방법 논문

인간 면역 결핍 바이러스의 복제 피트니스를 결정하기위한 인접 쌍 성장 경쟁 분석

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DOI:

10.3791/52610

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2015년 5월 4일

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1Department of Microbiology, University of Washington, 2Departments of Medicine and Laboratory Medicine, University of Washington, 3U.S Military HIV Research Program, Walter Reed Army Institute of Research, 4Henry M. Jackson Foundation

이 논문에서

요약

거의 동종발생 바이러스 간의 성장 경쟁은 상대적 복제 적합성을 결정하기 위한 민감한 측정을 제공합니다. 여기에 설명된 프로토콜에는 재조합 HIV-1 클론의 구축, 바이러스 전파 및 성장 경쟁, 민감하고 일관된 결과를 산출하도록 최적화된 분석 방법이 포함됩니다.

초록

체외 적합성 분석은 HIV-1과 같은 바이러스에 대한 바이러스 복제 적합성을 결정하기 위한 필수 도구입니다. 바이러스 복제 적합성을 추정하기 위해 감염 단위당 바이러스 입자 수, 세포 배양에서의 성장률, 다중 주기 성장 경쟁 분석에서 파생된 상대적 적합성에 이르기까지 다양한 측정이 사용되었습니다. 성장 경쟁 분석은 바이러스가 동일한 성장 조건에서 세포 표적을 놓고 경쟁하기 때문에 특히 민감한 적합성 측정을 제공합니다. 성장 경쟁 분석을 수행할 때 고려해야 할 몇 가지 실험 요소가 있으며, 여기에는 감염의 다양성(MOI), 샘플링 시간, 바이러스 검출 및 적합성 계산 방법이 포함됩니다. 각 요인은 최종 결과에 영향을 미칠 수 있으므로 실험 설계 중에 신중하게 고려해야 합니다. 여기에 제시된 프로토콜에는 새로운 재조합 HIV-1 클론 구축부터 성장 경쟁 분석 수행 및 실험 결과 분석에 이르는 단계가 포함됩니다. 이 프로토콜은 일관되고 강력한 결과를 산출하기 위해 이전에 표시된 실험적 매개변수 값을 활용합니다. 연구 중인 세포 유형과 바이러스에 따라 일부 매개변수를 조정해야 하므로 대안에 대해 논의합니다. 이 프로토콜에는 두 가지 대체 바이러스 검출 방법이 포함되어 있어 기기, 시약 및 전문 지식의 가용성이 실험실마다 다르기 때문에 유연성을 제공합니다.

서론

바이러스 복제의 니스는 주어진 환경에서 한 감염성 자손을 생산하는 바이러스의 능력으로 정의하고 2 시간 이상 인구 수준에서 바이러스 변이체의 유병률을 결정하는 중요한 요인이다. 생체으로 피트니스 연구는 HIV-1과 같은 병원성 인간 바이러스, 다양한 vitro와 in와 가능하지 않은 생체 복제 피트니스 분석 약제 내성과 면역 탈출 돌연변이, 상위 성 및 진화에서 발생하는 체력에 미치는 영향을 연구하기 위해 개발되었다 바이러스 성 인구 3-6. 다른 피트니스 분석 중 성장 경쟁 분석은 생체 -1,7,8,8- 발생으로 두 개 이상의 바이러스 변종, 정확하게 동일한 환경 조건 하에서 동일한 세포 인구를위한 경쟁으로, 피트니스 차이에 더 민감하고 유효한 조치를 얻을에 인식하고 있습니다. 성장 경쟁 실험을 시작, 여러 variab 전레 감염의 다양한 다중성 (MOI), 바이러스의 입력 비율 및 분석을위한 샘플링 타이밍의 사용을 포함하여 결정되어야한다. 우리는 바이러스 성 성장 속도론에 경쟁 실험의 결과에 이러한 매개 변수의 효과를 공부하고, 세포 배양 9 HIV-1의 적합성에 강력한 측정에 필요한 핵심 요소를 확인했다.

분석 변수 외에도, 성장 경쟁 실험에서 바이러스 변이체를 정량을위한 다양한 방법이있다. 10,11 또는 벌크 클론 시퀀싱 12,13은 관심 부위 (들)에서 뉴클레오티드 주파수에 기초하여 상기 경쟁 바이러스의 비율을 결정하기 위해 사용되어왔다. 상대 체력은 시간이 지남에 따라이 비율의 변화에​​서 파생됩니다. DNA 시퀀싱 서비스를 광범위하게 사용할 수있는이 방법은 편리하다. 병렬 대립 유전자 특정 염기 서열 (PASS) 방법은 여러 사이트에서 시퀀싱 및 재조합 (14)의 검출을 가능하게 뿐만 아니라 특별히 개발 시약 및 탐지 시스템을 필요로한다. 본질적으로,이 방법은 관심 영역의 뉴클레오티드 차이의 소수의 바이러스 균주를 개발하기 위해 연구 하였다. 다른 방법은 작은 리포터 유전자를 시퀀싱하여 경쟁 바이러스 heteroduplex를 추적 분석 (HTA) 4,7,17,19 구별 또는 전사 정량 실시간 중합 효소 연쇄 반응을 반대로 태그 15 또는 돌연변이 4,16-18 동의어를 사용 에 관계없이 서열 유사성의 균주 경쟁 연구에 적용 할 수 모두 (RT-qPCR에) 15,16,18,20. 추가 단계는 바이러스의 게놈에 태그를 도입하는 데 필요한 및 RT-qPCR에 분석은 특정 시약 및 장비를 필요로한다. 발명자들은 대량 생거 시퀀싱 수익률 비교 결과 (9).

성장 경쟁에 이어, 바이러스 복제 피트니스는 상대의 적합성, 또는 T 사이의 피트니스 비율로 제공됩니다바이러스 변종 하시다. 바이러스의 상대적인 니스는 접종의 초기 비율에 의해 또는 두 바이러스 간의 경쟁 순 성장 속도 차이로 규격화 바이러스 변이체의 최종 비율로 정의 할 수있다. 우리는 후자의 방법은, 단지 지수 성장기 내에 길이 데이터 포인트를 이용하여, 가장 견고한 결과 9,20 생산하였습니다.

체외에서 피트니스 분석은 생물학적 클론 6-8과 HIV-1 감염 분자 클론을 연구하기 위해 주로 사용된다. 후자는, 유전자 조작 의무가되고, 종종 특정 돌연변이 또는 관심 3-5,21,22의 특정 시퀀스에서 체력에 미치는 영향을 연구하기 위해 사용된다. 다음 프로토콜은 바이러스 성 성장 속도론을, 일련의 태그를 포함하는 HIV-1 벡터를 사용하여 새로운 전체 길이 감염성 HIV-1 분자 클론을 구성하는 관심의 돌연변이를 도입, 바이러스 성 주식을 만들고 구축의 관점에서 워크 플로를 설명상대 체력을 성장 경쟁 분석을 수행하고 계산하는 (그림 1).

우리의 최적화 된 절차를 사용하여, 우리는 세 가지 재조합 HIV-1 돌연변이를 만들어 자신의 복제 체력을 결정했다. 재조합 분자 복제가 먼저 합성 COTB (센터 외과, pNL4-3, HIV-1 실험실 변형 NL4-3의 전체 길이 감염 유전자를 포함하는 플라스미드의 HIV-1 개그-P24 유전자 영역을 대체하여 건설되었다 나무, 서브 타입 B) 개그-P24 시퀀스 (23)는 프로토 타입의 변형을 만들 수 있습니다. 단일 아미노산 변경 (T186M은 T242N 및 I256V는) 다음 세 가지 돌연변이 클론을 생성하기 위해 도입되었다. 각각의 돌연변이는 주어진 유전 적 배경에서 각 돌연변이의 체력에 미치는 영향을 관찰하기 위해 프로토 타입 바이러스에 대해 경쟁했다. 세 가지 돌연변이 프로토 타입 바이러스보다 약간 크게 낮은에서 복제 fsitness 다양한 수준의 보여 주었다. T242N 돌연변이는 이전에 적당한 fitne이보고되었다SS는이 연구에 나타낸 결과와 유사한 24-26, 비용. 다른 두 변이의 피트니스 비용은 이전에보고되지 않았다.

프로토콜

참고 :이 프로토콜은, 후술하는 바와 같이, 어떤 환자 식별 정보를 포함하지 않으며, 따라서 워싱턴 대학의 임상 시험 심사위원회의 사람을 대상으로 연구 또는 인간의 주제 부문으로 간주되지 않습니다.

키메라 HIV-1 NL4-3 분자 클론의 1. 건설

1.1) 증폭 삽입 DNA 조각

  1. 키메라 프라이머를 디자인합니다. 5 '모두의 절반 순방향 및 역방향 프라이머는 단편이 삽입되기에 HIV-1 벡터 시퀀스가​​ 포함되어 있습니다. 프라이머의 3 '절반은 삽입 서열 (그림 2)의 끝을 포함해야합니다. 키메라 프라이머 시퀀스는 원래 오픈 리딩 프레임을 유지하고 있는지 확인합니다.
    1. 이상의 60 ° C 동일한 용융 온도, ~ 50 %의 GC 함량, 프라이머 다이머, 이종 및 / 또는 헤어핀 구조를 형성하는 경향이 낮은, 프라이머 길이에 적어도 20 염기를 사용한다. 이러한 속성을 평가OligoAnalyzer 웹 도구를 사용하여 ( https://www.idtdna.com/analyzer/Applications/OligoAnalyzer/ ).
  2. 를 사용하여 PCR (27)와 키메라 프라이머는 삽입 DNA (그림 2) 증폭. 각 PCR 반응의 경우, 1X 높은 충실도 버퍼, 0.2 mM의 dNTPs를, 높은 충실도의 DNA 중합 효소의 1 U, 앞으로 키메라 프라이머 0.5 μM, 역 키메라 프라이머의 0.5 μm의, 그리고 삽입 영역을 운반하는 DNA 샘플의 1 PG0의 NG를 사용합니다. 50 μL의 최종 볼륨에 O DH 2를 추가합니다.
  3. 다음과 같이 열 사이클 단계를 설정 : 10 초 동안 98 ° C에서 초기의 DNA 변성 단계를 수행합니다. 20 초 동안 두 프라이머의 가장 낮은 용융 온도보다 3 ℃에서 10 초 및 DNA 어닐링 98 ℃에서 DNA를 변성의 30 회와 증폭. 10 분 동안 72 ℃에서 최종 연장을 수행합니다. 4 ℃에서 보관 PCR 제품.
  4. PCR에서 제품의 5 μL를 타고이전 단계와 아가로 오스 겔 전기 영동 (28)를 실행합니다.
    1. DNA 사이즈 마커로서 0.7 % 아가 로스 겔, 1X TAE 완충액 (40 mM 트리스 - 아세테이트, 1mM의 EDTA), 0.5 μg의 / ㎖에 티듐 브로마이드 (EtBr이) 최종 농도 1킬로바이트 사다리를 사용한다. 전극 사이에 5 V / cm의 거리로 설정 전원 전압. 로딩 염료는 약 2/3 겔 길이 통해 이주 할 때 전기를 중지. 젤 문서 시스템 (28)을 사용하여 젤을 시각화.
      참고 : EtBr이는 발암 물질로 의심하고 적절하게 기관 규제 당, 처리해야합니다. EtBr이이 포함 된 젤을 다룰 때 장갑을 항상 착용해야합니다. 물질을 함유 마감 처리 EtBr이 후 새로운 장갑과 교차 오염을 방지하기 위해 다른 물질 또는 장비를 취급하기 전에 변경합니다.
  5. 원하는 PCR 생성물에 대응하는 크기를 가진 하나의 DNA 밴드가 검출되는 경우, 이러한 제품, QIAquick PCR 정제 키트 협정으로 상업용 키트를 사용하여 PCR 생성물을 정제 나머지제조업체의 프로토콜에 보내고.
    1. 다른 비 특정 대역은 또한 존재한다면, 예비 겔 전기 영동을 실행하는 PCR 생성물의 나머지 부분을 사용한다. 단계 1.1.4에 규정 된 동일한 매개 변수와 조건을 사용합니다. 젤 잘가 ~ PCR 제품의 45 μl를로드 할 수있을만큼 충분히 큰지 확인합니다. 관심의 밴드를 잘라 제조 업체의 프로토콜에 따라을 QIAquick 젤 추출 키트를 사용하여 겔에서 DNA를 추출한다.

1.2)) (전체 길이 감염성 HIV-1 서브 타입 B 벡터에 pNL4-3를 삽입 조각을 소개

  1. PCR 프라이머 등의 단계 1.1.5에서 정제 된 PCR 제품을 사용합니다. 한 PCR 반응의 주형 DNA로 pNL4-3VifA (20)를 사용하고 다른 반응 (그림 2)에서 템플릿으로 pNL4-3VifB (20)를 사용합니다. 각 PCR 반응의 경우, 1 배 높은 충실도 버퍼를 사용, 0.2 mM의 dNTPs를, 높은 충실도의 DNA 중합 효소의 2 U, 프라이머의 DNA 500 NG와 최종 권에 주형 DNA의 50 NG50 μL의 매화. 10 분 동안 72 ° C 다음에 10 초, 1 분, 10 분 동안 72 ° C ~ 48 ° C, 98 ° C에서 30 초 동안 98 ° C의 35주기를 :에 열 사이클링 매개 변수를 설정합니다.
  2. PCR 반응의 10 U DPN의 나는 50 μl를 추가하고 주형 DNA를 소화하기 위해 1 시간 동안 37 ° C에서 품어. 플라스미드 DNA를 메틸화 능력 균주, 예로부터 격리되어 있는지 확인합니다., TOP10 화학적으로 유능한 대장균.
  3. 사용 DPN 나는 유능한 박테리아 세포를 변형시키는 제품을 소화. TOP10 화학적으로 유능한 E.과 열 충격 변환을 사용하여 대장균, 제조사의 프로토콜에 따라. 재조합 플라스미드를 포함하는 박테리아 세포에 대한 선택하려면, 100 ㎎ / ℓ의 카르 베니 실린을 포함하는 루리아 국물 (LB) 배양 플레이트를 사용합니다.
    1. 10 ~ 잘 분리 식민지를 선택하고 100 ㎎ / ℓ의 카르 베니 실린을 포함하는 3 ㎖ LB 액체 배지에서 개별적으로 각각 성장하고 30 ° C에서 부화셰이커 O / N.
    2. 제조사의 프로토콜에 따라, 액체 박테리아 배양 물로부터 플라스미드 DNA를 분리 체로부터 QIAprep 스핀 미니 프렙 키트를 사용한다.
  4. 플라스미드 DNA가 적절한 삽입 포함되어 있는지 여부를 결정하기 위해 이중 제한 효소 (29)를 사용합니다. 제한 사이트 중 하나는 삽입 영역 내에 존재하며 다른 제한 사이트가 삽입 영역의 외부, HIV-1 벡터에 한 번만 있는지 확인하십시오.
    1. 10 ㎕의 최종 반응 부피에서 플라스미드 DNA의 다이제스트 적어도 300 NG. 선택한 제한 효소의 제조사의 프로토콜에 따라 선택 제한 완충액, 배양 온도, 배양 시간. 단계 1.1.4에 설명 된대로 소화 DNA와 실행 겔 전기 영동의 9 μl를 가져 가라. 예측 크기의 DNA 밴드가 재조합 플라스미드를 선택합니다.
  5. 생거 시퀀싱에 의해 재조합 플라스미드의 순서 무결성을 확인합니다. 희귀, 원치 않는 동안돌연변이 (들)은 PCR 반응 중에 도입 될 수있다.
    1. 서열의 플라스미드 DNA의 양 가닥. 시퀀싱 프라이머를 설계하는 단계 1.1.1.1의 지시 사항을 따르십시오. 또한, 그 전진을 보장하고, 각각의 재조합 플라스미드에 삽입 상류 영역의 하류 시퀀싱 프라이머 어닐링 적어도 50 염기쌍 역방향.
    2. 상업 DNA 시퀀싱 서비스 제공 업체에 플라스미드 DNA 시퀀싱 프라이머를 제출합니다. 서비스 제공자에 의해 규정 된 DNA 샘플과 프라이머를 준비한다.
  6. 제조사의 프로토콜에 따라 엔도톡신 프리 플라스미드 DNA 키트를 사용하여 돌연변이 된 플라스미드 DNA의 독소 스톡을 확인. 다음 단계에서 형질 전환을위한 독소가없는 플라스미드 DNA의 최소 1 μg의를 준비합니다.

1.3) 소개 소규모 돌연변이 통해 돌연변이 유발 부위 -

  1. 앞으로 중복과 돌연변이 유발 프라이머를 디자인하고 원하는 mutat를 포함하는 프라이머를 역이온 (들). 베이스 (들), 치환 삽입, 또는 10 ~ 15 상동 염기에 의해 측면 프라이머의 중간에 삭제 될 수를 놓습니다. 단계 1.1.1.1의 지시 사항을 따르십시오.
  2. 돌연변이 플라스미드를 합성 PCR을 사용합니다. 각 PCR 반응의 경우, 1 배 높은 충실도 버퍼를 사용, 10 mM의 dNTPs를, 높은 충실도의 DNA 중합 효소의 2 U, 앞으로 돌연변이 유발 프라이머의 0.5 μm의 역 돌연변이 유발 프라이머의 0.5 μm의 키메라 pNL4-3VifB 50 NG, 단계 1.2.6에서 50 μL의 최종 부피. 10 분 동안 72 ° C 다음에 10 초, 1 분, 10 분 동안 72 ° C ~ 48 ° C, 98 ° C에서 30 초 동안 98 ° C의 25주기를 :에 열 사이클링 매개 변수를 설정합니다.
  3. 단계를 반복 1.2.6에 1.2.2.

바이러스 성 증권의 2 세대 형질을 사용하여

  1. 필요한 바이러스 재고 원하는 플라스미드 DNA의 양을 계산합니다. 104 IU, / ㎖ 이상의 바이러스 역가와 바이러스 주식의 1.8 ml의 성장 경쟁 ASSA 두 세트의 충분하다YS, monoinfections을 포함, 각 중으로 다. 6 웰 플레이트에서 수행하는 형질의 경우, 약 1.8 ml의 상층 액을 잘 당 수확. 플라스미드 DNA μg의 하나는 6 웰 플레이트에서 수행 각 형질 필요하다.
  2. 6- 웰 플레이트의 각 웰의 경우, 형질 전환 혼합물, 예를 들면 100 ㎕를 준비한다. 플라스미드 DNA 및 혈청이없는 DMEM 1 μg의, 1 μL X-tremeGENE 9 형질 감염 시약 (또는 비교 가능한 제품)로 이루어진.
    1. 웰 당 1 μg의 플라스미드 DNA를 사용하여 필요한 플라스미드 DNA의 양을 결정한다. 플라스미드 DNA의 최종 농도가 적어도 50 NG / μL 있는지 확인하십시오.
    2. 무 혈청 배지 (DMEM)이 아니라 수식을 사용하여 당 필요한 양을 결정합니다 μL = 100 μL에 DMEM의 총 부피 - μL DNA의 볼륨.
  3. 6- 웰 플레이트에 106 HEK 293T-17 (ATCC) 세포 / 웰의 전파 매체 (DMEM + 10 % 소 태아 혈청 (FBS)) 2 ㎖를 추가한다. 37 ° C에서 1 시간 동안 인큐베이션5 % CO 2 분위기. 필요에 따라 (단계 2.1에서 결정) 많은 우물을 시드.
  4. , 형질 감염 혼합물을 제조 1.8 mL의 폴리 프로필렌 미세 원심 관에, 상기 계산 된, 무 혈청 DMEM 적절한 부피 나누어지는 다음 형질 감염 시약을 추가한다.
    1. 피펫 시약 직접 미디어 솔루션으로, microcentrifuge 관의 플라스틱 표면에 추가하지 않습니다. 마지막 플라스미드 DNA를 추가합니다. 피펫은 위아래로 부드럽게 솔루션을 혼합합니다. 형질 감염 복합체의 형성을 허용하도록 RT에서 15 분 (25 ° C 내지 15 ° C)에 대한 부화.
    2. 6 웰 플레이트에 접종 세포 드롭 현명한 방식으로 혼합물을 추가합니다. 조심스럽게 흔들거나 형질 단지의 고른 분포를 보장하기 위해 우물을 소용돌이 친다.
    3. 플라스틱 포장과 인감 플레이트.
  5. 48 시간 동안 5 % CO 2 분위기하에 37 ℃에서 배양 물을 인큐베이션.
  6. 신중하게 수집하고 15 ML 튜브 throu에 뜨는을 전송 피펫을 사용하여0.22 μm의 필터 상단 GH.
  7. 뚜껑에 고무 가스켓으로 1.8 ml의 미세 원심 분리 튜브에 필터링 된 상층 액의 250 μL 이상을 전송 피펫을 사용합니다.
  8. 스토어 사용할 때까지 -80 ° C에서 상층 액을 여과.

3. 말초 혈액 단핵 세포에 바이러스 성 주식의 감염 역가 (PBMC를)을 결정

  1. 피토 헤 마글 루티 닌 (PHA)와 PBMC를 자극. 하나의 바이러스 스톡, 시드 완전한 Iscove 개변 둘 베코 배지에서 2 × 106 PBMC를 당 (cIMDM을 인간 인터루킨 2 20 U / ㎖로 보충 된 IMDM (HIL-2), 10 % 소 태아 혈청과 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신)을 보충 PHA (1.5 μg의 / ㎖)와. 2 × 106 세포 / ml에서 종자 한 PBMC. 72 시간 동안 5 % CO 2 분위기하에 37 ℃에서 인큐베이션 한 PBMC를.
  2. 수확 PHA는 PBMC를 자극. 50 ML 원뿔 튜브에 비 부착 PHA-PBMC를 전송합니다. 10 분 동안 228 XG에 튜브를 스핀. 조심스럽게 disruptin없이 뜨는을 제거G 세포 펠렛. cIMDM 2 × 105 PBMC를 / ml의 최종 농도로 세포 펠렛을 다시 일시.
  3. 시드 2 × 10 4 PHA는 둥근 바닥 96 웰 플레이트에서 PBMC를 / 잘 100 μL / 잘 cIMDM을 자극.
  4. 바이러스 주식의 1:10 희석합니다. 그리고, 제 묽은 스톡으로부터, 96- 웰 플레이트에서 마스터 열두 3 배 희석액을 만든다. 이 희석 방식은 ml의 당 4월 10일부터 6월 10일까지 감염 단위 (IU)의 범위 내에서 바이러스 역가를 검출하는 것이 좋습니다.
    1. 예를 들어, 1.5 ml의 튜브에 180 μL 미디어에 바이러스 주식의 20 μl를 추가합니다. 조심스럽게 피펫 팅에 의해 희석을 섞는다. 그런 다음 첫 번째 잘 180 μL 미디어에 희석 주식의 90 μl를 전송하고 피펫으로 잘 섞는다.
    2. 다음 잘 180 μL 미디어에 현재의 우물에서 열한 번 이상 90 μl를 전송하여 희석 시리즈를 계속합니다. 증가 또는 초기 희석을 줄일 경우 106 IU / ㎖보다 높은 역가이하 10 4 IU / ml를 각각 예상된다.
  5. 사통에서 (단계 3.3에서) 시드 PBMC를 판에 마스터 희석 플레이트에서 희석 한 바이러스 주식의 40 μl를 추가합니다. 16-24 시간 동안 5 % CO 2 분위기하에 37 ℃에서 플레이트를 인큐베이션.
  6. 조심스럽게 각 우물에서 뜨는 100 μl를 제거하고 / 잘 200 μL의 총 부피에 신선한 cIMDM 160 μL로 교체합니다. 이산화탄소 분위기 5 % (1 일)와 37 ° C에서 접시를 품어.
  7. 일 4, 7, 10 및 13 전사 각 웰에 100 ㎕를 파쇄 완충액 (PBS 2 % 트리톤-100)에서 상등액 100 μL, 신선한 cIMDM 100 ㎕로 교체에. -20 ° C에서 상층 액을 저장합니다.
    1. 샘플링 및 역가가 안정 될 때까지 3 일마다 신선한 cIMDM를 추가하십시오.
  8. 하루 7 일 사용 P24 ELISA에 의한 바이러스 성 주식의 50 % 조직 배양 감염 용량 (TCID 50)을 결정샘플 3은 단계 4에 기재된.
    1. 날 (13)로부터 얻어지는 TCID 50 일부터 7 역가보다 명확하게 높은 경우, 바이러스 스톡은 확장 긴 시간이 필요할 수있다. 두 샘플링 시점에서 감염 역가가 안정 (또는 감소) 될 때까지 나중에 샘플을 사용하여 P24 ELISA를 반복합니다. 가장 높은 역가와 샘플에서 선택 주식.

4. ELISA 바이러스 성 감염 역가를 결정하는 HIV-1 P24의 검출 (Immunoabsorbant 분석 효소 연결)

참고 : 다음 프로토콜이 우리의 실험실 30에서 제조 된 P24 항원 캡처 판을 사용하여 개발되었습니다. 상용 HIV-1 ELISA 플레이트 P24 / 키트는 제조자의 프로토콜에 따라 이용 될 수있다.

  1. 샘플 작업에 앞서, 작업 주식 차 항체 (토끼 항 HIV-1 SF2의 P24 항혈청)를 준비합니다.
    1. 실온에서 해동 P24 항혈청.
    2. phosphat 10 % FBS 2 ㎖과 글리세롤의 2.5 ml의 혼합E 완충 식염수 (PBS).
    3. 항혈청의 0.5 ML을 추가하고 혼합한다.
    4. 스토어 -20 ℃에서 분취 액 1 ㎖.
  2. 37 ° C 배양기에서 단계 3.7에서 해동 샘플.
  3. P24 캡처 판을 (0.05 % 트윈 20 1X PBS) 세척 완충액으로 5 회 반복한다.
  4. 50 μL / 웰의 샘플 희석 (1 % 소 혈청 알부민 (BSA), 0.2 % 트윈 -20을 RPMI-1640에서 예), 적절한 웰에 시료 50 μL를 추가합니다. 만 모의 / 음성 대조군으로 샘플 희석제 적어도 세 우물을 포함합니다. 4 ° C에서 37 ° C 또는 O / N에서 2 시간 동안 품어.
  5. 사용하기 전에 신선한 차 항체 솔루션을 준비합니다. 차 항체 희석액 (RPMI-1640에 12 % FBS)을 사용하여 주식을 작업 차 항체의 2,000 배 희석 : 1을 확인합니다. 96 웰 플레이트의 각 웰에 샘플 / 제어 당 100 μL 용액의 사용을 위해 충분한을 제조 확인.
    1. 예를 들어, 일차 항체 가공용 5 μL를 추가 한 96 웰 플레이트에 충분한 용액을 만드는10 ㎖의 최종 부피에 대한 일차 항체 희석제 주식 겨.
  6. 세척 버퍼 캡처 판 5 회 반복한다.
  7. 각 웰에 차 항체 용액 100 μl를 추가합니다. 5 % CO 2 분위기하에 37 ℃에서 1 시간 동안 배양.
  8. 사용하기 전에 신선한 차 항체 솔루션을 준비합니다. 이차 항체 희석액 (7 % FBS, RPMI-1640 0.01 % 트윈 -20)을 사용하여 이차 항체 (1 ㎎ / ㎖ 염소 항 - 토끼 HRP)의 14,400 배 희석 한합니다. 피펫 팅의 오차를 줄이기 위해 두 단계의 일련의 희석을 수행한다. 96 웰 플레이트의 각 웰에 샘플 / 제어 당 100 μL 용액의 사용을 위해 충분한을 제조 확인.
    1. 예를 들어, 첫 번째 차 항체 희석액 99 μL에 차 항체의 1 μl를 추가 한 96 웰 플레이트에 대한 충분한 해결책을 확인합니다. 그 다음 10 ㎖의 최종 부피를 위해 이차 항체 희석액으로 희석 제의 70 μL를 추가한다.
  9. 워시 캡처 판 (5) 팀세척 버퍼와 ES.
  10. 각 웰에 차 항체 용액 100 μl를 추가합니다. 5 % CO 2 분위기하에 37 ℃에서 1 시간 동안 인큐베이션.
  11. 워시 플레이트 세척 버퍼 5 번.
  12. RT TMB 기판의 100 μl를 추가합니다. 빛으로부터 보호하기 위해 밀폐 용기에 실온에서 30 분을 품어.
  13. RT 정지 용액 (1 NH 2 SO 4)의 100 μl를 추가합니다.
  14. 각 웰 마이크로 플레이트 리더를 사용하여 450-650 nm에서 흡광도를 참조하십시오. 각 아니라 감염 또는 감염되지 않은 점을 흡광도 값을 사용합니다. 흡광도 값이 음수 / 모의 대조군 웰로부터 판독 값보다 적어도 세 배 더 높은 경우 감염성 바이러스를 함유하는 웰을 고려한다. 리드 Meunch 방법 (31)를 사용하여 바이러스 주식의 TCID 50을 계산합니다.

5. 바이러스 성 성장 속도론을 설정

5.1) Monoinfection

  1. 시드 3 × 10 5 PHA 자극 PBMC / 웰 48 웰 플레이트에/ 잘 500 μL의 총 부피의. 접종까지 5 % CO 2 분위기에서 37 ℃에서 배양 플레이트를 유지합니다.
  2. 각 바이러스의 경우, cIMDM 2 ㎖로 6,000 IU 함유 균액을 준비한다.
  3. 시드 세포에 접종 (1,500 IU)의 500 μl를 추가하여 세중 우물을 접종한다. 감염된 세포 배양 웰의 최종 부피는 1 ㎖ /이며 MOI는 0.005이다.
  4. 나누어 백업으로 저장된 하나의 RNA의 분리를위한 두 개의 96 웰 플레이트의 각 남은 균액 200 μL.
  5. 16-24 시간 동안 5 % CO 2 분위기하에 37 ℃에서 배양 물을 인큐베이션.
  6. 워시 문화 접종 후 16 ~ 24 시간.
    1. 제거하고 배양 상층 액 750 μl를 폐기합니다.
    2. 신선한 cIMDM 750 μl를 추가합니다. 300 x g에서 10 분 동안 플라스틱 포장 스핀에서 접시를 감싸. 제거하고 750 μl의 상층 액을 버린다.
    3. 신선한 cIMDM 750 μl를 추가합니다. 5 % CO 2에서 37 ℃에서 인큐베이션mosphere (1 일).
  7. 매일 2 일부터 7 일까지 샘플 문화.
    1. 1.8 ㎖의 원심 분리 관에 배양 상층 액 500 μl를 전송합니다. 3,000 x g에서 1 분간 회전.
    2. 전송 RNA 분리를위한 두 개의 96 웰 샘플 플레이트에 무 세포 상층 액 200 μL, 다시 백업으로 한 판을 저장. RNA 분리 될 때까지 -80 ℃에서 저장 상층 액.
    3. 각각의 문화에 500 μL 신선한 cIMDM를 추가합니다. 5 % CO 2 분위기하에 37 ℃에서 인큐베이션.
    4. 실험의 끝에서 Wescodyne에 문화를 폐기하십시오.
    5. 제조업체의 표준 프로토콜 다음 상층 액 200 μL (예 : QIAamp 바이러스 성 RNA 미니 키트로 사용 상용 키트)에서 RNA를 분리합니다. 샘플의 수가 많은 퀴아 QIAxtractor를 사용한다.
    6. cDNA 합성 될 때까지 -80 ℃에서 저장 RNA 샘플.

5.2)의 cDNA 합성 (역전사)

  1. 각각의 RNA s의충분한, 바이러스 RNA의 10 μL로 (7995에 5'-GTTGATCCTTTAGGTATCTTTCCACAGC-3 ', HXB2 뉴클레오티드 7968)의 dNTP의 1.2 nmol의 및 cDNA 합성 프라이머의 1.2 pmol의를 추가 할 수 있습니다. 14 μL의 최종 볼륨에 물을 추가합니다. 혼합 관의 바닥에서 액체를 수집하기 위해 간단히 스핀 튜브 톡.
  2. 마스터 믹스가 준비 될 때까지 4 ° C에서 개최, 65 ℃에서 5 분 동안 혼합물을 품어.
  3. 5 배 첫 번째 가닥 버퍼 (250 mM 트리스 - 염산, pH가 8.3, 375 mM의 KCl을 15 mM의의 MgCl 2), 5 mM의 DTT, 120 SuperScriptIII의 U 240 U의 RNase의 억제제를 사용하여 마스터 믹스를 준비합니다. 10 μL의 최종 볼륨에 물을 추가합니다.
  4. 혼합 수집하는 스핀 RNA 혼합물, 영화로 마스터 믹스 10 μl를 추가합니다.
  5. cDNA를 합성 할 수 있도록 50 ° C에서 90 분 동안 혼합물을 인큐베이션. 역전사 효소를 불 활성화하기 위해 70 ° C에서 15 분 동안 인큐베이션. 필요에 따라 4 ° C에서 잡으십시오.
  6. 혼합 된 RNase H, 영화의 2 U를 추가하고 수집하는 스핀.
  7. 20 분을 품어37 ° C에서. -20 ° C에서 저장하는 cDNA.

5.3) cDNA를 정량 qPCR에 시스템을 사용하여

  1. 표준 희석 시리즈를 준비합니다. / 3 × 10 6 사본에서, 시리얼 희석을 10 배 pNL4-3VifA 30 복사 / μL, 아래로 μL 마십시오. 희석 증류수를 사용합니다. 사용하기 전에 신선한 표준 희석 시리즈를 준비 또는 작은 배치를 준비하고 -20 ℃에서 보관하십시오. 안 기준을 3 배 이상을 동결 - 해동.
  2. 96 웰 qPCR의 반응 플레이트를 설정합니다. 각각의 판은 적어도 각각의 cDNA 샘플의 중복을 음성 대조군 중 적어도 하나 아니라, 표준 희석 시리즈의 세중를 포함하고 있는지 확인하십시오.
  3. 각 qPCR의 반응, qPCR의 마스터 믹스 12.5 μL, 0.2 μM 프로브, 정방향 및 역방향 프라이머의 0.8 μM, 각 cDNA를 1 μL 또는 (아니라 음성 대조군의 경우) 표준 희석 시리즈 또는 물 / 버퍼를 사용한다. 25 μL의 최종 볼륨에 물을 추가합니다. qPCR에 프로브는 빛 센입니다sitive. 밀폐 용기에 보관하십시오.
    1. VifAB 정방향 프라이머 (GGTCTGCATACAGGAGAAAGAGACT), VIFA 역방향 프라이머 (5'-AGGGTCTACTTGTGTGCTATATCTCTTTT-3 ')과 VifAB 프로브 (6FAM-5'-CTCCATTCTATGGAGACTC-3 : pNL4-3VifA 기반 분자 클론에서 파생 된 cDNA를 검색하려면, VIFA 프라이머 - 프로브를 사용 '-MGBNFQ). VifAB 정방향 프라이머, VifAB 프로브와 VIFB 역방향 프라이머 (5'-CACCTGCGTGCTATACCTTTTCT-3 ') : pNL4-3VifB 기반 클론에서 파생 된 cDNA를 들어, VIFB 프라이머 - 프로브를 사용합니다.
  4. 2 분, 10 분, 95 ℃, 15 초와 1 분 60 ° C ~ 95 ° C의 40주기를 50 ℃로 PCR 사이클 매개 변수를 설정합니다. qPCR에 기계의 작동을위한 제조 업체의 지원 문서를 참조하십시오.
  5. 중으로 표준 희석 시리즈의 데이터를 사용하여 표준 곡선을 계산한다. 카피 수를 결정하는 표준 곡선의 cDNA의 증폭 샘플 데이터를 비교한다. 다 제조업체의 지원 문서를 참조하십시오타 처리.

5.4) 바이러스 성 기하 급수적 인 성장 단계를 결정

  1. 상기 X 축 및 Y 축을 따라 된 cDNA 카피 수에 따라 샘플링 하루 바이러스의 성장 동역학을 플롯 및 바이러스 성 지수 성장기를 식별하는 예., 바이러스 cDNA를 지수 진행의 숫자를 증가를 복사 할 때.
  2. GRC 웹 도구 (사용 http://indra.mullins.microbiol.washington.edu/grc/를 바이러스 성장률 (g)을 계산하기 위해). 이 애플리케이션에서, GRC 도구 cDNA를 입력으로서 적어도 두 시점에서 번호를 복사 수용하며 바이러스 성장률 (g)를 출력한다. 정확한 성장 속도를 얻기 위해 (상기 단계 5.4.1 참조) 지수 적 성장 단계에서만 내에 시각 데이터를 사용한다. GRC 웹 도구에 사용되는 수학적 모델에 대한 자세한 설명은 20를 참조하십시오.

6. 성장 경쟁 분석

  1. 시드 3 × 105 </ SUP> PHA 자극 PBMC를 (또는 1 × 10 5 CEMx174 세포) 48도 평면 바닥 플레이트에 웰 당 500 μL 총 부피에.
  2. 접종까지 5 % CO 2 분위기에서 37 ℃에서 판을 보관하십시오.
  3. 각각의 바이러스를 들어, 6,000 IU를 포함 접종 3 ㎖를 준비합니다.
  4. 이중 감염 접종을 만들 멸균 튜브에 각각의 바이러스 접종의 1.5 ml에 전송합니다. 48 웰 플레이트에 3 × 10 5 세포에 듀얼 접종 (1,500 IU)의 500 μl를 추가합니다. 최종 배양 부피는 웰 / ml의 1이다. 나누어 RNA 분리를위한 96 개의 웰 플레이트에 접종 200 μL; 다시 최대로 한 판을 저장합니다.
  5. 16-24 시간 동안 5 % CO 2 분위기로 37 ℃에서 접종 된 세포를 부화.
  6. 워시 문화 접종 후 16 ~ 24 시간.
    1. 제거하고 배양 상층 액 750 μl를 폐기합니다.
    2. 신선한 cIMDM 750 μl를 추가합니다. 300 x g에서 10 분 동안 플라스틱 포장 스핀에서 접시를 감싸. 제거하고 750을 폐기(81), L 상청.
    3. 신선한 cIMDM 750 μl를 추가합니다. 5 % CO 2 분위기 (1 일)와 37 ° C에서 품어.
  7. 선택 샘플링 시간은 단계 5.4.1에서 관찰 지수 적 성장 단계 내에서 적어도 3 시간 지점을 포함한다.
    1. 각 샘플링 단계 5.1.7을 따르십시오.
  8. 5.2 절에 설명 된대로의 cDNA 합성을 수행합니다.
  9. qPCR에를 사용하여 바이러스 변종 비율을 결정합니다.
    1. 3 × 10 (6) 사본 각 단계에서 10 배 희석, 세중의 표준 용액을 희석 시리즈를 준비 / 30 복사 / pNL4-3VifA의 μL에 μL.
    2. 96 웰 qPCR의 반응 플레이트를 설정합니다. 각각의 판은 적어도 하나의 음성 대조군, 세중의 표준 희석 시리즈, 각 cDNA를 샘플의 중복이 포함되어 있는지 확인합니다.
    3. 각 qPCR의 반응, qPCR에 마스터 믹스의 12.5 μL, 0.2 μm의 프로브, 0.8 앞으로의 μm의 각각의 프라이머를 역 및 cDNA를 1 μL 또는 표준 D를 사용 ilution 시리즈 또는 (음성 대조군 우물) 물 / 버퍼. 25 μL의 최종 볼륨에 물을 추가합니다. qPCR에 프로브는 밀폐 용기에 보관, 민감한 빛입니다.
      1. 음성 대조군 및 표준 희석 시리즈와의 cDNA 샘플 중 하나에 신호 중복을 검출 VIFA 프라이머 - 프로브를 사용한다. cDNA를 샘플의 다른 중복과 VIFB 프라이머 - 프로브를 사용합니다.
    4. 15 초와 1 분 60 ° C에 대해 다음 95 ° C의 40주기를 10 분 동안 다음, 2 분 동안 50 ° C에 95 ° C를 PCR 사이클 매개 변수를 설정합니다. qPCR에 기계의 작동을위한 제조 업체의 지원 문서를 참조하십시오.
    5. 표준 희석 시리즈로부터 증폭 된 데이터를 사용하여 표준 곡선을 계산한다. 카피 수를 결정하는 표준 곡선으로 cDNA를 증폭 샘플 데이터를 비교한다. 데이터 처리를위한 제조 업체의 지원 문서를 참조하십시오.
    6. (GRC 웹 도구를 사용하여ol.washington.edu/grc/">http://indra.mullins.microbiol.washington.edu/grc/) 상대 바이러스 피트니스 (d)를 계산합니다.
      주 : GRC 도구 cDNA를 입력으로서 적어도 두 시점에서 숫자 또는 크로마토 그램의 피크 높이를 복사 받아, 두 바이러스 간의 순 성장 속도 차이 (d)를 출력한다. 도구는 두 시점에서 데이터 순 증가율을 산출 할 수 있지만, 강하게 세 개 이상의 시점에서의 입력 데이터에 권장된다. 지수 증식기 내의 시점으로부터 얻어진 데이터만을 사용하여 정확한 성장 속도를 얻기 위해 (단계 5.4 참조). GRC 웹 도구에 사용되는 수학적 모델에 대한 자세한 설명은 20를 참조하십시오.
  10. 크로마토 그램의 피크 높이를 사용하여 바이러스 성 비율을 결정
    1. PCR HIV-1을 VifFwd를 사용 VifAB 서열 태그를 포함하는 단편을 증폭 VIF (5'-GAAAGAGACTGGCATTTGGGTCAGGG-3 '; HXB2는 5266-5291를 위치)와 VifRev 프라이머 (5'-GTCTTCT GGGGCTTGTTCCATCTGTCC-3 '; HXB2 위치 5579-5553).
      1. 각 PCR 반응의 경우, cDNA를 1 μL, 1X NH 4 버퍼, 각각의 프라이머가 1.5mm의 MgCl 2, 0.2 mM의의 dNTP, U의 Taq 중합 효소의 2.5, 0.45 μm의를 사용합니다. 50 μL의 최종 볼륨에 물을 추가합니다.
      2. 30 초, 15 초, 94 ℃에서 34주기 다음에 1 분, 1 분 동안 55 ℃, 1 분 동안 70 ° C, 94 ° C에서 3 회에 58 ° C를 PCR 사이클 매개 변수를 설정하고, 다음 70 ° 1 분 C 및 4 ℃에서 개최.
    2. 제조사의 프로토콜에 따라 제품, QIAquick PCR 정제 키트를 사용하여 PCR 산물을 정제.
    3. 생거 시퀀싱을위한 DNA 시퀀싱 서비스 제공 업체에 정제 된 PCR 산물을 제출합니다.
    4. 시퀀싱 서비스가 제공되어야한다 평균 읽기 품질 평가 점수를 확인합니다. 평균 기본 통화 정밀도 미만의 85 % 인 경우에 단계 6.10.3 6.10.1 재실행
    5. (ChromatQuan 웹 도구를 사용하여f="http://indra.mullins.microbiol.washington.edu/cgi-bin/chromatquant.cgi">http://indra.mullins.microbiol.washington.edu/cgi-bin/chromatquant.cgi ) 각 시점에서 바이러스 비율을 산출한다. 공구 시퀀스 추적 파일 (* .ab1) 관심 뉴클레오티드 서열 사이트 5 '를 요구한다. 도구는 특정 부위에서의 피크 강도를 측정한다. 피크 강도 비는 두 바이러스 (도 4b)의 비율에 상당한다.
    6. GRC 웹 도구 (사용 http://indra.mullins.microbiol.washington.edu/grc/ 바이러스 상대 피트니스 (d)를 계산하기 위해 입력으로)와 기록 된 피크 강도를. 단계 6.10.6을 참조하십시오. (20)

결과

HIV-1 개그-P24 단일 아미노산 변화의 체력에 미치는 영향을 연구하기 위해, 우리는 HIV-1 COTB-P24 유전자 23,32,33를 포함하는 pNL4-3 플라스미드에 돌연변이를 소개하는 올리고 뉴클레오티드 특이 적 변이를 사용했다. 바이러스 주식 293T 세포의 형질 감염에 의해 생성 된, 48 시간 후에 수거 하였다. 우리는 리드 - MUENCH 방법 (31)에 의해 각각의 바이러스 주식의 50 % 조직 배양 감염 용량 (TCID 50)을 추정했다. 프로토 타입의 TCID (50)와 돌연변이 바이러스는 104에서 105 IU / ㎖ (그림 3A)였다.

재조합 바이러스의 성장 반응 속도는 0.005의 MOI에서 단일 기증자 PBMC를 설립했다. RT-qPCR의 여섯 일 동안 매일 바이러스 cDNA의 사본 수를 측정 하였다. 모든 돌연변이 및 프로토 타입 바이러스는 <바이러스 RNA의 카피 수 증가의 감소 기울기 (로 표시된 바와 같이 바이러스 성 성장이 둔화 하루 2, 4 일, 다음 사이에 기하 급수적으로 증가강한> 그림 3b). cDNA의 감소는 (접종에 해당) 0 일 및 2 일 사이의 수는 세포에 바이러스의 흡수 하루 1 세척 (단계 5.1.6)에 의해 언 바운드 비리의 제거로 인한 복사합니다. 지수 적 성장 단계에서, 모든 세 돌연변이 바이러스 원형 (도 3c)보다 느린 성장 속도 (g)를 가졌다.

세 가지 돌연변이 0.005 총 MOI에서 성장 경쟁 분석에서 프로토 타입 바이러스에 대해 경쟁했다. 이중 감염된 문화 바이러스 성 성장 속도론은 monoinfection의 그것과 유사 하였다; 바이러스 성 지수 성장기는 2 일 및 4 사이이고, 바이러스 성장은 5 일 (도 4a)의 주위에 도달 고원.

바이러스 성장 속도의 차이는 시간에 따른 바이러스의 비율의 변화로부터 유래 하였다. 비 바이러스의 cDNA 복사본 참조 번호 및 RT-qPCR에를 사용하여 돌연변이 바이러스와 비교하여 피크의 높이에 의해 산출했다시퀀스에서 두 바이러스 (도 4B)를 구분하는 뉴클레오티드 부위에서 크로마토 그램. 피크 높이와 바이러스 RNA 카피 수의 방법을 이용하여 결정 성장 속도의 차이는 유사한 결과 (도 4C)을 수득 하였다. 세 가지 돌연변이가 가장 낮은 피트니스 (그림 4C)을 갖는 돌연변이 I256V와 프로토 타입 바이러스보다 낮은 복제 체력을 가지고 있었다.

figure-results-1
그림 1 : 본 논문에서 제시 한 프로토콜의 흐름도 바이러스 주식의 바이러스 준비 프로토콜 우려 HIV-1 재조합 클론의 건설 및 생성.. 피트니스 분석 실험 프로토콜은 바이러스 성 성장 속도론을 수립하고 관련 바이러스의 적합성을 결정하기위한 것입니다. 점선은 프로토콜에 대한 다른 흐름을 나타냅니다. 예를 들어, 돌연변이 HIV-1 NL4-3로 직접 도입 될 수있다재조합 복제를 생성하지 않고 분자 클론.

figure-results-2
그림 2 :. 오버랩 확장 PCR (A)를 사용하여 HIV-1 NL4-3 COTB 개그-P24 재조합 분자 클론의 건설 키메라 프라이머를 디자인합니다. 5 '프라이머의 절반은 NL4-3 벡터 시퀀스를 포함하고 3'반쪽 삽입 시퀀스의 끝을 포함한다. (B) 키메라 프라이머는 삽입 조각, COTB 개그-P24를 증폭하는 데 사용됩니다. (C) 삽입 단편은 재조합 플라스미드를 생성하기 위해 두 번째 PCR 용 프라이머로 사용된다.

figure-results-3
그림 3 :. PBMC를에서 바이러스 성 성장 특성 (A) 로그 (10) TCID (50) 바이러스 주식. (B) MOI = 0.005에서 시작 monoinfections에서 바이러스 성 성장 속도론. 패널 (B) 유래의 지수 성장기 (2-4 일) 등 6 일 (C) 바이러스 성장율. 도시 된 값들은 하나로부터 3 회 반복 실험의 평균을 나타낸다. 오차 막대는 95 % 신뢰 구간을 나타낸다.

figure-results-4
그림 4 : 바이러스 성 성장과 상대의 적합성 결정 (A) 이중으로 감염 PBMC 문화에서 바이러스 성 성장.. T242N 및 프로토 타입 바이러스 (B) 비는 RT-qPCR에 또는 시퀀싱 피크 높이 법을 사용하여 측정. (A)에 도시 된 바와 같이, (C) 및 이중 돌연변이 감염된 배양에서 프로토 타입 바이러스 간의 순수한 바이러스 성장율 차이 (d). D 값은 f를 계산했다(B)에 도시 된 비 바이러스 성 데이터를 ROM. 도시 된 값들은 하나로부터 3 회 반복 실험의 평균을 나타낸다. 오차 막대는 95 % 신뢰 구간을 나타낸다.

토론

재조합 HIV-1 분자 클론 및 성장 경쟁 분석의 건설 : 제시된 프로토콜은 두 가지 주요 부분으로 구성되어있다. 이중 감염된 세포 배양 물에서 두 바이러스와 구별하기 위해, 경쟁 분자 클론을 RT-qPCR에 프라이머 - 프로브 분석으로 또는 생거 시퀀싱에 의해 검출 될 수있는 서열 태그를 포함하는 것이 중요하다. 이 프로토콜은 HIV-1의 NL4-3 VIF 동일한 영역을 점유하고 동일한 아미노산 서열을 인코딩하지만 여섯 동의어 돌연변이 차이 VIFA 및 VIFB 태그를 사용한다. 이러한 돌연변이는 영향을주지 나타냈다 바이러스 복제의 적합성 (20). 이 프로토콜에서 사용하는 PCR 계 클로닝 방법은 제한 부위 기반 복제에 비해 클로닝 사이트를 선택하는데 더 많은 유연성을 제공한다. 그러나, PCR 클로닝의 효율은 인서트의 크기가 증가함에 따라 감소한다. 인서트 크기의 전류 제한은 ~ 5킬로바이트 (34)이다. PCR 기반의 복제 및 사이트 감독 mutagenesi 들어S, 고 충실도 DNA 중합 효소의 사용은 추가적인 돌연변이 가능성을 줄이기 위해 매우 중요하다. 제품의 충분한 양을 산출하기 위해 필요한 PCR 사이클의 최소 수의 사용은 권장된다. 우리의 경험에서, 우리는 여기에 설명 된 PCR 기반의 복제 및 부위 특이 적 변이 단계 후 여분의 돌연변이를 검출하지 않았다. 그럼에도 불구하고 PCR 제품은 원치 않는 돌연변이를 확인하기 위해 서열화한다. 이상적으로, 전체 HIV 코딩 영역을 resequenced해야합니다.

적어도 세 개의 샘플링 시점은 지수 적 성장 단계 9에서 검토되어야한다. 바이러스의 성장 동역학을 먼저 성장 경쟁을위한 적절한 배양 시간 및 샘플링 시간의 포인트를 결정하기 위해 매일 샘플링을 사용하여 설정되어야한다. 바이러스 성 성장 반응 속도에 영향을 미치는 하나의 요인은 감염 (MOI)의 다양성이다. 그것은 더 RO을 수득 하였다 나타낸 바와 같이이 프로토콜은, monoinfection 성장 경쟁 모두 0.005 총 MOI를 사용낮은 MOIs 9보다 흉상 결과. 그럼에도 불구하고, 낮은 MOIs 필요하다면 장기간의 지수 성장기를 얻기 위해 사용되지만, 결과의 일관성을 희생 할 수있다. 이 프로토콜은 바이러스의 체력 차이가 미리 일반적으로 알려지지 않은 것으로 가정하여, 50:50의 초기 감염 비율을 의미한다. 바이러스 복제 속도론에 상당한 차이점을 시사 예비 데이터가있는 경우에는, 동일하지 않은 입력 비율의 사용이 적합하다. 이러한 경우에는, 70:30의 비율은 감염 바이러스가 덜 맞는 초과 9에 배치 큰 차이 니스의 검출을 허용하도록 권장한다.

바이러스 성장 속도론 및 HIV-1 서브 타입 B를 사용하여 경쟁 분석 최적화 된 성장을 수행하기위한 TCID 50을 결정하기위한 프로토콜은, PBMC를 하나의 기증자로부터 NL4-3 COTB-P24 및 PBMC를이 HIV-하는 일관된 감수성을 증명하고있다 체외에서 1 감염. 배양 기간이 프로토콜에서 제공 샘플링 시점에 인간 PBMC를 HIV-1 바이러스 M 군을 연구에 적합한 것으로 보인다. 단일 소스에서 PBMC를 사용하는 것은 매우 바이러스 복제가 다른 공여 세포 (35)에 따라 다릅니다 수있는 일관성있는 결과를 얻을 것을 권장합니다. 교체는 동일한 풀 모든 실험에 걸쳐 사용되는 것을 규정 덜 바람직하지만, 복수의 공여체로부터 풀링 된 PBMC를 사용할 수있다. 또 다른 대안은 세포주의 사용이다. 여기에 제시된 프로토콜 T 세포주 CEMx174 23,36 성공적으로 사용되었다. 그러나, 세포의 파종 번호 재 최적화 일관된 세포 성장을 달성하는 것이 중요하다. 그것이 성장 경쟁 단계에 적절한 샘플링 시점을 결정하기 위해, 상이한 세포주에서 다를 가능성이 바이러스 성 성장 동역학은 또한 재 확립되어야한다.

체력을 계산하는 바이러스 성 비율을 결정하는 두 가지 방법이 protoc에 포함되어 있습니다OL. 첫째는 각 샘플링 시점에서 바이러스의 cDNA 카피 수를 측정하기 위해 RT-qPCR에 사용. 바이러스 복제 적당이어서 cDNA의 사본 번호에 기초하여, 바이러스의 비로부터 계산 하였다. 대안으로, 바이러스 성 비 VifAB 태그 사이트의 크로마토 그램의 피크 높이의 비율에 기초하여 결정될 수있다. 두 가지 방법이 유사한 결과 (도 4)을 수득 하였다. 크로마토 그램의 피크 높이 방법은 서열 태그 조작없이 다른 HIV-1 균주에 적용될 수있다. RT-qPCR의 바이러스 변이체를 구별하기위한 프라이머 또는 프로브의 사용은 제 신중하게 평가되어야 들어 (20 참조). 그럼에도 불구하고, RT-qPCR에 같은 지수 성장기 내의 제 시점에서 그와 같은 바이러스 성 RNA의 소량의 샘플과 더 나은 민감도를 제공한다. 바이러스 cDNA를 직접 측정은 또한 RNA 추출 및 cDNA 합성에서 발생할 수있는 기술적 인 문제를 감지 할 수 있습니다. 서열 태그 분자 클론을 사용하는 것은 비용 효율적인 솔루션을 제공 tRT-qPCR에 방법 O를, 같은 프라이머 및 프로브의 두 쌍은 여러 바이러스를 연구하기 위해 필요하다. 이 전략은 또한 시퀀싱이 연구에서 모든 바이러스에서 동일한 사이트에서 수행되는 것처럼 순서로 피크 높이 변화의 문제, 이웃 기지 (37)에 의한 크로마토 그램 방지 할 수 있습니다. RT-qPCR에와 생거 시퀀싱 생성 된 PCR 제품은 다른 방법과 함께 사용은 개별 클론 12, 13의 대량 순서, HTA 4,7,17,19, 또는 올리고 뉴클레오티드 결찰 분석 (OLA) (38) 바이러스 성 비율을 결정하기 위해 할 수 있습니다 .

공개 사항

저자는 그들이 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다. 표현 의견은 여기에 저자의 견해이며 공식 또는 미 국방부 또는 육군의 부서의 의견을 나타내는 것은 아니다.

감사의 글

이 연구는 미국 공중 보건 서비스 보조금 P01AI057005, R01AI047734, R01AI111806 및 워싱턴 대학교 에이즈 연구 센터의 기능 프로파일링 및 컴퓨터 생물학 핵심(P30 AI027757)의 지원을 받았습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
재조합 클론
키메라 프라이머/돌연변이화효소/염기서열분석 프라이머IDT맞춤형 DNA 올리고
pNL4-3VifA 및 pNL4-3VifB 플라스미드James I Mullins 박사에게 문의하십시오. (jmullins@uw.edu)
High-Fidelity DNA polymeraseThermo ScientificF-549S
High-fidelity bufferThermo ScientificF-549S
dNTPBiolineBio-39026
열 순환기Life TechnologiesApplied Biosystems® 제네Amp® PCR System 9700
DNA 로딩 염료Thermo ScientificR0631
1 kb Plus DNA ladderInvitrogen10787-018
QIAquick PCR 정제 키트Qiagen28104
QIAquick 젤 추출 키트Qiagen28704
DpnI 효소New England BiolabsR0176S
TOP10 화학적으로 유능한 Escherichia coliInvitrogenC4040-10
Luria Broth base powderInvitrogen12795-084
CarbenicillinResearch Products InternationalC46000-25.0
QIAprep Spin Miniprep kit Qiagen27104
EndoFree Plasmid Maxi KitQiagen12362
Transfection
X-tremeGENE 9 DNA transfection 시약Roche6365787001
HEK 293T-17ATCCCRL-11268
http://www.atcc.org/ 0.22 μ m 필터 상단 튜브VWR International89220-716 
세포 배양
Dulbecco의 변형 독수리 배지(DMEM)Life Technologies10566016
Iscove′ s 수정된 Dulbecco′ s 매체 (IMDM)Life Technologies31980-030
RPMI-1640 매체Life Technologies61870-036
Phytohemagglutinin (PHA)Thermo ScientificR30852801
Human Interleukin-2Roche11147528001
Fetal bovine serumJR Scientific43640
페니실린 및 스트렙토마이신Corning Cellgro30-001-CI
6웰 플레이트VWR Scientific73520-906
48웰 플레이트VWR Scientific62407-338
96 웰 플랫 바닥 플레이트ISC BioexpressT-3015-4
96 웰 라운드 바닥 플레이트BD Falcon353077
1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브Mt. Baker BioMBD-1500
1.5ml 튜브(O-링 포함VWR Scientific89004-290
50ml 원뿔형 튜브ISC BioexpressC-3317-6
ELISA
Triton-X 100Sigma-AldrichX100
인산염 완충액 식염수(PBS)Invitrogen14190-250
혈청(FBS)시그마-알드리치F0392
글리세롤시그마-알드리치G5516
트윈 20시그마-알드리치P1379
소 혈청 알부민(BSA)시그마-알드리치A2153
토끼 항-HIV-1 SF2 p24 항혈청NIH AIDS 시약 프로그램4250
염소 항토끼 HRPKPL474-1516
TMB Microwell Peroxidase SubstrateKPL52-00-01
H2SO4Fisher ScientificA300-500모든 노출 경로에서 심각한 화상을 입힙니다. 개인 보호 장비를 사용하십시오. 화학 흄 후드 아래에서만 사용하십시오. 즉시 다량의 물로 최소 15분 동안 씻어내십시오.
HIV p24 표준AIDS 및 암 바이러스 프로그램(NCI-Frederick)주문 세부 정보는 Julian Bess, Jr. (bessjw@mail.nih.gov)에 문의하십시오. http://ncifrederick.cancer.gov/Programs/Science/Acvp/bio/Bess.aspx
Microplate readerMolecular DevicesVMax Kinetic ELISA Microplate Reader
RNA isolation cDNA synthesis
QIAxtractorQiagen
http://www.qiagen.com/products/catalog/automated-solutions/sample-prep/qiaxtractor QIAamp 바이러스 RNA 미니 키트Qiagen52906
dNTPBiolineBio-39026
SuperscriptIIIInvitrogen18080-085
첫 번째 가닥 완충액 Invitrogen18080-085
Dithiothreitol (DTT)Invitrogen18080-085
Rnase 억제제Roche3335402001
RnaseHInvitrogen18021-071
qPCR
Real-time qPCR 기계Life TechnologiesApplied Biosystems 7300 Real-Time PCR 
TaqMan® 유전자 발현 마스터 믹스Life Technologies4369016
포워드, 리버스 프라이머IDT맞춤형 주문
프로브Life Technologies맞춤형 주문
광학 96웰 반응 플레이트Life TechnologiesI19N3Q216
PCR+염기서열분석
Taq DNA 중합효소(Biolase)BiolineBio-21043
NH4 완충액 BiolineBio-21043
MgCl2BiolineBio-21043
염기서열분석 프라이머IDT맞춤 주문
QIAxcelQiagenhttp://www.qiagen.com/products/catalog/automated-solutions/detection-and-analysis/qiaxcel-advanced-system
DNA 염기서열분석 서비스 제공업체http://www.htseq.org/
GRC 웹 도구http://indra.mullins.microbiol.washington.edu/grc/
ChromatQuan 웹 도구http://indra.mullins.microbiol.washington.edu/cgi-bin/chromatquant.cgi
구성 ) 소 태아

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