Immunofluorescens att Övervaka Cellular Upptag av humant laktoferrin och dess associerade antiviral aktivitet mot hepatit C-virus

Abstract

Immunofluorescens är en laboratorieteknik som vanligen används för att studera många aspekter av biologi. Den används vanligtvis för att visualisera distributionen och / eller lokalisering av en målmolekyl i celler och vävnader. Immunofluorescens förlitar sig på specificiteten av fluorescensmärkta antikroppar mot deras motsvarande antigener inom en cell. Både direkta och indirekta immunfluorescens metoder kan användas som förlitar sig på användning av antikroppar kopplade till en fluorokrom. Direkt immunofluorescens är mer sällan används eftersom det ger lägre signal innebär högre kostnader och mindre flexibilitet. I motsats härtill är indirekt immunofluorescens mer vanligt förekommande på grund av dess höga känslighet och tillhandahåller en förstärkt signal, eftersom mer än en sekundär antikropp kan fästa till varje primär antikropp. I detta manuskript, var båda epifluorescensmikroskopi och konfokalmikroskopi används för att övervaka internalisering av humant laktoferrin, en viktig komponent av immunsystemet, i leverceller. Dessutom övervakas vi hämmande potential hLF på den intracellulära replikation av hepatit C-virus med hjälp av immunofluorescens. Både för- och nackdelar med dessa metoder diskuteras.

Protocol

1. Celler beredning och behandling

1. I en 24-brunnar, sätta en glaskupa på botten av brunnarna. Tvätta varje brunn med fosfatbuffrad saltlösning (PBS).
2. Seed Huh-7-celler som stöder HCV subgenomiskt replikon i varje brunn till en densitet av 5 x 10 ⁴ celler / brunn. Om det inte finns någon behandling för att göra, kan cellerna ympas vid en högre densitet. Odlingsmediet är Dulbeccos modifierade Eagles medium (DMEM) kompletterat med 10% fetalt bovint serum (FBS), 2 mM L-glutamin, 1 mM natriumpyruvat och 250 mg / ml G-418 (för att bibehålla replikonet).
3. Inkubera vid 37 ° C och 5% CO _{2. Nästa} dag, behandla cellerna med 3 | iM hos hLF renat från human mjölk.

2. Paraformaldehyd / sackaros beredning (12% PAF och 12% sackaros)

1. Sätt 500 ml PBS i en bägare och värm mellan 20 ° C och 30 ° C. Lös 60 g sackaros i PBS. Lös 60 g paraformaldehyd (PAF) i PBS / sackaroslösning. Tillsätt långsamt NaOH 2N (3 till 7 ml) till dess en klar lösning erhålles.
2. Justera pH till 7,4 med HCl. Hela volymen till 500 ml med PBS. Filtrera genom gravitation på Whatman filter. Före användning späds lösningen med PBS till en slutlig koncentration av 4% PAF och 4% sackaros (Lagring 4 ° C under en vecka max).

3. Immunofluorescens

1. Vid önskad tid (0 tim, 2 timmar eller 24 timmar av behandling), tvätta cellerna två gånger (1 min) med PBS och fixa med PBS / 4% PAF / 4% sackaros i 20 minuter vid RT. Cellerna är typiskt 30-40% sammanflödet och 1,5x10 ⁵ celler används.
2. Permeabilisera cellerna med 0,15% Triton X-100 i PBS i 5 min vid RT och blocket i 10% normalt getserum (NGS) i PBS under 20 minuter.
3. Späd den primära antikroppen av proteinet av intresse i 10% NGS (exempel: primära mus-anti-hLF antikropp utspädd 1: 1000). Applicera den primära antikroppen till cellerna.
4. Efter 4 h vid RT eller O /N vid 4 ° C, tvätta cellerna tre gånger under 5 min med 10% NGS. Färga cellerna med sekundär antikropp märkt med fluorokrom utspädd i 10% NGS (exempel: Fluorokrom med en excitationsvåglängd av 488 nm kopplade till en antikropp-anti-mus 1: 1000) under 1 h vid RT i mörker.
5. Tvätta cellerna en gång i 5 min med PBS och färgas cellerna med 4 ', 6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) (1 | ag / ml) under 15 min vid RT i mörker.
6. Tvätta cellerna två gånger i 5 min med PBS. Mount täcker glasögon på SlowFade monteringsmedium innan visualisering genom mikroskopi. Cellerna är nu klara för analys genom epifluorescens eller konfokalmikroskopi.
7. Använd olika kontroller för att säkerställa specificitet upptäckt. Till exempel kan alla antikroppar utelämnas i syfte att detektera autofluorescens. Den primära antikroppen kan utelämnas för att bestämma den icke-specifik färgning av den sekundära antikroppen. Slutligen, om möjligt, kontrollceller eller vävnader som inteuttrycka molekylen av intresse kan också användas.
8. Visualisera proverna med hjälp av lämpliga fluorescensmikroskop (epifluorescens eller konfokala) och filteruppsättningar lämpliga för fluorescerande etikett som används. Diabilder kan också lagras i ett bildspel rutan <-20 ° C för senare granskning.

4. Fluorescensmikroskopi

1. Förvara proverna i mörker för att förhindra fotoblekning. Slå på ljuskällan för den valda mikroskop (epifluorescens eller konfokala).
2. Slå på mikroskopet. Slå på kameran för mikroskopet. Sätt bilden på mikroskop för visualisering. Lägg immersionsolja på bilden för att öka den numeriska bländaröppningen av objektiv.
3. Välj lämpliga filter. Justera fokus och lämpligt mål. Justera luckorna för att upptäcka en lämplig fluorokrom men förhindrar fotoblekning. Håll taklampa av för att minimera bakgrundsljus när man tittar på provet.
4. Byt: tee filter för att visualisera olika fluorokromer (t.ex. DAPI och för en excitationsvåglängd av 488 nm). Ta bilder med kameran.

Representative Results

Förmågan hos den hepatiska Huh-7-cellinjen att internalisera exogent administrerad hLF övervakades med användning av immunofluorescens på ett konfokalt mikroskop. hLF sattes till odlingsmedia och interna fick under 24 timmar, varefter var extracellulärt hLF tvättades med PBS och kvarvarande membranbundna hLF bröts ned med 5 min trypsinbehandling (1 ml). Celler såddes på nytt och tilläts åter vidhäfta under 18 h före immunofluorescensfärgning. För att beskriva de cytoplasmiska gränser cellerna membranen färgades med vetegroddagglutinin (WGA) fluorokrom av en excitationsvåglängd av 488 nm-konjugat. HLF-färgning åstadkoms med användning av en anti-hLF primär antikropp och en fluorokrom med en våglängd av 633 nm, kopplad till den sekundära antikroppen. För att bestämma den exakta lokaliseringen av hLF, cellerna avbildas efter sekventiella 0,5 um horisontellt tvärsnitt av konfokalmikroskopi. Figur 4 visar en optical tvärsnitt motsvarande till mitten av celltjocklek. Efter tillsatsen av exogen hLF, var en betydande del av hLF upptäcks inne i cytoplasman av hepatocyter. Ingen hLF observerades inne i obehandlade celler vid användning av identiska instrument inställningar. Tillsammans utgör dessa data bekräftar att hepatocyter har kapacitet att förvärva hLF från deras extracellulära miljön.

Förmågan hos hLF att hämma den intracellulära replikation av HCV var nästa övervakas med epifluorescensmikroskopi. Huh-7-celler som stöder HCV subgenomt repliken (som uttrycker HCV NS3, NS4A, NS4B, NS5A, NS5B-proteiner) replikering behandlades med 3 iM hLF för 0, 2 eller 24 timmar. Den dubbel immunofluorescensfärgning för hLF och HCV NS5A proteiner analyserades genom epifluorescensmikroskopi. Dessa resultat indikerar att HCV subgenom replikon färgning (mätt genom immunofluorescens av HCV icke-struktur 5A protein) reducerades i celler behandlade med hLF. Figur 5 trong> visar en kvalitativ minskning med cirka 50% i HCV färgningsintensitet efter 24 h av hLF behandling. Detta är en intressant iakttagelse, eftersom detta subgenoma replikon systemet saknas HCV E1 och E2 höljesglykoproteiner, som är allmänt accepterade farmakologiska mål för hLF. Samtidigt med blekning av HCV färgning, började hLF ackumulering att detekteras efter 2 timmar, och stark hLF ackumulering observerades efter 24 timmar.

Figur 1. Princip för epifluorescensmikroskopi. I denna typ av mikroskopi, excitationsfilter välja den specifika våglängd som exciterar provet (Tissus eller celler som härbärgerar fluorescensmärkta antikroppar). Dessutom är emissionsfilter väljs för att matcha de spektrala emissionsegenskaper hos fluoroforen som används för att märka provet.belastning / 53053 / 53053fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2. Princip av konfokalmikroskopi. Denna typ av mikroskopi använder en utsläpps pinhole att eliminera ur-fokus ljussignal. Eftersom endast ljus som produceras av fluorescens mycket nära fokalplanet kan detekteras, är den optiska upplösningen på bilden mycket bättre än epifluorescens mikroskop. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3. Schematisk av den indirekta och direkta immunofluorescens. Direkt immunofluorescens innebärendast en typ av antikropp märkt med en fluorokrom som är specifik för den intressanta molekylen (primär antikropp). Däremot innebär indirekt immunofluorescens sekundära antikroppar märkta med fluorokromer som är specifika för de arter av omärkta primära antikroppen. Mer än en sekundär antikropp kan fästa till varje primär antikropp som ökar fluorescenssignalen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 4. Hepatocellulär upptag av exogena hLF. Huh-7-celler behandlades med 0 iM eller 3 iM hLF under 24 timmar, tvättades två gånger, genomgå en 5 min trypsinbehandling, får åter ansluta sig under 18 timmar och utsattes för immunofluorescens. Kärnor färgades wte DAPI (blå kanal), var plasmamembran märkta med WGA (grön kanal) och hLF färgades med en anti-hLF antikropp (röd kanal). Bilder förvärvades av konfokalmikroskopi med en ursprunglig förstoring av 60x. De horisontella optiska tvärsnitt representerar halva tjockleken av cellerna. Skal, 10 | j, m. Modifierad från (11). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 5. hLF behandling minskar HCV färgning. Huh-7-celler som stöder HCV subgenoma replicon replikering behandlades med 3 iM hLF för 0, 2, eller 24 timmar och utsattes för immunofluorescens. Kärnor färgades med DAPI (blå kanal), var HCV avslöjades av en anti-NS5A antikropp (röd kanal) och hLF färgades med en anti-hLF antibody (grön kanal). Bilder förvärvades av epifluorescensmikroskopi med en ursprunglig förstoring av 60x. Skal, 10 | j, m. Modifierad från (11). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

HCV-epidemin är fortfarande ett globalt hot, med 80% av nysmittade patienter som utvecklar en kronisk infektion, sätta dem i riskzonen för skrumplever, leversvikt eller levercancer. Direktverkande antivirala medel inriktade på HCV-replikation och mognad utgör främsta anti-HCV-medel, som nyligen visat med godkännande av två NS3 N-terminalen proteashämmare (boceprevir och telaprevir). HLF anti-HCV-aktivitet är för närvarande tros uppträda som ett viralt inträde hämmare, bindande cirkulerande virioner och hindrar dem från att komma in i deras hepatocellulär mål. Vår forskning om hLF presenterar en ny intracellulär anti-HCV verkningsmekanism (skiljer sig från extracellulärt virion neutralisering) ^7.

Immunofluorescens kan effektivt användas för att visualisera distributionen och / eller lokalisering av en målmolekyl i ett biologiskt prov. Som återfinns i många andra fluorescenstekniker, en av de viktigaste problem i samband med immunofluorescens är fotoblekning (fotokemisk förstörelsen av fluorokrom) ^8. Denna förlust av aktivitet som orsakas av fotoblekning kan kringgås antingen genom att använda mer robusta fluorokromer som är mindre benägna att fotoblekning eller genom att minska intensiteten eller tidsspann av ljusexponering. Eftersom antikroppar inte kan korsa cellmembranet, immunofluorescens i allmänhet endast begränsad till fixerade celler. Alternativa tillvägagångssätt för att övervaka distributionen / lokalisering av proteiner i levande celler därför vanligtvis beroende av uttrycket av proteiner innehållande fluorescerande proteindomäner, såsom grönt fluorescerande protein (GFP) ^9. Emellertid är tillsatsen av sådana GFP epitoper ibland associeras med en ändring i lokaliseringen och aktiviteten av proteiner. Immunofluorescens kan också användas på ett antal olika prover inklusive vävnadssnitt, odlade cellinjer, eller enskilda celler är det också ofta för att övervakalokaliseringen / distribution av proteiner, glykaner, och små molekyler. De största fördelarna med denna teknik är bosatta i dess enkelhet och det faktum att det kan användas i kombination med andra, icke-antikroppsmetoder fluorescerande färgning (t.ex., DNA-färgning). Dessutom kommersiellt producerade sekundära antikroppar är relativt billiga och finns i en brett spektrum av färger.

I den aktuella studien, immunofluorescens av leverceller som stöder en HCV subgenom repliken avslöjade en kvalitativ minskning av HCV-färgningsintensiteten vid behandling med hLF. Detta är en intressant iakttagelse, eftersom detta subgenoma replikon systemet saknas HCV E1 och E2 höljesglykoproteiner, som är allmänt accepterade farmakologiska mål för hLF. Till skillnad från den extracellulära virus neutralisering aktivitet skulle hLF måste internaliseras av HCV-infekterade hepatocyter för att försämra virusreplikation. Användningen av fuorescence mikroskopi tillät oss att utvärdeåt denna möjlighet. Vid förinkubering på HCV-infekterade hepatocyter, var exogen hLF framgångsrikt internaliseras, och visat sig försämra intracellulär virusreplikation. Förståelsen av denna nya hLF antivirala aktiviteten utgör ett steg framåt i förståelsen av den globala (och sannolikt pleiotrop) mekanismen för hämning av denna medfödd immunitet protein.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Wisent	319-005-CL
PAF	BioShop	PAR070.1	Flammable solid, skin irritant, lungs and eyes
PBS	Wisent	311-425-CL	Without Ca2+ & Mg2+
NGS	Wisent	053-150
AlexaFluor 488-labeled anti-mouse	Invitrogen	A11017
AlexaFluor 568-labeled anti-rabbit	Invitrogeb	A21069
Wheat germ agglutinin Alexa Fluor 488 conjugate (WGA)	Invitrogen	W11261	Potentially mutagenic
Anti-NS5A rabbit	Abcam	ab2594
Anti-hLF mouse	Abcam	ab10110
SlowFade	Invitrogen	S36937
Hoechst stain	Life Techn.	H1399	Potentially mutagenic  and carcinogenic
hLF	Sigma	L0520
Nikon Eclipse visible/epifluorescence Microscope	Nikon	TE2000-E
epifluorescence/confocal microscope	Olympus	FV1000