Abstract
Le foie a une grande capacité à se régénérer. Les hépatocytes, les cellules du parenchyme du foie, peut régénérer en une de deux manières: ou conduit biliaire hepatocyte--régénération du foie. Dans entraîné hépatocytes la régénération du foie, régénération des hépatocytes sont dérivés d'hépatocytes préexistantes, alors que, dans la régénération conduit biliaire, de régénération des hépatocytes sont dérivées de cellules epitheliales biliaires (BEC). Pour entraîné hépatocytes la régénération du foie, il ya d'excellents modèles de rongeurs qui ont contribué de manière significative à la compréhension actuelle de la régénération du foie. Cependant, rien de tel modèle de rongeur existe pour entraînée bilio-régénération du foie. Nous avons récemment rapporté sur un modèle de blessure de foie de poisson zèbre dans lequel BEC donne lieu à beaucoup hépatocytes sur une perte sévère des hépatocytes. Dans ce modèle, les hépatocytes sont spécifiquement ablation par un moyen pharmacogénétiques. Ici, nous présentons en détail les méthodes pour l'ablation des hépatocytes et d'analyser le processus de régénération du foie BEC-driven.Ce modèle d'ablation spécifiques hépatocytes peut encore être utilisé pour découvrir les mécanismes moléculaires et cellulaires sous-jacents de conduit biliaire-régénération du foie. En outre, ces méthodes peuvent être appliquées à des écrans chimiques pour identifier de petites molécules qui inhibent ou augmentent la régénération du foie.
Introduction
Le foie est un organe très régénérative. Au cours de la régénération du foie, régénération des hépatocytes, les cellules du parenchyme du foie, sont dérivés des hépatocytes pré-existantes (entraînée hépatocytes régénération du foie (BEC) ou entraîné biliaire de régénération du foie) 1,2. Des lésions hépatiques suscite habituellement la prolifération des hépatocytes pré-existante; cependant, lorsque la prolifération des hépatocytes est compromise, BEC peut contribuer à hépatocytes 2-4. Ces deux modes de régénération du foie sont cliniquement significatives. Après l'ablation chirurgicale d'une partie du foie humain (par exemple, en raison de tumeurs du foie ou des donneurs vivants de foie), les hépatocytes dans le foie restant prolifèrent pour récupérer la masse du foie perdu. En revanche, chez des patients atteints de maladies hépatiques graves, la prolifération des hépatocytes est fortement compromise, de sorte que BEC ou de cellules souches du foie (LPC) semblent contribuer à la régénération des hépatocytes 5,6. Le modèle de hépatectomie partielle rongeurs 2/3, dans lequelhépatocytes prolifèrent pour récupérer la masse du foie perdu, a largement contribué à la compréhension actuelle de entraîné hépatocytes de foie de régénération 7,8. Cependant, il n'y a pas modèle de rongeur valide dans lequel les hépatocytes régénération proviennent principalement de BEC. Bien que plusieurs modèles de rongeurs de la toxine du foie ont conduit à l'identification de conduit biliaire du foie régénération 2-4, des études récentes de la lignée de traçage chez les souris indiquent une contribution minimale de BEC pour la régénération des hépatocytes dans ces modèles 9,10. Certains des modèles de lésions hépatiques de rongeurs, y compris une hépatectomie partielle et induite par l'acétaminophène 11-13-14,15 dommages au foie, ont été appliquées pour le poisson zèbre et conduit à l'identification de nouveaux gènes ou des voies impliquées dans la régénération du foie. Cependant, les hépatocytes entraînée, mais pas BEC-entraînée, la régénération du foie se produit dans ces modèles de lésion du foie de poisson zèbre. Par conséquent, un modèle de lésion du foie roman dans lequel CAE contribuent largement à regenerating hépatocytes est nécessaire pour une meilleure compréhension du BEC-entraîné la régénération du foie.
Les objectifs globaux du modèle d'ablation des hépatocytes décrits ici sont (1) pour générer un modèle de lésion du foie dans laquelle CAE contribuent largement aux hépatocytes de régénération, et (2) élucider les mécanismes moléculaires et cellulaires sous-jacents BEC-driven la régénération du foie. Nous émettons l'hypothèse que la gravité des blessures détermine le mode de régénération du foie; ainsi, nous avons prédit que conduit biliaire-régénération du foie lancerait lors d'une lésion des hépatocytes sévère. Pour tester cette hypothèse, nous avons développé un modèle de lésion du foie de poisson zèbre en générant une lignée transgénique, Tg (fabp10a: CFP-NTR) S931, qui exprime très nitroreductase bactérienne (NTR) fusionnée avec une protéine fluorescente cyan (CFP) dans le cadre du fabp10a spécifique hépatocytes promoteur. Depuis NTR convertit le promédicament non toxique, le métronidazole (Mtz), en un médicament cytotoxique, il ne l'ablation destiné NTR-cellules exprimant 16-18, dans ce cas, les hépatocytes. En manipulant la durée du traitement Mtz, l'étendue des hépatocytes ablation peut être contrôlée. En utilisant ce modèle, nous avons récemment signalé que sur une perte sévère des hépatocytes, BEC donne lieu à beaucoup hépatocytes régénération 19, qui a été confirmée par deux autres études indépendantes 20,21. Par conséquent, par rapport à l'rongeur ci-dessus et les modèles de lésions du foie de poisson zèbre, notre modèle d'ablation des hépatocytes est plus avantageux pour l'étude BEC-driven la régénération du foie.
Ce protocole décrit la procédure pour effectuer des expériences de régénération du foie en utilisant le modèle hépatocytes d'ablation poisson zèbre. Ce modèle sera appropriée pour déterminer les mécanismes sous-jacents conduit biliaire-régénération du foie et pour les écrans chimiques pour identifier de petites molécules qui peuvent réprimer ou d'augmenter la régénération du foie.
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Protocol
Poisson zèbre ont été soulevées et élevés selon la procédure standard; expériences ont été approuvés par l'Université de Pittsburgh institutionnel de protection des animaux et l'utilisation Comité.
1. Préparation d'embryons / larves
- Pour mener accouplements chronométrés, mis en place adulte mâle et femelle Tg (fabp10a: CFP-NTR) S931 poissons hémizygotes ou homozygotes O / N et placer une séparation entre eux. Retirer ce diviseur le lendemain matin lorsque l'accouplement est souhaitée. Recueillir des embryons en forçant l'eau en utilisant une maille fine passoire en plastique.
- Tourner la crépine à l'envers et rincer la surface de maille avec un mince filet d'eau d'œuf distribué à partir d'un flacon souple. Transférer 100 embryons dans une boîte de Pétri de 100 mm avec 25 ml d'eau de l'œuf. Gardez pas plus de 100 embryons par boîte de Pétri et les élever à 28 ° C.
- Pour inhiber la pigmentation, ajouter phénylthiourée (PTU) dans les boîtes de Pétri avant 10 h après la fécondation (HPF), et d'élever embryos / larves jusqu'au 80 HPF. La concentration finale de 0,2 mM est PTU. ATTENTION: PTU est toxique. Utiliser conformément aux directives de manipulation appropriées.
- Anesthésier les larves par addition de 3-amino benzoïque ester éthylique de l'acide (tricaïne), à une concentration finale de 0,016%, dans les boîtes de Pétri. Puis, en utilisant un microscope à épifluorescence, larves sorte CFP-positif. Utilisez les larves avec une taille de foie et jeter semblable à celles d'un foie plus petit ou plus grand.
REMARQUE: les larves de PCP-positif, indépendamment de l'intensité, peut être utilisé car il n'y a aucune différence dans la mesure des hépatocytes ablation entre les larves hémizygote et homozygotes. ATTENTION: tricaïne est toxique. Utiliser conformément aux directives de manipulation appropriées. - Retirer l'eau d'œuf contenant Tricaine et ajouter de l'eau d'œuf supplémenté avec 0,2 mM PTU. Garder les embryons / larves à 28 ° C.
2. Traitement Mtz
- Préparer une solution fraîche mM Mtz 10 en dissolvant 0,171 g de poudre Mtz en 100 ml d'eau d'œuf complété avec 0,2% de DMSO et 0,2 mM PTU. Pour dissoudre complètement le Mtz, mélanger la solution à la température ambiante sous agitation rapide pendant 20-30 minutes. Pour aider à solubiliser Mtz et d'améliorer Mtz perméation dans les larves, ajouter DMSO lors de la préparation Mtz. ATTENTION: L'exposition prolongée ou accrue concentration de Mtz est toxique. Utiliser conformément aux directives de manipulation appropriées.
- Séparer les larves dans des groupes de contrôle et expérimentales en transférant nombre désiré de larves dans deux différents plat 100 mm de Pétri ou plaque multi-puits. Pour le groupe expérimental, garder les larves dans une solution 10 mM Mtz; pour le groupe de contrôle, gardez-les dans de l'eau contenant de l'œuf 0,2% de DMSO.
- Couvrir les plaques ou les boîtes de Pétri contenant la solution Mtz avec du papier d'aluminium pour éviter la photo-inactivation de Mtz, et incuber à 28 ° C. La durée du traitement dépend de la Mtz stade larvaire et la lignée transgénique.
- Pour observer similaire sévère ablation des hépatocytes dans le
3. Analyse des voies biliaires axée sur la régénération du foie
- A la fin de la période d'ablation, on élimine la solution Mtz des plaques. Laver les larves Mtz traitée par addition de 25 ml d'eau de l'oeuf. Agiter la plaque 2-3 fois pour laver les larves avant de jeter l'eau d'œuf. Répétez trois fois et puis plonger les larves une fois de plus dans l'eau d'œuf. Pour éviter l'œdème cardiaque et la mort larvaire chez les larves traitées Mtz, ajouter une plus faible concentration de tricaïne, à une concentration finale de 0,008%, pour immobiliser les larves.
- Pour l'analyse du foie, examiner la taille du foie des larves Mtz traité sous un microscope à épifluorescence avec le filtre de la PCP. Évaluer les niveaux d'ablation d'hépatocytes fonction de la taille relative du foie: un grand (non-ablation; 0-10% larves), moyen (partiellement ablation; 10-20%) et très faible (entièrement ablation; 80 à 90%).
- Retirer les larves avec des foies non soumises à une ablation ou partiellement ablation. Seulement conserver des larves avec une minuscule foie, qui est indicative d'ablation sévère des hépatocytes. Pour l'analyse du foie à la régénération 0 point de temps de h (R0H), récolter les larves après Mtz lavage et de la PCP tri. Sinon, conservez les larves triés dans l'eau d'œuf supplémenté avec 0,2 mM PTU avant d'être prêt pour la récolte.
- Transfert larves récoltées dans un tube de microcentrifugation de 1,5 ml et remplacer l'eau d'oeuf avec la solution de fixation de 3% de formaldehyde dans du tampon PEM. Incuber le tube sur un rotateur O / N à 4 ° C.
- Remplacer la solution de fixation avec 1 ml de PBSDT et faire tourner le tube contenant les larves sur le rotateur pendant 5 min.
- Transférer les larves fixe dans une boîte de Pétri de 100 mm contenant PBSDT et en utilisant une pince, retirer manuellement jaune et pectorales sous un microscope de dissection. Transférer jusqu'à 20 larves tp disséqué dans un tube de 1,5 ml. <li> Remplacer solution PBSDT avec 1 ml de solution de blocage et de rock du tube sur un rotateur à température ambiante pendant 2 h.
- Remplacer la solution de blocage avec 100 ul de solution de blocage contenant des anticorps primaires. Lentement balancer le tube sur un rotateur O / N à 4 ° C.
- Retirer la solution d'anticorps primaire et laver avec PBSDT 5 fois pendant 10 min à chaque fois. Puis ajouter 100 ul de la solution de blocage contenant des anticorps secondaires et le rock sur un agitateur à température ambiante pendant 2h.
- Laver 5 fois avec PBSDT pour 10 min à chaque fois à la température ambiante en basculant sur un rotateur.
- Orientez les larves latéralement sur une lame de microscope et ajouter une goutte de milieu de montage. Les couvrir soigneusement avec un couvercle en verre et sceller le couvercle en verre avec un polissoir à ongles. Maintenant, il est prêt pour la microscopie confocale.
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Representative Results
Mtz traitement pendant 36 heures (A36h, A représente ablation) de 3,5 à 5 dpf réduit considérablement la taille du foie (figure 1B). Après Mtz lavage, considéré comme le début de la régénération du foie (R), forte fabp10a: CFP-NTR et fabp10a: expression DsRed réapparu dans les 30 heures (figure 1B). Le réseau des voies biliaires intra-hépatique, tel qu'évalué par l'expression de Alcam qui est présente dans la membrane du BEC 22, d'abord effondrée mais a été rétablie à 54 h post-sevrage (R54h) (figure 1C). Ces données indiquent que la régénération du foie et de récupération se produisent rapidement dans notre modèle de lésion du foie.
La figure 2 montre que la régénération des hépatocytes sont dérivés de BEC. La Tg (TP1: H2B-mCherry) ligne de S939 exprime une protéine fluorescente rouge nucléaire sous le contrôle d'un élément contenant des sites de liaison 12 RBP-Jĸ 23. Cette respo Notchélément nsive semble diriger l'expression du gène exclusivement dans les CEB dans le foie 24; cependant, il est possible qu'il entraîne l'expression des gènes dans LPC car signalisation Notch est étroitement liée à la LPC 25. Par conséquent, cette lignée transgénique permet une détection facile des BEC, et probablement LPC, noyaux. En outre, la stabilité de l'étendue H2B-mCherry permis de protéine de fusion de courte durée lignée traçage. La plupart des cellules H2B-mCherry + dans le foie en régénération R0H exprimé Hnf4α (figure 2A), qui est exprimé dans les hépatocytes, mais pas dans les CEB, dans le foie de commande. Hépatocytes, telle qu'évaluée par fabp10a: expression CFP-NTR, au R48h conservaient Tp1: expression H2B-mCherry (figure 2B, flèches). Ces données indiquent conversion BEC aux hépatocytes sur une perte sévère des hépatocytes, qui a été confirmée par la lignée permanente retraçant 19.
Figure 1. Un modèle de lésion du foie de poisson zèbre. (A) Schéma illustrant les périodes de traitement Mtz et la régénération du foie. (B) 36 h traitement Mtz considérablement réduit la taille du foie et fabp10a: PCP et fabp10a: DsRed fluorescence à R0H; Cependant, une forte PCP et DsRed fluorescence réapparu au R30h. Les flèches indiquent le foie (li). vues (C) confocale de projection de l'ensemble du foie immunocolorées avec des anticorps anti-Alcam que étiquetés BEC. Le réseau des voies biliaires intra-hépatique a été effondré à R0H mais rapidement rétablie à R54h. Régions pointillés décrivent le foie. Les barres d'échelle:. 100 (B), 20 (C) pm S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Figure 2. BEC donnent lieu à des hépatocytes sur une perte sévère des hépatocytes (A) vues de projection confocale du foie montrant Hnf4α (vert) et Tp1:. H2B-mCherry (rouge) au R0H expression. (B) confocale images de coupes simples optique montrant fabp10a: CFP-NTR (gris) et Tp1: H2B-mCherry (rouge) expression dans le foie. mCherry expression a été révélé par l'anti-mCherry immunocoloration. Notez l'expression de mCherry faible dans les noyaux des hépatocytes PCP + (flèches). Forte mCherry + cellules sont BEC. Les barres d'échelle:. 20 pm S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Sévère, mais pas doux, hépatocytes ablation suscite conduit biliaire-régénération du foie. Par conséquent, après un traitement Mtz et lavage, il est important d'examiner la taille du foie de la larve Mtz-traité, qui peut être évaluée par fluorescence intrinsèque de la PCP fabp10a: CFP-NTR transgène. Comme un faible pourcentage de larves traitées Mtz affiche non-ablatée (0-5%) ou partiellement ablation (10-20%) des foies, il est essentiel de régler et d'analyser seulement les larves avec une très petite foie, qui est indicative d'une grave ablation des hépatocytes.
Bien que, dans notre protocole, nous avons traité des larves de poisson zèbre avec Mtz 3,5 à 5 dpf (une période de traitement de 36 h), les étapes de remplacement et la durée du traitement Mtz sont également possibles. Par exemple, les larves traitées 5-6 dpf (une période de traitement de 24 h) a également montré d'ablation des hépatocytes sévère, semblable à la période précitée de traitement de 36 heures. Deux groupes supplémentaires générés indépendammentfabp10a similaire: lignées transgéniques NTR et ont également signalé sur le processus de régénération du foie conduit biliaire-suit l'ablation spécifique des hépatocytes. Alors qu'un groupe traité larves avec Mtz 6-7 dpf 21, un autre l'ont fait de 3,5 à 4,5 dpf, parvenir à des conclusions semblables 20. Comme chaque fabp10a: lignée transgénique NTR peut présenter un niveau d'expression NTR différente, la durée et la posologie du traitement Mtz devraient être déterminés séparément pour chaque de la ligne transgénique utilisée. Il peut également être utile pour générer une lignée transgénique avec une version améliorée du gène NTR, dans lequel l'introduction de trois mutations ponctuelles conduit à une augmentation de son activité enzymatique 26. Ce mutant NTR se traduira par un événement d'ablation plus rapide que le type sauvage NTR 26. Ceci est particulièrement avantageux lorsque de type sauvage cinétique NTR peuvent limiter la possibilité de l'ablation complète des cellules à un stade souhaité.
Étant donné que des centaines de larvespeut simultanément subir l'ablation des hépatocytes, ce modèle de blessure de foie de poisson zèbre peut être appliquée aux écrans chimiques pour identifier de petites molécules qui peuvent supprimer ou augmenter conduit biliaire-régénération du foie. Par exemple, en utilisant ce modèle, le groupe Shin à Georgia Tech effectué un écran chimique et a trouvé plusieurs agonistes et antagonistes Wnt Notch qui facilitent la régénération du foie 20. Nous avons également effectué un petit écran chimique à grande échelle et identifié plusieurs composés qui peuvent supprimer la régénération du foie (SK, TYC, JS, et DS, en préparation).
Marker analyse chez l'homme ont suggéré que BEC peut contribuer à hépatocytes régénérées dans le foie malade 5,6. Le groupe du Dr Wanless a récemment rapporté que un grand pourcentage de parenchyme dans la cirrhose régressé semble être dérivé de LPC / BEC 27 chez l'homme, ce qui implique l'importance du BEC-entraîné la régénération du foie dans la cirrhose régression. Compte tenu du fait que les CEB principalementcontribuer à la régénération des hépatocytes dans le modèle de blessure de foie de poisson zèbre décrit ici, ce modèle sera un outil précieux pour déterminer les mécanismes cellulaires et moléculaires sous-jacents BEC-entraîné la régénération du foie. Comprendre ces mécanismes permettra de mieux comprendre importantes sur la façon d'augmenter innée régénération du foie chez les patients atteints de maladies hépatiques sévères. En outre, en combinaison avec des écrans chimiques, ce modèle de poisson zèbre peut être utile dans l'identification d'un médicament potentiel qui peut faciliter la régénération du foie innée chez des patients humains.
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Disclosures
Les auteurs déclarent qu'ils ont aucun intérêt financier concurrentes.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-amino benzoic acid ethyl ester (Tricaine) powder | Sigma-Aldrich | A5040 | Make 0.4% (15 mM) tricaine stock : Bring 0.4 g tricaine to 100 mL with egg water. Adjust to pH 7. |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Metronidazole | Sigma-Aldrich | M1547 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8532 | |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | 252549 | |
| Calcium sulfate dihydrate | Sigma-Aldrich | C3771 | |
| N-Phenylthiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629 | |
| Mounting media (Vectashield) | Vector Laboratories | H-1000 | |
| 100 x 15 mm petri dish | Denville Scientific Inc. | M5300 | |
| clear nail polish | Fisher Scientific | 50949071 | |
| fine forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | Dumont #5 |
| glass slide | Fisher Scientific | 12-544-1 | |
| glass coverslip | Fisher Scientific | 12-540-A and 12-542-A | 18 x 18 mm |
| zn-5 (mouse anti-Alcam) | ZIRC | zn-5 | 1:10 dilution |
| goat anti-Hnf4a | Santa Cruz | sc-6556 (C-19) | 1:50 dilution |
| rat anti-RFP | Allele Biotechnology | ACT-CM-MRRFP10 | 1:300 dilution |
| AlexaFluor 647 AffiniPure Donkey Anti-goat IgG (H+L) | Jackson laboratories | 705-605-147 | 1:500 dilution |
| AlexaFluor 647 AffiniPure Goat Anti-mouse IgG (H+L) | Invitrogen | A21240 | 1:500 dilution |
| Cy3 donkey anti-rat IgG | Jackson laboratories | 712-165-150 | 1:500 dilution |
| dissecting microscope | Leica Microsystems | S6F | |
| epifluorescence microscope | Leica Microsystems | M205FA | |
| confocal microscope | Carl Zeiss | LSM700 | |
| egg water | 0.3 g/L of sea salts ‘Instant Ocean’ and 0.5 mM CaSO4 in distilled water. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10X PBS | 25.6 g Na2HPO4·7H2O, 80 g NaCl, 2 g KCl, 2 g KH2PO4. Bring to 1 L with distilled water. Adjust pH 7. Autoclave for 20 min at 121°C. | ||
| 1X PBSDT | 0.2% Triton X-100 and 0.2% DMSO in 1 X PBS. | ||
| PEM buffer | 30.2 g PIPES, 761 mg EGTA, 1 mM MgSO4. Bring to 1 L with distilled water. Adjust pH 7. | ||
| Blocking solution | Mix 1 ml of heat-inactivated horse serum with 9 ml of 1X PBSDT. |
References
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