av supernatanten for ChIP (§ 6).
- Oppbevar prøver ved 4 ° C i opptil en dag. Snap-fryse-prøvene som porsjoner (ett per ChIP eksperiment) i flytende nitrogen for langtidslagring ved -80 ° C.
5. Imaging Chromatin Fragmentering
- Tilsett 50 ul SDS elueringsbuffer, 4 ul av 5 M NaCl og 1 pl proteinase K (20 pg / pl) til 50 ul av supernatanten fra trinn 4.6.
- Inkuber i 6 til 15 timer (O / N) i en hybridisering ovn innstilt på 65 ° C.
- Rense DNA ved hjelp av et kommersielt PCR rensing kit. Om nødvendig, bruk 3 M natriumacetat (pH 5,2) for å justere pH som er anbefalt av produsenten. EluereDNA to ganger med 11 ul elueringsbuffer (10 mM Tris-HCl pH 8,5).
- Legg 0,4 mL av RNase A (20 mikrogram / mikroliter) og 5 mL av 5x DNA lasting buffer før du kjører hele utvalget sammen med en 100 bp og en 1 kb DNA stigen på en 1,4% agarosegel ved elektroforese. For optimale resultater, beis gel med en trygg nukleinsyre flekker løsning etter elektroforese.
6. Chromatin Immunpresipitasjon
MERK: I denne delen bruker lav-oppbevaring 1,5 ml mikrosentrifugerør og minst 1 ml av indikert buffer per rør for å vaske magnetiske kuler i 5 min ved 4 ° C. Før fjerning av bufferen fra kulene, la rørene i magnetisk stativ i 20 til 30 sek hver gang, eller inntil oppløsningen er klar.
- Overføring 10 til 30 pl av supernatanten (skåret kromatin) fra trinn 4.6 til et nytt rør som skal brukes senere som inngangsprøve, som svarer til ca. 1% av totale kromatin som brukes for brikken. Oppbevar ved 4° C inntil chip prøver er klare for å reversere kryssbindinger.
- Overfør den gjenværende kromatin i et nytt rør. For ChIP-qPCR eksperimenter som krever et antistoff kontroll, distribuere like volum av kromatin til to rør.
- Legg chip-grade antistoff (eller tilsvarende antistoffkontroll) til kromatin. Som en røff guide, bruker ca 1 mikrogram av antistoff per én million celler som uttrykker epitop av interesse.
- For mer nøyaktig å beregne mengden av antistoff som er nødvendig per brikke eksperiment kjøres på samme brikke med forskjellige mengder av antistoffer (f.eks, 0,25 ug, 1 ug og 2,5 ug), og sammenligner utbyttet ved negativ og positiv kontroll loci av Chip-qPCR (se § 10). Som et antistoffkontroll, bruker normalt serum fra samme isotype og vertsdyrearter som antistoffet.
- Inkuber på en rotator (10 rpm) O / N ved 4 ° C.
- Vask en tilstrekkelig mengde av antistoff-kompatibel magnetiske kuler en gang med E3 i 5 minutter ent 4 ° C. Sjekk produsentens spesifikasjoner for antistoffbindingskapasitet av kulene (vanligvis 5 til 20 ul av perler binde en mikrogram av IgG-antistoff).
- Legg vaskede perler til antistoffet pre-inkubert kromatin. Videre inkuberes på en rotator (10 rpm) i 4 timer.
- Vask perler fire ganger (ChIP-qPCR) eller ti ganger (ChIP-Seq) med pre-kjølt RIPA buffer, og deretter en gang med pre-kjølt TEN buffer.
- Bare utføre dette trinnet hvis du utfører en chip-Seq eksperiment.
- Resuspender vasket perler i 50 mL av TEN buffer per rør. Pool alle perler fra en enkelt brikke eksperiment ved å overføre dem til en ny tube. Bruk magnetisk stativ og avkjølt (4 ° C) sentrifugering ved 1000 x g for å samle perler på bunnen av røret. Kast så mye væske som mulig uten å forstyrre pelleten av perler.
- Strimmel ChIP materiale av perlene ved å resuspendere kulene i 50 til 100 ul SDS elueringsbuffer og vortexing dem kontinuerlig med en termomikser (1.000 rpm) i 15 min ved 65 ° C. Etter at sentrifuger ved full hastighet (> 15 000 xg) i 30 sek. Overfør supernatanten (ChIP eluatet) til et nytt rør.
- Gjenta det siste trinnet og kombinere chip eluatene.
7. Chromatin Reverse Cross-linking og DNA Purification
- Tilsett nok SDS elueringsbuffer til inngangsprøve (trinn 6.1) til å nå volumet av brikken prøven, noe som er 100 til 200 mikroliter (trinn 6.10). Supplere både chip og inngangsprøver med 1/20 volum av 5 M NaCl. Inkuber prøvene i 6 til 15 timer (O / N) ved 65 ° C i en ovn hybridisering.
- Tilsett 1 volum av TE-buffer og RNase A ved 200 ug / ml. Inkuber i 1 time ved 37 ° C.
- Legg proteinase K ved 200 ug / ml. Inkuber i 2 til 4 timer ved 55 ° C.
- Rense DNA ved fenol: kloroform: isoamylalkohol utvinning fulgt av etanol nedbør som tidligere skissert 9. For ChIP-Seq, legge til 32ul elueringsbuffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,5) for å oppløse DNA-pelleten. La prøvene på is i 30 minutter for å sikre at DNA er fullstendig oppløst.
MERK: Commercial PCR rensing kits har lavere DNA utvinning, men er mer praktisk, og kan brukes til ChIP-qPCR prøver. - For ChIP-Seq, bestemme konsentrasjonen av en ul ChIP og innspill DNA ved hjelp fluorometri baserte metoder. Følg produsentens instruksjoner og sørge for at konsentrasjonen av DNA faller innenfor pålitelig deteksjon spekter av fluorometeret.
8. ChIP-Seq Bibliotek Bygg og validering
MERK: Aktuelle metoder for DNA bibliotek forberedelse tillate bygging av høy kompleksitet biblioteker for NGS fra 1 til 2 ng. På bekostning av noen kompleksitet, kan bibliotekene gjøres fra så lite som 50 pg av DNA (se tabell av konkrete materialer / utstyr). Bruk samme mengde DNA for både ChIP og innspill bibliotek. Kort, til make indeksert (paret-end) Chip-Seq biblioteker, ChIP og innspill DNA må være slutt reparert, ligert til spesielle adaptere (se tabell over spesifikke materiell / utstyr), størrelse valgt og PCR forsterket.
- Følg produsentens retningslinjer for å gjøre Chip-Seq biblioteker. Se diskusjon for videre anbefalinger.
- Elueres hvert bibliotek i 12 pl elueringsbuffer og bestemme konsentrasjonen av en ul av hver ChIP og innspill bibliotek ved hjelp av en fluorometer. Forvente konsentrasjoner på 5 til 25 ng / mL. Betrakt redusere antall PCR-sykluser (færre enn 18 sykluser) dersom konsentrasjonen er høyere enn 25 ng / mL.
MERK: Nøyaktig kvantifisering er nøkkelen til å oppnå optimale NGS resultater. Biblioteker med konsentrasjoner så lave som 1 ng / mL etter 18 PCR-sykluser kan bli sekvensert, men ofte er av lavere kompleksitet. - Bruk en fil av biblioteket for å bestemme fragment størrelsesfordeling og for å se etter noen adapter dimer forurensning (bånd rundt 120 bp) av chip-baserte kapillær elektroforese. Gjenta den faste fase reversibel immobilisering rensing med perler-til-sample-forhold på 1: 1 (i stedet for 1,6: 1) hvis biblioteket inneholder adapter dimerer.
- Utføre qPCR på validert positiv og negativ kontroll loci (se avsnitt 10) for å sjekke om lignende DNA berikelse trender er observert før og etter bibliotek forberedelse. Send kvalitetskontroll godkjente biblioteker for sekvensering.
9. Post-sekvense Analyse og Data Visualisering
MERK: I dag er NGS ofte utført av in-house eller kommersielle sekvense anlegg (se diskusjon for noen NGS retningslinjer). Standard output er én eller flere gzip-komprimert FASTQ filer (* .fastq.gz) lagring av millioner av sekvense leser. Normalt leser multiplexed er allerede skilt i henhold til deres indeks og hver lese inneholder en sekvens identifikator og en kvalitetskontroll score (Phred + 33 for Illumina 1.8+) for hver base samtale. Denne tilnærmingen her er bare en av mange måter hvordan å analysere NGS data. Leseren oppfordres til å sjekke om noen av de følgende kommandolinjer kreve endringer som dette feltet er i rask fremmarsj og oppdateringer er forekommende regelmessig.
- Sette sammen gzip-komprimert FASTQ filer og sjekke kvaliteten på sekvense data ved hjelp av FastQC script. Utføre dette og de fleste av følgende kommandoer for både chip og innspill sekvense data (Eksempler vist for ChIP) fra terminalen:
> Katt /path/to/*.fastq.gz> ChIP.fastq.gz
> Fastqc ChIP.fastq.gz
MERK: Rådata fra den vellykkede sekvensering av en høy kompleksitet ChIP-Seq bibliotek skal passere de fleste tester. Feil stammer hovedsakelig fra fattige sekvensekjøringer og eksperimentelle gjenstander som partisk PCR forsterkning eller adapter forurensning. En viss grad av duplisering (redundans) forventes som overflødig leser kan representere bona fide DNA berikelse - Pre-prosess sekvense data for å fjerne adapter forurensning (homerTools trim -3 <adapter sekvens>) slik at en mismatch (-mis 1). Bruk de første 20 baser av (indeksert) adapter (5 'til 3') proksimalt for DNA fragment av interesse ved ligering (vist for kort listet opp i tabellform Spesifikke materiell / utstyr).
> Gzip -CD ChIP.fastq.gz | fastq_illumina_filter -vN> ChIP.fastq
> homerTools trim -3 GATCGGAAGAGCACACGTCT -mis en -min 36 ChIP.fastq
MERK: Fjerning av filtrert leser (N) er bare nødvendig som standard i FASTQ filer generert av Illumina 1.8. Utelate fastq_illumina_filter kommandoen (dvs.. '| Fastq_illumina_filter -vN')Hvis en eldre versjon enn 1.8 generert sekvensen identifikator. - Justere pre-behandlet leser til referanse genomet (xenTro7) med Bowtie. Bare holde entydig kartlagt leser (-m 1) med standardinnstillinger, dvs. maksimalt to uoverensstemmelser i de første 28 baser og en total Phred + 33 kvalitetspoeng over alle uoverensstemmelser pr lese av maksimal 70. Rapporter justering i SAM-format (-S) . Øke antall megabyte per tråd (--chunkmbs) hvis blings minnet er oppbrukt:
> Bowtie -m en -S -p [# tråder] --chunkmbs [for eksempel 200] xenTro7 ChIP.fastq.trimmed> ChIP.sam
MERK: Bowtie forventer Phred + 33 kvalitetspoeng som standard. Inkluder alternativet - phred64-kvalifisering dersom FASTQ filen ble generert med Phred + 64 kvalitetspoeng av Illumina eldre enn 1.8. - Bruk to HOMER kommandoer for å forvandle justeringen (SAM) fil i en bigwig fil (.bw):
> MakeTagDirectory ChIP / -enkeltrom -tbp en ChIP.sam
> MakeUCSCfile ChIP /-bigWig / sti / til / genome.fa.fai -fsize 1e20 -norm 1E7 -o ChIP.bw
MERK: transformasjon krever stillaset indeks (genome.fa.fai) av referansen genomet (trinn 1.8). Her profilen er begrenset til én kode per basepar (-tbp 1) og normalisert til 10 millioner leser (-norm 1E7). bigwig er en av de foretrukne formatet for dynamisk visual kromatin profiler med et genom nettleser som IGV (trinn 9.12). - Bestemme fordelingen av tags (-d ChIP /) på genomiske landemerker (f.eks +/- 10 kb med 25 bp binger, -Si ze 20000 -hist 25) som transkripsjon start (TSS, eksempel vist her) og terminering ( TTS) nettsteder. Kjør HOMER perl script annotatePeaks.pl med Xenopus merknader xenTro7 (trinn 1.7):
> AnnotatePeaks.pl tss xenTro7 -size 20000 -hist 25 -d ChIP /> ChIP_tagDensity.tss - Finn betydelige topper av DNA berikelse mellom ChIP(-t ChIP.sam) og Input (-c Input.sam) i X. tropic genom hjelp MACS2 med en 1% FDR cutoff (-q 0,01) og DNA-fragmenter (etter sonikasjon) på 200 bp (--bw = 200) for modellbygging. Legg flagget --broad til denne kommandolinjen hvis venter en bred fordeling av kromatin funksjon av interesse, slik som histone merker eller RNA polymerase.
> Macs2 callpeak -t ChIP.sam -c Input.sam -f SAM -n ChIP -G 1.4376e9 -q 0,01 --bw = 200
MERK: Den effektive størrelsen på X. tropic genom montering v7.1 er ca 1437600000 bp (-g 1.4376e9). MACS2 genererer en SENG fil (ChIP_peaks.bed) verve topper med sine genomiske steder. - Sammenligne flere kromatin profiler i form av et gruppert heatmap:
- Lag en tag distribusjonsmatrise fra tag tetthet kataloger av interesse (-d ChIP / other_ChIP /) på MACS2 topper (f.eks +/- 1 kb med 25 bp binger, -size 2000 -hist 25 -ghist):
> AnnotatePeaks.pl ChIP_peaks.bed xenTro7 -size 2000 -hist 25 -ghist -d ChIP / other_ChIP /> ChIP.matrix - Bruke det grafiske brukergrensesnittet til Cluster3 å laste opp ChIP.matrix fil og hierarkisk cluster disse tag tettheter basert på minimal Euklidsk avstand til nærmeste Tyngdepunktet. Åpne genererte CTD-fil i Java Utforsker til å visualisere clustering.
- Lag en tag distribusjonsmatrise fra tag tetthet kataloger av interesse (-d ChIP / other_ChIP /) på MACS2 topper (f.eks +/- 1 kb med 25 bp binger, -size 2000 -hist 25 -ghist):
- Finn roman og tidligere kjente bindende motiver, som er beriket på topp toppene +/- 100 bp (-Størrelse 200). Bruk annotatePeaks.pl å kartlegge motiv forekomster og å plotte motiv tettheter:
> FindMotifsGenome.pl ChIP_peaks.bed xenTro7 ChIP_motifs / -size 200 -p [# tråder]
> AnnotatePeaks.pl ChIP_peaks.bed xenTro7 -m motif1.motif> ChIP_peaks.motif1
> AnnotatePeaks.pl ChIP_peaks.bed xenTro7 -m motif1.motif -size 800 -hist 25> motif1.density
MERK: findMotifsGenome.pl script infers den berikelse fra sammenligningen til tilfeldig valgte gen-sentriske bakgrunns sekvenser. Den mest beriket roman Motivet er lagret under motif1.motif i formatet på en stilling vekt matrise. Leseren oppfordres til å underbygge disse resultatene med andre de novo motiv oppdagelse metoder som cisFinder 22 og MEME 23. - Kommentere topper ved å beregne avstanden til nærmeste gen og ved å bestemme deres normalisert lese telling innenfor 400 bp vinduer (-Størrelse 400):
> AnnotatePeaks.pl ChIP_peaks.bed xenTro7 -Størrelse 400 -d chip / Input /> ChIP_peaks.genes - Oppsummer utgang ved hjelp av følgende awk kommando for å liste antall (N), plassering og normalisert lese telling av individuelle (R) og alle (LR) topper pr nærmeste (mål) genet.
> Awk 'BEGIN {FS =' t '} $ 7> = -5000 && $ 7 <= 1000
{N [$ 8] + = 1; R [$ 8] + = $ 9; LR [$ 8] = LR [$ 8] ', og# 39, $ 7 '(' $ 9 ')'} END {for (i i N)
{Print i ' t' N [i] ' t' R [i] ' t' substr (LR [i], 2)}} ChIP_peaks.genes> ChIP_peaks.summary
MERK: Tallet etter $ refererer til kolonnenummeret, som kanskje må modifisere til å passe ChIP_peaks.genes filen ble opprettet i forrige trinn. Dette skriptet eksemplar filtrerer ut topper utover 5 kb oppstrøms og en kb nedstrøms av TSS. $ 7, $ 8 og $ 9 refererer til avstanden til TSS, genet identifikasjonen og normalisert lese teller per topp, henholdsvis. - Utføre analysen av beriket GO vilkår blant målgener som følger:
- Starte det grafiske brukergrensesnittet til Blast2GO fra kommandolinjen via Java Web Start (javaws) 19.
> Javaws http://blast2go.com/webstart/blast2go1000.jnlp - Følg utviklernes instruksjonene for å laste opp merknadenfil for Xenopus gener (xenTro7.annot) som genereres i 1.9.4 og en flat fil av identifiserte mål gener. Sørg for at det samme genet identifikatorer brukes i begge filer.
- Starte det grafiske brukergrensesnittet til Blast2GO fra kommandolinjen via Java Web Start (javaws) 19.
- Visualisere kromatin profiler ved å legge bigwig (ChIP.bw, Input.bw) og BED-filer (ChIP_peaks.bed) inn IGV som spor. Komplement data med RNA-Seq spor hvis det er tilgjengelig for den samme utviklingstrinn. Lagre resultater som en økt.
- Bruk programmering plattformer R (www.r-project.org) eller MATLAB til ytterligere manipulere og visualisere data som genereres ovenfor. Alternativt plotte små datasett med Excel.
10. ChIP-qPCR for Testing ChIP og Bekrefte ChIP-Seq
- Bruke den elektroniske plattformen Primer3 å designe primere rundt ca 100 bp DNA ved 60 ° C (T m) for både positive (peak-spesifikke) og negative kontroll loci. Bekreft primer spesifisitet ved hjelp av in silico
- Lag en 8-punkts standardkurve av tre-ganger fortynninger med start fra cirka 1% inngang eller bruke 2 - ΔΔC (T) 8,24 fremgangsmåte for kvantifisering av DNA-oppformering.
- Utføre sanntids-PCR i tekniske triplikater for alle prøvene, dvs. ChIP, kontroll og, om nødvendig, standardkurve prøver.
- Plot DNA oppformering som prosentandelen av inngangs DNA eller som et forhold mellom ChIP versus kontrollprøve på både positive og negative kontroll loci.
Representative Results
Tilsvarende resultater som de som presenteres her er ventet om protokollen er godt utført og antistoff i bruk er av ChIP grad av kvalitet (se diskusjon). Denne protokollen tillater utvinning av kjerner fra formaldehyd-fikserte Xenopus embryoer og effektiv klipping av kromatin ved sonikering (figur 1A-C). Skjærbehandlet kromatin viser en asymmetrisk fordeling av DNA-fragmenter som hovedsakelig strekker seg fra 100 til 1000 bp og peaking mellom 300 og 500 bp (figur 1C). En minimal 50 pg av immunpresipitert DNA er nødvendig for å kunne gjøre en indeksert parvise end ChIP-Seq bibliotek med tilsvarende størrelse DNA innsatser (Figur 2A). Biblioteket skal være stort sett blottet for adapter dimerer, som kan sees på elektroferogrammet på ca 120 bp.
Ved sekvensering-for-syntese, pre-behandlet leser er kartlagt til genomet (figur 2B, C). I et vellykket eksperiment med
Chip-Seq eksperimenter tillate utforske genom-wide karakteristikker av kromatin funksjoner. For eksempel kan beregne lese distribusjon over genomiske elementer som transkripsjon start og termineringssider fremheve noen romlige bindende preferanser rundt gener (Figur 3C). Tilsvarende er en heatmap av lese distribusjoner på topp steder brukes til å sammenligne ulike kromatin funksjoner til en genom-wide skala (Figur 3D). Visse transkripsjonsfaktorer binder DNA sekvens-spesifikt. De novo motiv analyse av genomisk DNA underliggende topper kan hente denne type informasjon, inkludert co-beriket motiver av potensielle co-faktorer (Figur 3E). Det store flertallet av målgener viser DNA belegg på et lavere heller enn høyere nivå (Figur 3F). Denne skalaen frie funksjonen ser ut til å være ganske vanlig blant transcription faktorer og antyder at bare en liten brøkdel av målgener er direkte regulert med biologisk relevans 27,28. Analysen av beriket GO vilkår eller andre attributter som differensial uttrykk for mål gener kan videre avsløre innsikt i den biologiske funksjonen til kromatin funksjonen i Xenopus embryo (figur 3G).
Figur 1. Chromatin immunoprecipitation prosedyre for Xenopus embryoer. (A) Embryoet er formaldehyd-fiksert på utviklingsstadiet av interesse for kovalent binding (cross-link) eventuelle proteiner assosiert med genomisk DNA. Ved atom utvinning (B), er krysskoblet kromatin fragmentert å innskrenke genomisk DNA bindende eller kromatin modifikasjons områder ved å minimere flankerer DNEn sekvens (C). Deretter blir kromatin fragmenter immunpresipitert med en chip-grade antistoff for å berike de som inneholder epitop av interesse (D). Co-immunopresipitert DNA er strippet av protein og renset (E) før du oppretter ChIP fragment biblioteket for NGS (figur 2). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. ChIP-Seq bibliotek forberedelse, sekvensering-for-syntese, kartlegging og peak ringer. (A) elektroferogrammet viser en god ChIP-Seq bibliotek med DNA-maler av 250-450 bp. Disse malene innebærer DNA innskuddet av interesse flankert av den universelle (58 bp) og indeksert (63 bp) adapter. (B) (C) bare lesninger som kart entydig til Xenopus genomet holdes. Som alle bitene sekvensert fra 5'-enden, kartlegging av ChIP leser resulterer i trådspesifikke topper som flankerer kromatin funksjonen av interesse. Dermed peak innringere oppdage berikelse som stammer fra immunpresipitering og forlenge leser til en gjennomsnittlig fragment lengde for å nøyaktig lokalisere kromatin funksjoner. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Et eksempel på post-sekvense analyse og visualisering av data ved hjelp av zygotiske T-box transkripsjonsfaktor Vegt (zVegT). Alle leste tellinger som vises her er normalisert til 10 millioner entydig tilordnet og ikke-redundante leser. (A) Utdrag av genomet-wide profilen til zVegT binding i X. Tropic gastrula embryoer (stadium 11 til 12,5 etter Nieuwkoop og Faber 29). Hver topp, en haug-up av utvidet leser, representerer en bindingssetet. Disse toppene er kalt av MACS2 med en falsk funnrate (FDR) på mindre enn 1%. Hver MESP genet viser svært proksimale og oppstrøms zVegT bindende, men bare mespa og mespb uttrykkes på det stadiet (RNA-Seq data 30). (B) DNA belegget på zVegT som bestemmes av ChIP-qPCR på flere loci (inkludert en ikke -bundet region 0,5 kb oppstrøms β aktin) konfirm den spesifikke berikelse funnet av Chip-sekv. Sammenligne resultater for mespa med peak kalt (rød søyle) i (A). DNA belegg nivå visualiseres som en prosentdel av inngangs for begge, chip med Vegt antistoff (kanin-polyklonal IgG-isotype) og brikken med antistoffkontroll (normal kanin IgG). Feilstolper reflektere standardavviket for to biologiske replikater. (C) Metagene analyse viser preferensiell zVegT binding (tags binned over 25 bp) til promotoren i forhold til ethvert annet genomisk område rundt og inne i gen organer. (D) Heatmap viser k-midlere gruppert (k = 5) DNA belegget (tags binned over 25 bp) av zVegT og Smad2 / Smad3 (Chip-Seq data 31) i forhold til alle zVegT-bundet regioner på gastrulastadiet. Heatmap er å logge to basert og sentrert på 5 koder per bp. (E) De novo motiv analyse oppdager den kanoniske T-box transkripsjonsfaktor bindende motiv i 38% av zVegT-bundet regioner dersom den underliggende motiv poengsum er normalisert til en 5% funnrate i bakgrunnen sekvenser. Tettheten Kartet viser høyest berikelse for T-box motiv i sentrum av zVegT bindingsseter, mens den kanoniske Smad2 / Smad3 bindende motivet er neppe beriket. (F) Histogram viser DNA belegget på zVegT, som er beregnet for hvert mål genet fra alle topper (+/- 200 bp) mellom 5 kb oppstrøms [-]. og 1 kb nedstrøms [+] av tilsvarende transkripsjon startsider (G) Topp 300 gener med høyeste DNA belegget innenfor -5 kb og 1 kb er beriket for biologiske prosesser av tidlig embryoutvikling. Disse går uttrykk er i tråd med den antatte funksjon av zVegT. FDR er basert på en to-tailed Fishers eksakte test og korrigert for multippel testing. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Discussion
Vår protokoll skisserer hvordan å lage og analysere genom kromatin profiler fra Xenopus embryoer. Den dekker alle trinn fra tverrbindende proteiner til endogene loci in vivo for å behandle millioner av leser representerer beriket genomiske steder i silico. Siden stadig flere genom utkast er tilgjengelig, bør denne protokollen være aktuelt å modell for andre og ikke-modellorganismer. Det viktigste eksperimentelle delen, som setter denne protokollen bortsett fra tidligere arbeid 8,31,33,34, er den post-fiksering prosedyre for å trekke krysskoblede kjerner. Det muliggjør effektiv kromatin løseliggjøring og klipping og enkel oppskalering. Sammen med forbedrede effektiviteten av bibliotek forberedelse denne protokollen tillater bygging av høy kompleksitet chip-Seq biblioteker fra en halv til to millioner celler som uttrykker kromatin-assosiert epitop av interesse. For ChIP-qPCR eksperimenter, noen ti tusen av disse cellene er normalt nokfor å se etter DNA berikelse på kanskje seks forskjellige genomisk loci. Disse tallene er konservative anslag, men kan variere avhengig av proteinekspresjon nivå, antistoff kvalitet, tverrbindingseffektivitet, og epitop tilgjengelighet. Som en veiledning, inneholder et enkelt Xenopus embryo omtrent 4000 celler ved midten blastula trinn (8,5 etter Nieuwkoop og Faber 29), 40 000 celler ved slutten gastrulastadiet (12) og 100 000 celler på et tidlig stadium tailbud (20).
Den nøyaktige fiksering tid for effektiv immunoprecipitation må bestemmes empirisk av Chip-qPCR (§ 10). Generelt er lengre festetider nødvendig hvis forsøket innebærer X. laevis embryoer, tidlige utviklingsstadier, og svake (eller indirekte) DNA-bindende egenskaper. Men det er ikke anbefalt å fikse Xenopus embryo lenger enn 40 min, eller behandler flere embryoer enn angitt (§ 3), som kromatin klipping blir mindre effektiv. Det er viktig ikkeå bruke noen glysin etter fiksering som denne felles skritt for å slukke formaldehyd kan gjøre kjernekraft utvinning fra plommerike embryo svært vanskelige. For tiden, er grunnen til dette ikke er kjent. Det er tenkelig at formaldehyd-glycin-addukt reagerer videre med N-terminal amino-grupper eller argininrester 35.
Antistoffet er nøkkelen til enhver ChIP eksperiment og tilstrekkelig kontroller må bli utført for å vise dens spesifisitet for epitopen av interesse (se veiledning av Landt et al. 36). Hvis ingen ChIP klasse antistoff er tilgjengelig, kan innføring av tilsvarende epitop-tagget fusjonsproteiner være en legitim alternativ som disse proteinene kan oppta endogene bindingsseter 37. I dette tilfellet, uinjiserte embryoer som er best å bruke som en negativ kontroll i stedet for en brikke med ikke-spesifikk serum. Denne strategi kan også anvendes dersom proteinet av interesse er uttrykt ved lave nivåer som resulterer i dårlig gjenvinning av EnriChed DNA.
Som for å lage chip-Seq biblioteker, på grunn av den lave mengden av DNA i bruk, anbefales det å velge prosedyrer som reduserer antall rengjøringstrinn og å kombinere reaksjoner for å holde tap av DNA på et minimum. Adaptere og primere må være kompatibel med multiplex sekvensering og NGS platform (se tabell av konkrete materialer / utstyr). Ved hjelp av Y-adaptere (inneholdende lange enkelt-trådede armer), er det avgjørende å pre-amplifisere biblioteket med 3-5 runder med PCR-størrelse før valg av DNA-innskudd (f.eks., 100 til 300 bp) ved gelelektroforese. Enkelttrådete ender forårsake DNA-fragmenter å migrere heterogent. Prøvekjøringer med forskjellige mengder av inngangs DNA (for eksempel, 0,1, 0,5, 1, 2, 5, 10 og 20 ng) anbefales for å bestemme det totale antall PCR-sykluser (mindre enn eller lik 18 sykluser) som kreves for å gjøre en størrelse -selected bibliotek på 100 til 200 ng. Redusere antall PCR-sykluser gjengir sekvensering av redundant leser mindre sannsynlig. Solid fase reversible immobilisering perler er god rydde opp reagenser for å effektivt gjenopprette DNA av interesse og pålitelig fjerne noen gratis adaptere og dimerer fra ligering og PCR reaksjoner.
I form av antall, type og lengde av lyder, rundt 20-30 millioner single-end leser av 36 bp er nok for de fleste chip-Seq eksperimenter for å dekke hele Xenopus genomet med tilstrekkelig dybde. De mest utbredte NGS maskiner er rutinemessig stand til å møte disse kriteriene. Imidlertid kan det være fordelaktig å øke antall lyder hvis en bred fordeling av lyder er forventet, som observert med histonmodifikasjonene, heller enn skarpe topper. For mange chip-Seq eksperimenter, kan 4-5 annerledes indekserte bibliotekene samles og sekvensert i en flyt celle kjørefelt ved hjelp av en høy-ytelse NGS maskin. Noen ganger er også tilrådelig å forlenge lese lengde og sekvens begge ender av DNA-templatet (sammenkoblet ende) for å øke mappability whøne analysere kromatin innenfor repetitive genomiske regioner.
Denne protokollen har blitt brukt med hell til et bredt spekter av kromatin funksjoner som transkripsjonsfaktorer, signal meklere og posttranslasjonelle histonmodifikasjonene. Men embryoer erverve en økende grad av cellulær heterogenitet som de utvikler og kromatin profiler blir vanskeligere å tolke. Lovende tiltak har blitt gjort i Arabidopsis og Drosophila til vev-spesifikt profil kromatin landskap ved å trekke ut celletypespesifikke kjerner 38,39. Vår Protokollen inkluderer en kjernefysisk utvinning skritt, noe som kan bane vei for vevsspesifikt ChIP-Seq i andre embryoer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1/16 inch tapered microtip | Qsonica | 4417 | This microtip is compatible with Sonicator 3000 from Misonix and Q500/700 from Qsonica. |
| 8 ml glass sample vial with cap | Wheaton | 224884 | 8 ml clear glass sample vials for aqueous samples with 15-425 size phenolic rubber-lined screw caps. |
| Adaptor | e.g., IDT or Sigma | NA | TruSeq universal adaptor,
AATGATACGGCGACCACCGAG ATCTACACTCTTTCCCTACAC GACGCTCTTCCGATC*T. TruSeq indexed adaptor, P-GATCGGAAGAGCACACGTC TGAACTCCAGTCAC ‐NNNNNN‐ ATCTCGTATGCCGTCT TCTGCTT*G. *, phosphorothioate bondphosphate group at 5' end. NNNNNN, index (see TruSeq ChIP Sample Preparation Guide for DNA sequence). Order adaptors HPLC purified. Adaptors can be prepared by combining equimolar amounts (each 100 µM) of the universal and the indexed adaptor and cooling them down slowly from 95 °C to room temperature. Use 1.5 pmol per ng of input DNA. Store at -20 °C. |
| b2g4pipe (software) | Blast2GO | non-commercial | http://www.blast2go.com/data/blast2go/b2g4pipe_v2.5.zip |
| BLAST+ (software) | Camacho et al. | non-commercial | http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PAGE_TYPE=BlastDocs& DOC_TYPE=Download |
| Bowtie (software) | Langmead et al. | non-commercial | http://bowtie-bio.sourceforge.net/index.shtml |
| cisFinder (software) | Sharov et al. | non-commercial | http://lgsun.grc.nia.nih.gov/CisFinder/ |
| Chip for capillary electrophoresis | Agilent Technologies | 5067-1504 | Load this chip with 1 µl DNA for library quality control. Store at 4 °C. |
| Chip-based capillary electrophoresis system | Agilent Technologies | G2940CA | The Agilent 2100 BioAnalyzer is used to check the quality of ChIP-Seq libraries. Keep reagents at 4 °C. |
| ChIP-Seq library preparation kit (KAPA Hyper Prep Kit) | Kapa Biosystems | KK8504 | Kit contains KAPA end repair and A-tailing enzyme mix, end Repair and A-tailing buffer, DNA ligase, ligation buffer, KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2X), and KAPA library amplification primer mix (10X) (see also PCR primers). Adaptors are not included. Store at -20 °C. |
| ChIP-Seq library preparation kit (alternative, ThruPLEX-FD Prep Kit) | Rubicon Genomics | R40048 | Kit uses their own stem-loop adaptors and primers. This kit eliminates intermediate purification steps and is as sensitive as the KAPA Hyper Prep Kit. Store at -20 °C. |
| Cluster3 (software) | de Hoon et al. | non-commercial | http://bonsai.hgc.jp/~mdehoon/software/cluster |
| FastQC (software) | Simon Andrews | non-commercial | http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc |
| Fluorometer | life technologies | Q32866 | Qubit 2.0 Fluorometer |
| Fluorometer reagents | life technologies | Q32851 | The kit provides concentrated assay reagent, dilution buffer, and pre-diluted DNA standards for the Qubit fluorometer. Store DNA standards at 4 °C, buffer and dye at room temperature. |
| Formaldehyde | Sigma | F8775-4X25ML | Formaldehyde solution, for molecular biology, 36.5-38% in H2O, stabilised with 10-15% methanol. Store at room temperature. CAUTION: Formaldehyde is corrosive and highly toxic. |
| Gel (E-Gel EX agarose , 2%) | life technologies | G4010 | Pre-cast gel with 11 wells, openable format. Leave one lane between ladder and library empty to avoid cross-contamination. Store gels at room temperature. |
| Gel electrophoresis system | life technologies | G6465 | E-Gel iBase and E-Gel Safe Imager combo kit for size-selecting ChIP-Seq libraries. |
| Gel extraction kit | Qiagen | 28706 | Store all reagents at room temperature. Use 500 µl of QG buffer per 100 mg of 2% agarose gel slice to extract DNA. Use MinElute columns (from MinElute PCR purification kit) to elute DNA twice. |
| HOMER (software) | Chris Benner | non-commercial | http://homer.salk.edu/homer/index.html |
| Hybridization oven | Techne | FHB1D | Hybridizer HB-1D |
| IGV (software) | Robinson et al. | non-commercial | http://www.broadinstitute.org/igv/home |
| Illumina CASAVA-1.8 quality filter (software) | Assaf Gordon | non-commercial | http://cancan.cshl.edu/labmembers/gordon/fastq_illumina_filter |
| Java TreeView (software) | Alok Saldanha | non-commercial | http://jtreeview.sourceforge.net |
| Laboratory jack | Edu-Lab | CH0642 | This jack is used to elevate sample in sound enclosure for sonication. |
| Ladder, 100 bp | New England BioLabs | N3231 | Keep 1x solution at room temperature. Store stock at -20 °C. |
| Ladder, 1 kb | New England BioLabs | N3232 | Keep 1x solution at room temperature. Store stock at -20 °C. |
| Low-retention 1.5-ml microcentrifuge tubes | life technologies | AM12450 | nonstick, RNase-free microfuge tubes, 1.5 ml |
| MACS2 (software) | Tao Liu | non-commercial | https://github.com/taoliu/MACS |
| Magnetic beads | life technologies | 11201D | These Dynabeads are superparamagnetic beads with affinity purified polyclonal sheep anti-mouse IgG covalently bound to the bead surface. Store at 4 °C. |
| Magnetic beads | life technologies | 11203D | These Dynabeads are superparamagnetic beads with affinity purified polyclonal sheep anti-rabbit IgG covalently bound to the bead surface. Store at 4 °C. |
| Magnetic beads | life technologies | 10001D | These Dynabeads are superparamagnetic beads with recombinant protein A covalently bound to the bead surface. Store at 4 °C. |
| Magnetic beads | life technologies | 10003D | These Dynabeads are superparamagnetic beads with recombinant protein G covalently bound to the bead surface. Store at 4 °C. |
| Magnetic rack | life technologies | 12321D | DynaMag-2 magnet |
| MEME | Bailey et al. | non-commercial | http://meme.nbcr.net/meme/ |
| Na3VO4 | New England BioLabs | P0758 | Sodium orthovanadate (100 mM) is a commonly used general inhibitor for protein phosphotyrosyl phosphatases. Store at -20 °C. |
| NaF | New England BioLabs | P0759 | Sodium fluoride (500 mM) is commonly used as general inhibitor of phosphoseryl and phosphothreonyl phosphatases. Store at -20 °C. |
| NGS machine | Illumina | SY-301-1301 | Genome Analyzer IIx |
| NGS machine (high performance) | Illumina | SY-401-2501 | HiSeq |
| Normal serum (antibody control) | Santa Cruz Biotechnology | sc-2028 | Use as control for goat polyclonal IgG antibodies in ChIP-qPCR experiments. Store at 4 °C. |
| Normal serum (antibody control) | Santa Cruz Biotechnology | sc-2025 | Use as control for mouse polyclonal IgG antibodies in ChIP-qPCR experiments. Store at 4 °C. |
| Normal serum (antibody control) | Santa Cruz Biotechnology | sc-2027 | Use as control for rabbit polyclonal IgG antibodies in ChIP-qPCR experiments. Store at 4 °C. |
| Nucleic acid staining solution | iNtRON | 21141 | Use RedSafe nucleic acid staining solution at 1:50,000. Store at room temperature. |
| Orange G | Sigma | O3756-25G | 1-Phenylazo-2-naphthol-6,8-disulfonic acid disodium salt. Store at 4 °C. |
| PCR primers | e.g., IDT or Sigma | Primers to enrich adaptor-ligated DNA fragments by PCR: AATGATACGGCGACCACCGA*G and CAAGCAGAAGACGGCATACGA*G, phosphorothioate bond. Primers designed by Ethan Ford. Combine primers at 5 µM each. Use 5 µl in a 50 µl PCR reaction. Store at -20 °C. | |
| MinElute PCR purification kit | Qiagen | 28006 | for purification of ChIP-qPCR and shearing test samples. Store MinElute spin columns at 4 °C, all other buffers and collection tubes at room temperature. |
| Phenol:chloroform:isoamyl alcohol (25:24:1, pH 7.9) | life technologies | AM9730 | Phenol:Chloroform:IAA (25:24:1) is premixed and supplied at pH 6.6. Use provided Tris alkaline buffer to raise pH to 7.9. Store at 4 °C. CAUTION: phenol:chloroform:isoamyl alcohol is corrosive, highly toxic and combustible. |
| Primer3 (software) | Steve Rozen & Helen Skaletsky | non-commercial | http://biotools.umassmed.edu/bioapps/primer3_www.cgi |
| Protease inhibitor tablets | Roche | 11836170001 | cOmplete, Mini, EDTA-free. Use 1 tablet per 10 ml. Store at 4 °C. |
| Protease inhibitor tablets | Roche | 11873580001 | cOmplete, EDTA-free. Use 1 tablet per 50 ml. Store at 4 °C. |
| Proteinase K | life technologies | AM2548 | proteinase K solution (20 µg/µl). Store at -20 °C. |
| RNase A | life technologies | 12091-039 | RNase A (20 µg/µl). Store at room temperature. |
| Rotator | Stuart | SB3 | Rotator SB3 |
| SAMtools (software) | Li et al. | non-commercial | http://samtools.sourceforge.neta |
| Solid phase reversible immobilisation beads | Beckman Coulter | A63882 | The Agencourt AMPure XP beads are used to minimise adaptor dimer contamination in ChIP-Seq libraries. Store at 4 °C. |
| Sonicator 3000 | Misonix/Qsonica | Newer models are now available. Q125, Q500 or Q700 are all suitable for shearing crosslinked chromatin. | |
| Sound enclosure | Misonix/Qsonica | optional: follow the manufacturer's recommendation to obtain the correct sound enclosure. | |
| Thermomixer | eppendorf | 22670000 | Thermomixer for 24 x 1.5 mL tubes. Precise temperature control from 4 °C above room temperature to 99 °C. |
References
- Gilmour, D. S., Lis, J. T. Detecting protein-DNA interactions in vivo: distribution of RNA polymerase on specific bacterial genes. Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (14), 4275-4279 (1984).
- Gilmour, D. S., Lis, J. T. In vivo interactions of RNA polymerase II with genes of Drosophila melanogaster. Mol Cell Biol. 5 (8), 2009-2018 (1985).
- Solomon, M. J., Larsen, P. L., Varshavsky, A. Mapping protein-DNA interactions in vivo with formaldehyde: evidence that histone H4 is retained on a highly transcribed gene. Cell. 53 (6), 937-947 (1988).
- Ren, B., et al. Genome-wide location and function of DNA binding proteins. Science. 290 (5500), 2306-2309 (2000).
- Johnson, D., Mortazavi, A., Myers, R., Wold, B. Genome-wide mapping of in vivo protein-DNA interactions. Science. 316 (5830), 1497-1502 (2007).
- Hellsten, U., et al. The genome of the Western clawed frog Xenopus tropicalis. Science. 328 (5978), 633-636 (2010).
- Lee, T. I., Johnstone, S. E., Young, R. A. Chromatin immunoprecipitation and microarray-based analysis of protein location. Nature Protocols. 1 (2), 729-748 (2006).
- Blythe, S. A., Reid, C. D., Kessler, D. S., Klein, P. S. Chromatin immunoprecipitation in early Xenopus laevis embryos. Dev Dyn. 238 (6), 1422-1432 (2009).
- Gentsch, G. E., Smith, J. C. Investigating physical chromatin associations across the Xenopus genome by chromatin immunoprecipitation. Cold Spring Harb Protoc. 2014 (5), (2014).
- Ubbels, G. A., Hara, K., Koster, C. H., Kirschner, M. W. Evidence for a functional role of the cytoskeleton in determination of the dorsoventral axis in Xenopus laevis eggs. J Embryol Exp Morphol. 77, 15-37 (1983).
- Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biol. 10 (3), R25 (2009).
- Li, H., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).
- Heinz, S., et al. Simple combinations of lineage-determining transcription factors prime cis-regulatory elements required for macrophage and B cell identities. Mol Cell. 38 (4), 576-589 (2010).
- Zhang, Y., et al.
- Robinson, J. T., et al.
- Thorvaldsdottir, H., Robinson, J. T., Mesirov, J. P. Integrative Genomics Viewer (IGV): high-performance genomics data visualization and exploration. Brief Bioinform. 14 (2), 178-192 (2013).
- Imoto, S., Nolan, J., Bioinformatics Miyano, S. 20 (9), 1453-1454 (2004).
- Camacho, C., et al.
- Conesa, A., et al. Blast2GO: a universal tool for annotation, visualization and analysis in functional genomics research. Bioinformatics. 21 (18), 3674-3676 (2005).
- Sive, H., Grainger, R., Harland, R. Early development of Xenopus laevis: A laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. (2000).
- Chen, Y., et al. Systematic evaluation of factors influencing ChIP-seq fidelity. Nat Methods. 9 (6), 609-614 (2012).
- Sharov, A. A., Ko, M. S. H. Exhaustive search for over-represented DNA sequence motifs with CisFinder. DNA Res. 16 (5), 261-273 (2009).
- Bailey, T. L., et al. MEME SUITE: tools for motif discovery and searching. Nucl Acids Res. 37 (2), W202-W208 (2009).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Park, P. J. ChIP-seq: advantages and challenges of a maturing technology. Nat Rev Genet. 10 (10), 669-680 (2009).
- Gentsch, G. E., et al. In vivo T-box transcription factor profiling reveals joint regulation of embryonic neuromesodermal bipotency. Cell Rep. 4 (6), 1185-1196 (2013).
- Barabasi, A. L., Oltvai, Z. N. Network biology: understanding the cell's functional organization. Nat Rev Genet. 5 (2), 101-113 (2004).
- Biggin, M. D. Animal transcription networks as highly connected, quantitative continua. Dev Cell. 21 (4), 611-626 (2011).
- Nieuwkoop, P. D., Faber, J. Normal table of Xenopus laevis (Daudin): a systematical and chronological survey of the development from the fertilized egg till the end of metamorphosis. , Garland. New York & London. (1994).
- Akkers, R. C., et al. A hierarchy of H3K4me3 and H3K27me3 acquisition in spatial gene regulation in Xenopus embryos. Dev Cell. 17 (3), 425-434 (2009).
- Yoon, S. J., Wills, A. E., Chuong, E., Gupta, R., Baker, J. C. HEB and E2A function as SMAD/FOXH1 cofactors. Genes Dev. 25 (15), 1654-1661 (2011).
- Jallow, Z., Jacobi, U. G., Weeks, D. L., Dawid, I. B., Veenstra, G. J. Specialized and redundant roles of TBP and a vertebrate-specific TBP paralog in embryonic gene regulation in Xenopus. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (37), 13525 (2004).
- Buchholz, D. R., Paul, B. D., Shi, Y. -B. Gene-specific changes in promoter occupancy by thyroid hormone receptor during frog metamorphosis. Implications for developmental gene regulation. J Biol Chem. 280 (50), 41222-41228 (2005).
- Wills, A. E., Guptaa, R., Chuonga, E., Baker, J. C. Chromatin immunoprecipitation and deep sequencing in Xenopus tropicalis and Xenopus laevis. Methods. 66 (3), 410-421 (2014).
- Metz, B., et al. Identification of formaldehyde-induced modifications in proteins: reactions with model peptides. J Biol Chem. 279 (8), 6235-6243 (2004).
- Landt, S. G., et al. ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia. Genome Res. 22 (9), 1813-1831 (2012).
- Mazzoni, E. O., et al. Embryonic stem cell-based mapping of developmental transcriptional programs. Nat Methods. 8 (12), 1056-1058 (2011).
- Deal, R. B., Henikoff, S. A simple method for gene expression and chromatin profiling of individual cell types within a tissue. Dev Cell. 18 (6), 1030-1040 (2010).
- Bonn, S., et al. Tissue-specific analysis of chromatin state identifies temporal signatures of enhancer activity during embryonic development. Nat Genet. 44 (2), 148-156 (2012).
