Here the method to establish a syngeneic mouse model of orthotopic bladder tumour to evaluate the anti-tumour efficacy of the bacterial protein HP-NAP is described.
Bladder cancer is one of the most common malignancies of the urogenital tract. Intravesical injection of Bacillus Calmette-Guérin (BCG) is the gold standard treatment for the high-grade non-muscle invasive bladder cancer (NMIBC). However, since the treatment-related side effects are relevant, newer biological response modifiers with a better benefit/side effects ratio are needed.
The tumour microenvironment can influence both tumour development and therapy efficacy. In order to obtain a good model, it is desirable to implant tumour cells in the organ from which the cancer originates.
In this protocol, we describe a method for establishing a tumour in the bladder cavity of female mice and subsequent delivery of therapeutic agents; the latter are exemplified by our use of Helicobacter pylori neutrophil activating protein (HP-NAP). A preliminary chemical burn of the mucosa, followed by the injection of mouse urothelial carcinoma cell line MB49 via urethral catheterization, enables the cells to attach to the bladder mucosa. After a period, required to allow an initial proliferation of the cells, mice are treated with HP-NAP, administrated again via catheterization. The anti-tumour activity of HP-NAP is evaluated comparing the tumour volume, the extent of necrosis and the degree of vascularization between vehicle- and HP-NAP-treated animals.
סרטן שלפוחית השתן הוא אחד מסוגי הסרטן הנפוצים ביותר במערכת ואברי המין, עם כמעט 75,000 מקרים חדשים בכל שנה בארה"ב 1. שיעור גבוה של הישנות דורש מעקב לכל החיים, מה שהופך את סרטן שלפוחית השתן אחד מסוגי הסרטן היקרים ביותר לטיפול. הטיפול הסטנדרטי הזהב לדרגה הגבוהה NMIBC הוא כריתת טרנס-שופכה, ואחריו טיפול חיסוני שלפוחית עם BCG. למרות שהמנגנון המדויק של הפעילות אנטי-הסרטני של BCG נותר הובהר במלואו, הוא קיבל את זה ההפעלה של תגובה חיסונית של תאים מועשרים בעוזר T (Th) 1 ורעיל לתאי T (TC) 1 תאים חיונית ל ההצלחה של הטיפול 2.
למרות העובדה כי BCG נשאר טיפול הבחירה בNMIBC, שיעור גבוה של חולים אינם מגיב לטיפול; יתר על כן, זה יכול לגרום למספר תופעות לוואי: כ -70% מגידולים שטופלו יחזרו אחרי כמה זמן ו~ התקדמות 15% לטופס השריר פולשנית שלמחלה. תופעות לוואי אחרים הקשורים לטיפול BCG כוללים dysuria, דלקת שלפוחית השתן ודלקת כליות 3-6.
פיתוח אסטרטגיות טיפוליות חדשניות חייב לקחת בחשבון את השימוש במודלים פרה-קליניים, הבא במבחנה הערכה ראשונית; זה רלוונטי במיוחד בגידולי מייקרו-סביבה שיכול להשפיע באופן משמעותי לפיתוח והיענותם לטיפול.
בעשור האחרון, יש לנו לטפל בהיבטים שונים של פעילות הוויסות החיסונית של HP-NAP, חלבון היוצר על ידי החיידק הליקובקטר פילורי, בתחילה זוהה כמסוגל לקדם הידבקות האנדותל של תאי polymorphonuclear (PMNs) 7. מבחינה מבנית, HP-NAP שייך לחלבון הגנה-DNA בתנאים מורעבים משפחה (DPS) 8 וכולל 12 יחידות משנה זהות מסודרות בקליפת dodecameric.
אנחנו הוכחנו כי HP-NAP הואקולט-כמו אגרה (TLR) 2 אגוניסט, עם פעילות ויסות-חיסונית חזקה אחראית לנהיגת הבידול של T לימפוציטים כלפי פנוטיפ Th1, הן במבחנה in vivo 9-10. בכוחה של פעילות זו, HP-NAP יכול להפנות את התגובה החיסונית Th2 לתגובת Th1 מועיל יותר במודל עכברי של אסתמה אלרגית 11.
כדי להעריך את הפוטנציאל אנטי-הסרטני Th1 תלוי של HP-NAP, נצלנו מודל עכבר של סרטן שלפוחית השתן שפותח לפני מספר שנים על ידי O'Donnel ועמיתים 12 להערכת ההשפעה של ממשל BCG.
עם פרוטוקול זה, אנו מראים כי HP-NAP יש פוטנציאל אנטי-סרטני חזק נגד סרטן שלפוחית השתן ושהיעילות של ממשל HP-NAP מקביל להצטברות המשמעותית, בתוך בלוטות הלימפה אזורית וגידול, של שני לימפוציטים מסוג Th1 וTc1 ייצור אינטרפרון ( IFN) -γ 13 </sup>. גידולים מבודדים מעכברים שטופלו-HP-NAP הראו יותר נמק ופחות כלי דם מאשר עמיתו שלא טופל.
הדו"ח הנוכחי מספק פרוטוקול stepbystep, המפרט את ההכנה של בעלי החיים, צנתור שופכתם, השריפה הכימית הנדרשת לחיבור של תאי רירית שלפוחית השתן, וההזרקה של התאים הסרטניים. אנו גם מתארים את הממשל המקומי של HP-NAP שיכול להיחשב כאב טיפוס של כל סוכנים טיפוליים שפותחו לטיפול בסרטן שלפוחית השתן. הראיות שהושגו על ידי השוואת גידולים מבודדים משליטה וHP-טופל NAP בעלי החיים מדגישה לא רק את העובדה שHP-NAP יכול להיות מועמד טוב לטיפול חיסוני בסרטן שלפוחית השתן, אלא גם את היעילות הכללית של הניסוי להגדיר.
רוב ההתקדמות בטיפול בסרטן דורשים בדיקות במודלים של בעלי חיים לפני שמתחיל ניסויים קליניים. האפשרות ללמוד ביולוגיה גידול in vivo, מנצל מודלים של בעלי חיים, מהווה כלי חיוני לחוקרים חוקרים פתוגנזה של הסרטן, המאפשרים ההערכה של גישות טיפוליות שונות. דגמי orthotopic יישארו סט?…
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכה על ידי Associazione Italiana ללה Ricerca sul Cancro, משרד האיטלקי של אוניברסיטות ומחקר, פרויקטי Prin וProgetti di Ricerca di Ateneo, להעניק N ° CPDA137871, Fondazione Cariplo, להעניק N ° 2,011-0,485 לMDB, ועל ידי Finanziamento ג'ובאני Studiosi, אוניברסיטה של פדובה, לגאיה Codolo.
Materials | |||
C57BL/6J female mice | Harlan Italy (Udine, Italy) | ||
MB49 Cells | Obtained from Prof. O'Donnel, University of Iowa Carver College of Medicine, Iowa, USA | ||
RPMI | Sigma-Aldrich (St. Louis, Missouri, USA) | R8758 | |
FBS | Sigma-Aldrich | F7524 | |
PBS | Sigma-Aldrich | D1408 | 10X, to be diluted in apyrogenic water |
Flask | Becton Dickinson (Franklin Lakes, New Jersey, USA) | 353135 | |
Syringe 1ml | Becton Dickinson | 301358 | |
Trypsin | Life Technologies (Waltham, Massachusetts, USA) | ||
Gentamycin | Life Technologies | 15710-049 | |
Xilor | Bio 98 s.r.l. (Milano, Italy) | 2% Xylazin | |
Zoletil | Virbac (Carros, France) | 359713301992 | 5% Zolazepam + 5% Tiletamine |
24G Catheter | Terumo (Rome, Italy) | SR+DM2419PX | |
HCl | Carlo Erba Reagents (Milano, Italy) | 403871 | Liquid |
NaOH | JT Baker (Center Valley, Pennsylvania, USA) | 10095011 | Powder |
Equipment | |||
Surgical Scalpel | Albion Surgical Limited (Sheffield, England) | ||
Microtome | Leica Microsystem ( Wetzlar, Germany) | RM2235 | |
Microscope Slides | VWR International (Radnor, Pennsylvania, USA) | 631-0108 | |
Image Analyzer | Zeiss (Jena, Germany) | Cyres System |
Materials C57BL/6J female mice Harlan Italy (Udine, Italy) MB49 Cells Obtained from Prof. O'Donnel, University of Iowa Carver College of Medicine, Iowa, USA RPMI Sigma-Aldrich (St. Louis, Missouri, USA) R8758 FBS Sigma-Aldrich F7524 PBS Sigma-Aldrich D1408 10X, to be diluted in apyrogenic water Flask Becton Dickinson (Franklin Lakes, New Jersey, USA) 353135 Syringe 1ml Becton Dickinson 301358 Trypsin Life Technologies (Waltham, Massachusetts, USA) Gentamycin Life Technologies 15710-049 Xilor Bio 98 s.r.l. (Milano, Italy) 2% Xylazin Zoletil Virbac (Carros, France) 359713301992 5% Zolazepam + 5% Tiletamine 24G Catheter Terumo (Rome, Italy) SR+DM2419PX HCl Carlo Erba Reagents (Milano, Italy) 403871 Liquid NaOH JT Baker (Center Valley, Pennsylvania, USA) 10095011 Powder Equipment Surgical Scalpel Albion Surgical Limited (Sheffield, England) Microtome Leica Microsystem ( Wetzlar, Germany) RM2235 Microscope Slides VWR International (Radnor, Pennsylvania, USA) 631-0108 Image Analyzer Zeiss (Jena, Germany) Cyres System