Rodents are an appropriate model to investigate the molecular substrates of behavior and complex psychiatric disorders. Brain microinjection in awake rodents can be used to elucidate disease substrates. An efficient and customizable brain microinjection method as well as the execution of an operant paradigm that quantifies motivation is presented.
Brain microinjection can aid elucidation of the molecular substrates of complex behaviors, such as motivation. For this purpose rodents can serve as appropriate models, partly because the response to behaviorally relevant stimuli and the circuitry parsing stimulus-action outcomes is astonishingly similar between humans and rodents. In studying molecular substrates of complex behaviors, the microinjection of reagents that modify, augment, or silence specific systems is an invaluable technique. However, it is crucial that the microinjection site is precisely targeted in order to aid interpretation of the results. We present a method for the manufacture of surgical implements and microinjection needles that enables accurate microinjection and unlimited customizability with minimal cost. Importantly, this technique can be successfully completed in awake rodents if conducted in conjunction with other JoVE articles that covered requisite surgical procedures. Additionally, there are many behavioral paradigms that are well suited for measuring motivation. The progressive ratio is a commonly used method that quantifies the efficacy of a reinforcer to maintain responding despite an (often exponentially) increasing work requirement. This assay is sensitive to reinforcer magnitude and pharmacological manipulations, which allows reinforcing efficacy and/ or motivation to be determined. We also present a straightforward approach to program operant software to accommodate a progressive ratio reinforcement schedule.
Rodents and humans respond in remarkably similar ways to behaviorally relevant stimuli1-3. This suggests that rodents are appropriate subjects for elucidating the molecular substrates of behavior and complex psychiatric conditions4. Understanding the molecular substrates of complex behavioral processes, such as motivation, frequently requires brain microinjection. Both the brain microinjection technique and a primary motivation assay will be presented here. Rats will be used as subjects, but these procedures can readily be adapted to well-handled mice. Included herein are procedures for the manufacture of the required cannulae, obturators (dummy cannulae or stylets), and microinjectors. The method presented is significantly more flexible and more cost-efficient than prefabricated implements. This flexibility will prove valuable when optimizing conditions. Importantly, because the microinjection procedure can be used to test a myriad of hypotheses; the techniques presented here should be broadly applicable. For example, receptor ligands can be microinjected to understand neurochemistry3,5,6; cell-permeable peptides and small-molecules can be microinjected to understand intracellular signaling pathways7-10; toxins, ion channel blockers, or antagonist cocktails can be microinjected to understand circuitry1,11,12.
While the generic protocol presented here can be readily adapted by the user for their particular needs, the procedure is particularly well suited for behavioral assays since microinjection occurs in awake rodents that are only under mild hand restraint. No anesthesia or special restraints are required. This is possible because the brain itself lacks pain sensation. However, if anesthesia is not used, microinjection must occur through cannulae that were previously stereotaxically implanted. This is because nociceptors are present on the scalp, meninges,13 which are the membranes surrounding the brain, and the periosteum,14 which is the membrane covering the skull. It should be noted that microinjection under anesthesia is sometimes desirable. One example is when the virus is being injected, and one may wish to inject virus directly through either stainless steal needles15 or glass pipettes because this can reduce tissue damage and improve transduction efficiency.16,17 The microinjectors described below can be modified for this purpose and suggestions on how to do this can be found in the Discussion. Because other JoVE articles have demonstrated stereotaxic brain cannula implantation,18-20 these procedures will not be covered here.
We present these microinjection procedures together with an assay that quantifies motivation. Several rodent models of motivated behavior are currently in use, such as the runway box and barrier scaling. Here, we describe how to use an operant progressive ratio schedule of reinforcement to quantify motivation where operant responding is being maintained by a reinforcer. Responding on the progressive ratio is responsive to reinforcer magnitude.21,22 Accordingly, this assay is routinely used as a proxy for motivation and/or reinforcing efficacy. 21,23-30 Because several excellent reviews have covered this topic in detail,21,24 we will focus mainly on practical concerns.
El procedimiento que aquí se presenta es un medio eficaz para la fabricación de cánulas microinyección y microinyectores que ayudarán en la aclaración de los sustratos moleculares de la conducta motivada. Este método ofrece varias ventajas. En primer lugar, mediante la fabricación de los propios implantes y microinyectores, nuevos parámetros experimentales se pueden optimizar con rapidez, es decir, uno no necesita esperar a que los componentes a medida que lleguen. En segundo lugar, debido al pequeño diámetro de la cánula, más cánulas pueden ser implantados simultáneamente. Esto acorta el tiempo quirúrgico requerido, lo que puede mejorar la supervivencia, y también permite que múltiples implantes por animal. En tercer lugar, el software utilizado para controlar las cámaras operantes acomoda fácilmente Escala de tasa progresivas desde un paradigma proporción fija se puede convertir rápidamente a un paradigma relación progresiva mediante la simple aplicación de una lista de parámetros de transición caso de que contiene el programa de refuerzo deseado.
Serampliamente útil, un procedimiento de microinyección genérico se presentó que debería ser ampliamente aplicable para la microinyección de casi cualquier reactivo disponible actualmente. En consecuencia, esperamos que esta técnica seguirá siendo de gran utilidad similar en el futuro con pequeñas modificaciones. Por cambiando sólo unas pocas variables, este enfoque se puede aplicar a un amplio número de reactivos. Los parámetros que se pueden manipular más comúnmente incluyen la longitud que el microinyector sobresale de la cánula, el volumen de la inyección, y la velocidad de inyección. Por ejemplo, uno puede desear el inyector sobresalga más lejos de la punta de la cánula para evitar la cicatriz glial que normalmente se forma alrededor de los implantes crónicas. Adicionalmente, se puede desear para inyectar un volumen mayor. Para microinyecciones virus del estriado, un volumen de 1 l se utiliza normalmente y este volumen se inyecta típicamente durante un período de tiempo más largo (con frecuencia 7 – 10 min plus 3 – 10 min tiempo de difusión adicional) en comparación con que el usod para los reactivos farmacológicos (típicamente 0,3 – 0,5 l más de 2 – 3 minutos más 1 – 3 min tiempo de difusión adicional). El usuario debe consultar la literatura y / o empíricamente determinar los parámetros más adecuados para sus necesidades. Independientemente, el éxito de este procedimiento depende críticamente de 4 variables: 1) la longitud de la cánula, 2) longitud microinyector, 3) calidad de patrón de pulverización microinyector, y 4) la integridad del sistema antes de la inyección. Debido a la ubicación microinyección depende de la profundidad que el microinyector sobresale de la cánula, es imperativo que tanto cánulas (Paso 1.2.8) y la longitud microinyector (post-flexión, Paso 2.2.1) son ambos precisamente conocida y uniforme entre todos los sujetos . Esto puede ser fácilmente controlado por fácilmente rechazar cualquier utensilio que no es la longitud requerida en la final de la re-medición. Por otra parte, la ubicación de inyección sólo puede predecirse si se produce inmediatamente por debajo de la cánula guía. Por lo tanto, cualquier microinyector que el DOEs No rocíe un largo arroyo, bien en las pruebas (Pasos 2.4.6) debe ser rechazada. Una inyección de calidad también está relacionada con la integridad del sistema antes de la inyección. Si después de dispensar toda el agua del inyector (antes de llenar con el reactivo) se observan varios puntos en el laboratorio de borrado, entonces una fuga necesita ser remediado (Nota sobre el paso 2.4.8). Además, si la burbuja (Paso 2.4.9) que separa el medicamento del agua en la tubería PE20 es no uno, burbuja única (después de llenar el microinyector con el reactivo), entonces el inyector está parcialmente obstruido. Esta obstrucción puede prevenir o desviar la inyección. Esto también se puede remediar fácilmente (Nota en el paso 2.4.8).
Si uno desea microinyectar mientras el animal está en el marco estereotáxico hay tres alternativas. En primer lugar, se podría aumentar la longitud del collar microinyector tal que puede ser sostenida firmemente por el manipulador estereotáxico y también se extiende lo suficiente para permitir la conexión a un tubo de PE20. En segundo lugar, ene temporalmente podría implantar una cánula y utilizar el microinyector norma que aquí se presenta. En tercer lugar, se podría utilizar dibujado y pipetas de vidrio pulido. 16,17
Una limitación importante del procedimiento que aquí se presenta es que se realiza mejor en ratas bien manejados, que están familiarizados con el procedimiento. Las ratas utilizadas para los datos que se describen en la sección de resultados requieren procedimientos especiales de manipulación debido a que el mismo investigador maneja las ratas sobre una base diaria durante más de 2 meses. Esto incluyó la observación diaria y la manipulación del implante quirúrgico durante al menos 2 semanas. Sin embargo, las ratas se habituaron rápidamente pueden por una serie de técnicas que se utilizan para antes del ensayo de inhibición pre-pulso, que puede verse afectada por el estrés. Estas técnicas especiales de habituación han sido muy bien detallado anteriormente. 43 Además de estos procedimientos, es aconsejable que las ratas se habituaron al procedimiento de microinyección donde se utilizan microinyectores acortados duinyecciones anillo 'farsa'. Durante estas inyecciones simuladas, es fundamental que el microinyector no sobresale en el tejido con el fin de limitar el daño a los tejidos. En otras palabras, el microinyector debe ser de no más de 14 mm se inclinó. Por lo tanto, la habituación a fondo requerida para la aplicación óptima de esta técnica podría ser visto como una limitación.
Si bien existen varios paradigmas de comportamiento para medir la motivación, la relación progresiva se utiliza comúnmente para cuantificar el esfuerzo que el sujeto está dispuesto para ejercer para obtener un reforzador. El paradigma relación progresiva produce una medida conocida como punto de interrupción, que a menudo se define como el número máximo de pulsaciones de palanca en la última relación completado;.. Es decir, máxima respuesta que genera un reforzador 21 La relación progresiva es sensible a reforzador magnitud. Por ejemplo, el aumento de las dosis de cocaína (o sacarosa) producen un mayor punto de interrupción y la cocaína inferior (o sacarosa) dosis producen una breakp menormixto. 21,22 En consecuencia, punto de interrupción es un proxy utilizado habitualmente para la motivación y / o eficacia de refuerzo. 21,23-26 Porque la intención del punto de interrupción es determinar cuando el animal deja de responder, un parámetro importante del paradigma de relación progresiva es duración de la sesión. Duración de la sesión finitos puede poner una tapa falsa en los valores de punto de interrupción y esto puede ser exacerbada por los pre-tratamientos que disminuyen de forma anormal la tasa de auto-administración o que pausa aumento post-refuerzo. Este factor de confusión puede ser superada por cualquier número de enfoques;.. Por ejemplo, las sesiones que terminan cuando el animal ha retenido responder por algún múltiplo del intervalo promedio entre infusión 44 Una variante más comúnmente aplicada de este enfoque es a terminar sesiones vez de responder tiene sido retenida por algún valor determinado empíricamente que se mantiene constante a través de temas. Hemos proporcionado el método para aplicar este enfoque en el Paso 4.4.9.11.
The authors have nothing to disclose.
MSB is supported by the Alcohol Beverage Medical Research Foundation, a Center for Translational Research Award (UL1 TR000058), the National Institutes for Alcohol Abuse and Alcoholism (P50 AA022537), and startup funds provided by the Virginia Higher Education Equipment Trust Fund and the VCU School of Medicine.
Cannula Tubing | Amazon Supply/ Small Parts | HTXX-26T-60 | 26 gauge, Hypotube S/S 316-TW 26GA |
Obturator | Amazon Supply/ Small Parts | GWXX-0080-30-05 | 33 gauge, Wire S/S 316LVM 0.008 IN |
Microinjector Wire | MicroGroup | 33RW 304 | 33 gauge |
Super Glue | Loctite | 3924AC | Liquid, Non-gel, can be autoclaved |
Microinjector Plastic Tubing | Becton Dickson | 427406 | PE20 |
Medium Weight Hemostats | World Precision Instruments | 501241-G | |
Ruler | Fisher | 09-016 | 150 mm |
#7 Forceps | Stoelting | 52100-77 | Dumont, Dumostar |
Rotary Tool | Dremmel | 285 | Two-speeds |
Cut-off Disc | McMaster Carr | 3602 | 15/16" x 0.025" |
Microinjection Pump | Harvard Apparatus | PhD 2000 | |
1 ul Glass Syringe | Hamilton | 7001KH | Needle Style: 25s/2.75"/3 |
Cotton Tipped Applicator | Fisher | 23-400-101 | |
Lab Wipes | Kimwipes | 34133 | |
Operant Software | Coulbourn | Graphic State | |
Operant Chambers | Coulborun | Habitest |