Screenable 생체 형질 전환 발광 생물을 사용 미토콘드리아 변조기에 대한 분석 예쁜 꼬마 선충

이 절차의 목적은 전반적인 C.의 에너지 상태의 신속한 계량화 화합물 스크리닝에서 엔드 포인트로 이것을 사용하여 볼 수있는 생체 내에서 간스. 이론적 근거는 선충 C에서 반딧불 루시 페라 제의 유전자 발현을 기반으로 플라스미드 pSLGCV ⁽¹ 통해 엘레 ^1-3 https://www.addgene.org/49862 ). 루시퍼 라제 효소 (신호를 표적 루시퍼 페 록시 제거한) 녹색 형광 단백질 GFP 융합되고 세포질에서 구조적 및 보편적으로 발현된다. 루시페린 기질을 외생 제공되는 경우 이는 발광 리드​​. 웜이 투명하기 때문에, 광은 상대적 광 단위 (RLU)로서 루미 측정 될 수있다. 생물 발광 반응과 가용성 셀룰러 ATP 연료 생산 빛 수준을 결정합니다. 따라서, luminometry은 모든 편의를 제공합니다ATP를 생산하는 미토콘드리아에서 주로 일어나기 때문에 t는 상대적 ATP 수준을 평가 및 미토콘드리아 기능에 의해 확장을 의미한다. 미토콘드리아 기능 및 생물 발광 레벨 사이의 링크는 미토콘드리아 전자 전달계 유전자 및 수반 광 출력의 감소를 통해 이전 사일런 입증되었다. ¹

PE254 (feIs4)를 지정하고 생성 된 생물 발광 균주 및 PE255 (feIs5) ¹ (자료 목록 참조) ^3. 상호 교환 사용할 수있는 다수의 연구는 아 지드 화 나트륨 ^(1), 카드뮴 ^(2), 하수 등의 다양한 생체 이물 화학 물질에 노출 된 후 생체 내에서 세포의 ATP 수준에보고 이러한 센서 균주를 활용 한 슬러지 추출물 ^3, 5'- 플루오로 -2- 데 옥시 우리 딘 ^(6), 및 담배 특이 니트로사민 ^7. 균주는 또한 C 자외선 방사선에 대한 노출의 효과를 모니터링하는 데 유용했을 1,9-는 GFP 융합 (PE39)없이 루시퍼 라제 유전자를 발현 발광 센서의 초기 버전은 또한 중금속 효과 조사 및 호흡기 사용되고 . uncoupler ¹⁰ 균주 PE254과 PE255은 루시 페라 제를 수행 : GFP 융합 GFP의 형광 발광 값의 정상화를위한 편리한 수단을 제공하고, 선충 질량에 비례하여 증가 할 것으로 나타났다 ^{6,9 잘} 당 벌레의 차동 양의 효과도 될 수 있습니다. 분석 (조건 당 5 우물의 최소)에서 여러 기술 복제를 포함하여 고려. ⁽³⁾

프로토콜은 에너지 수준의 생체 모니터링의 가능성을 제공한다 (반대로 더 기술적 힘드는 체외 ATP의 결정) 화합물의 스크리닝을 가능하게하고 전체 MU의 생리적 환경에서 재배치lticellular 유기체. 절차 및 / 또는 RNA 간섭에 의한 유전자 사일런 하시어 변이주에 형질 전환 유전자를 염색체에 통합 건너 유전 다양한 배경으로 확장 될 수있다; 따라서, C의 최대한 활용 모델 생물로 간스. 이 방법에 의한 미토콘드리아 독성 약물 후보의 후기 실패를 줄이고 더 높은 동물 실험의 감소를 향해 기여를 할 수 있도록해야한다.

참고 : (126 ° C, 11 분 오토 클레이브에 의해) 멸균 조건 (층류 캐비닛)에서 사전 살균 물질과의 모든 단계를 수행합니다. 아웃 줄무늬 E.와 LB 플레이트 대장균 OP50 매월, 위에 밖으로 행진 신선한 LB 플레이트를 요구하고 restreak 4 ° C로 유지.

1. 세균성 식품 (대장균 OP50) 준비

1. 주 1. 접종 E.의 단일 식민지 두 보편적 인 병 2 × 5 ㎖의 LB 대장균 OP50 8 시간 동안 37 ° C (220 RPM)에서 인큐베이터를 흔들어에서 장소.
2. 8 시간 배양 한 후, E를 2 ㎖를 사용 대장균 OP50 LB 문화는 3 × 200 ml의 (LB)을 각각 접종 인큐베이터를 흔들어에 넣어 플라스크 (220 RPM) O / 37 ° C에서 N (17 시간).
3. 20 × 50 ㎖ 원심 분리기 튜브의 무게를 측정 튜브에 무게를 쓰기.
4. 날 혈청 학적 피펫을 사용하여 2. 나누어 O의 30 ㎖ / N E. 사전에 대장균 OP50 문화는 원심 분리기 튜브의 무게. 7741 X 원심 분리기G, 10 ° C, 8 분.
5. 조심스럽게 뜨는을 가만히 따르다에 뚜껑을 반전 튜브를 유지하고 몇 분 동안 서 둡니다. 피펫을 사용하면 뚜껑에서 수집 한 수 초과 뜨는을 제거합니다. 튜브를 달아 펠릿의 중량을 계산한다.
6. 30g / L의 현탁액을 제공하고,이 튜브에 볼륨을 표시하는 데 필요한 양을 계산한다. 1~3개월 내에서 또는 사용하기 위해 -20 ° C에서 날짜, 라벨 및 장소 튜브 - 80 ° C 3 개월 이상 저장하는 경우.
7. 선충을 성장 세균 현탁액을 준비; , 소용돌이 부드럽게 펠렛을 재현 탁 밖으로 해동 각 튜브에 ^{11, 12} 완전한 매체 S의 필요한 볼륨을 추가하는 세균 펠릿을 허용, 다른 관의 풀 내용은 필요한 볼륨을 얻었다. 무균 조건에서 작업 할 수 있습니다.

96 웰 플레이트 형식으로 의약품 표준 2. 준비

참고 : 약물 라이브러리를 사용하는 경우, 약물 플레이트가 하나 설치되어있다DMSO의 화합물의 농도. 차 심사는 하나의 농도로 화합물을 테스트합니다. 설명은 10 μM에서 통계적 유의성 선택한 후, 0-160 사이 μM 농도 범위에서 확증 시험 화합물에 대한 약물 판의 제조에 따른다. 다음 단계는 다른 농도를 테스트하도록 구성 될 수있다.

주의! 약물을 처리하기위한 필요한 예방 조치를 따르십시오 (일반적으로 마스크, 안전 고글에 직면, 장갑이 필요합니다).

1. 확증 검사에 대한 표준 작업과 약물 플레이트를 준비 : 멸균 1.7 ml의 microcentrifuge 관에 화합물의 필요한 양을 무게 DMSO에 16 밀리미터의 화합물을 제조 (즉, 100 배 노출에 대한 원하는 최고 농도에 상대적으로 집중).
2. 8, 4, 2, 1, 0.5 및 0.25 mM의 규격 (멸균 조건)을 얻었다 DMSO 2 : 직렬 16 mM의 스톡 1 희석. 이들은, 100X 농축하고 0 (비히클 만)의 최종 농도까지 희석된다약물 노광시 (1 % DMSO에서) 2.5, 5, 10, 20, 40, 80 및 160 μM.
3. 층류 캐비닛 예 플레이트 위치 A1을 위해, 96- 웰 플레이트의 칼럼 내의 화합물 표준 웰 당 20 내지 50 μL를 배치 : 16 mm의 B1 : 8 mm의 C1 : 4 mm의 D1 : 2 mm의 E1 : 1 밀리미터, F1 : 0.5 mm의 G1 : 0.25 mM의 약물 및 H1 : DMSO. 다른 약물의 희석 시리즈에 대해 서로 다른 열을 사용합니다.
4. 약물 플레이트에 열 (12)의 우물에 나누어지는 차량.
   참고 :이 그 차량이 전체 판의 위치 대리점에서 테스트 보장, 차량 제어 아래 행 (H)에 따라 시험에 추가하여 열 테스트를 용이하게 할 것이다.
   주 : 확증 각 약물 스크리닝 플레이트 테스트 될 11 개의 약물의 최대 플러스 차량 제어를위한 일련의 희석을 보유하고있다.
5. 필요한 때까지 레이블 및 도장 판은 -20 ° C에서 호일과 장소 커버.

3. 선충 실험

참고 : 모든 단계 U을 수행파인더 무균 조건, 무균 및 사전 살균 물질 및 시약. C를 유지 엘레은 E.와 NGM 판에 정기적으로 균주 다른 프로토콜 단계에 대한 대장균 OP50. ^(12)하기 권장 타이밍은 표 1에 제공된다.

1. 1 일 작업 : 다음 동기화를위한 바이오 센서 균주의 액체 배양을 설정합니다.
   1. 2 ML의 S 완료에 (음식을 그냥 실행 한 어린 유충을 많이) 하나 6cm의 NGM 판에서 선충을 가지고 30g / L E. 플라스크로 전송 S 전체 (전체 부피 250 mL의 용량 원추형 유리 플라스크에서 30 mL) 중의 대장균 OP50. 20 ° C, 160 rpm으로 3 일 품어.
2. 4 일 작업 (약 30 ~ 35 분을 허용) : 표백제 문화는 알을 수확 및 웜 인구를 동기화합니다. 1 분, 600 × g으로 원심 분리에 대한 모든 단계를 수행한다.
   1. 사용 직전 표백제 솔루션을 준비 : 0.156 M KOH / NaOH를 각각 16 ml의 4 ml의 표백제를 추가합니다.
   2. 2 × 14 ml에 붓고15 ML 원뿔 원심 분리 튜브에 웜 문화. 벌레는 중력 (3 분)에 의해 해결하도록 허용합니다. 제거하고 액체 위의 정착 선충을 폐기합니다. 각각의 튜브에 표백제 용액 5 mL를 추가하고 타이머를 시작합니다. 하나의 튜브에 볼륨을 결합합니다.
   3. 2 분 동안 부드럽게 튜브를 반전 벌레의 파괴 및 현탁액에 계란의 석방을 입체경에서 확인합니다. 때 대부분의 계란이 해제되거나 표백제 용액에서 2 분, 원심 분리기의 최대 시간.
   4. 조심스럽게 뜨는을 제거합니다. 14 ML의 S 완전하고 원심 분리기와 펠렛 1 배를 씻으십시오.
   5. , 상층 액을 버리고 10 ml의 표백제 솔루션을 추가하고 타이머를 시작 (이 두 번째 표백 단계는 웜 시체의 대부분이 분해되어 더 이상 입체경에서 볼 수 있습니다 보장). 2 분간 원심 표백제 용액에 최대 시간 후.
   6. 워시 펠릿 배는 S 전체에 부드럽게 각각의 원심 분리 후 전체 14 ML의 S에 뜨는에 resuspend 펠렛을 가만히 따르다. 14 ML의 S C가 최종 세척 후, 재현 탁 달걀 펠릿omplete.
   7. 원뿔 유리 플라스크에 볼륨을 전송합니다. 20 ° C, 160 rpm에서 18 ~ 24 시간을 품어.
      참고 : 수확 계란 O / N을 부화 및 제 애벌레 령 (L1)에서 개발을 체포 인해 음식의 부족, 따라서 그들은 모두 성장의 같은 단계에있을 것입니다 것입니다.
3. 5 일 작업 : 약물 분석에 대한 동기 웜 문화를 설정합니다.
   참고 : 기아 매체에 현탁 웜은 피펫 팁 및 튜브 등의 소수성 플라스틱 표면에 부착하는 경향이있다. 0.01 % 트윈 20은 플라스틱 표면 친수성을보다 렌더링 계수에 큰 정확도 (0.01 % 트리톤 X100가 또한 사용될 수있다)을 사용할 수 있도록 여기에 계면 활성제이다. 선충은 박테리아 보충 매체에있을 때, 그들은 플라스틱에 집중하는 경향이 없습니다.
   1. 플랫폼 (160 RPM)를 흔들어에 플라스크를 유지, 플라스크에 부화 L1 년대의 번호를 확인합니다.
      1. 플라스크에서 100 μL 샘플을 3 배 타고 900 μL 액체 M과 별도의 1.7 ML의 마이크로 튜브로 (깨끗한 팁 때마다 사용)edium 0.01 % 트윈 -20.
         참고 : 한 번만 청소 팁으로 갈망 100 μL 샘플. 분배 할 때 그런 다음, 트윈 보충 매체에 피펫 위로 몇 번 다운 팁을 준수하는 모든 벌레를 분리합니다.
      2. 각 세중 희석 관에서 4 배 10 μL 방울의 선충을 계산합니다. 평균 값을 계산하고 원뿔 유리 플라스크에 존재하는 웜의 수를 추정하고있다.
   2. 10 μL 당 10 선충과 2 × 20 ​​ml의 문화를 설정하는 데 필요한 부화 선충 서스펜션의 볼륨을 계산합니다. 원심 분리 단계에서 일부 이후 선충 손실을 고려하여 10 %로 계산 된 볼륨을 높입니다.
   3. 가만히 따르다 볼륨이 2 × 15 ML의 원심 분리 튜브에 요구 (미리 무게). 부드럽게 실제 분배 볼륨, 소용돌이를 얻어 5 mL를 피펫 (만 멸균 끝이 튜브를 입력해야합니다)를 초과 볼륨을 제거하여 볼륨을 대상으로 조정 튜브의 무게.
   4. 이었다 완전한 신선한 S를 14 ml의 볼륨을 확인시간 선충. 원심 분리기 (1 분간 600g). 제거하고 선충 펠렛을 방해하지 않도록주의하여 상층 액을 버린다.
   5. 30g / L (E)와 완벽한 S 5 mL를 추가 펠렛 선충에 대장균 OP50. 30g / L E. 완료 15 ML의 S를 함유 원추형 유리 플라스크로 각 튜브에 5 mL를 전송할 대장균 OP50. 아래 참고 시간 선충 먼저 음식을 제공했다.
   6. 현미경 슬라이드 선충을 계산 (신선한 팁 때마다 사용) 약 10 (± 2) 당 10 μL의 평균을 확인에 조심스럽게 플라스크 (160 RPM)를 흔들어, 9 × 10 μL 방울을.
   7. 20 ° C, 42 ~ 44 시간 동안 160 rpm으로 인큐베이터를 흔들어에서 선충 플라스크를 놓습니다.
4. 7 일 작업 : 전사 96 웰 플레이트에 선충 및 약물 노출을 시작합니다.
   1. 하나의 플라스크에 선충 문화를 결합 부드럽게 플라스크를 소용돌이 유지하고 60 ml의 멸균 통에서 선충 문화의 3 × 4 ml에 배치합니다. 흔들리는 플랫폼 (160 RPM)에 저점을 놓습니다.
   2. 사용 8 짱에서 채널 피펫은 투명 평면 바닥과 96 웰 블랙 마이크로 타이 터 플레이트의 웰 당 25 μL 중단 선충 나누어지는합니다 (모두 발광 및 형광 측정을 촬영하거나에만 발광 흰색 번호판). 접시 뚜껑을 덮고 옆으로 설정합니다.
      1. 후 매 2 판의 설정, 손실 된 볼륨을 대체하는 통에 다른 2 × 2.5 ㎖의 선충을 배치 (약 7 ㎖를 저점으로 '죽은 볼륨을'유지).
      2. 선충과 13/14 플레이트를 설정합니다. 11 선충 플레이트는 두 개의 96- 웰 플레이트 약물을 시험해야한다. 12 ^{일 선충} 판은 독점적으로 제어 등의 차량으로로드됩니다. 13 ^일 판은 8 일에 배경 형광 (아래 참조)을 설정하는 데 사용됩니다. 실수 셋업 중에 발생한다 여분의 판을 사용하기 위해 제조 할 수있다.
   3. 진탕 배양기에 젖은 실에서 각 웰과 장소 플레이트에 완벽한 S의 나누어지는 74 μL (자료 목록 참조) (20 ° C, 160 RPM) UNTIL (음식이 제공 한 후 예를 들어, 45 시간 30 분) 미리 선택된 발달 한 번에 나누어 테스트 화합물 준비. [잘 당 볼륨은 이제 99 μL입니다].
   4. 시험 약물 판 (들)을 해동.
   5. 팁 각 시간을 변경, 약물 선충 판을 설정하는 멀티 채널 피펫을 사용합니다. 약물을 분취 96 웰 플레이트 당 5 분을 허용합니다.
      1. 약물 판의 1 ^{일 열에서} 1 μL를 가지고 열 선충을 포함하는 판의 1-5에 추가; 열 선충을 포함하는 판의 8-12로 약물 플레이트에서 ² 번째 ^열에서 반복합니다. 열 (6)과 선충 판의 7 차량의 1 μl를 추가합니다.
         참고 : 화합물 / 차량 100 희석 : 선충 플레이트에 웰 당 총 볼륨 1의 결과로 100 μL 될 것입니다.
      2. 열에 약 판의 3 ^번째 / 4 ^번째 컬럼의 1 μl를 추가하여 반복 과정 제 선충 판의 1-5 / 8-12; 열 (6)과 선충 판 7에 차량을 추가 할 수 있습니다.
      3. 남은 약물 플레이트 열을 테스트하기 위해 계속합니다. 약물 판의 열 (12)로부터 샘플링하여 모든 우물에서 차량 한 선충 판의 최소를 설정합니다. 다시 인큐베이터 20 ~ 22 시간 동안 20 ° C (160 RPM)을 떨고에 습기 챔버에 넣어 판 (8 일 참고 사항을 참조하십시오).
   6. 다음날 발광 버퍼를 파트 준비 : 1 % DMSO 0.15 % 트리톤 X-100을 얻기 위해 완벽한 S의 필요한 볼륨 DMSO 10 % 트리톤 X-100을 추가합니다. 발광 용 플레이트 읽기 당 5 ml를, 플러스 루미 인젝터를 프라이밍 1 ml의 허용.
5. 8 일 작업 : 실험 엔드 포인트를 읽기 - 형광 및 생물 발광을. (GFP의 형광 판독은 생물 발광 데이터를 정상화하기위한 수단으로 권장합니다.)
   주 : 음식 기재된 실험 조건 하에서 상당한 자손 생산을 방지하기 위하여 선충에 제공 한 후 66 ~ 67 시간에서 엔드 포인트를 판독하고자합니다.
   1. 설정 판은 GFP 판독에 대한 배경 컨트롤로 사용할 수 있습니다. C15 ML 튜브에 13 ^번째 판에서 ombine 아니라 내용. 선충은 (2-3 분) 정착하도록 허용합니다. 물론 당 100 μL 세균 현탁액으로 마이크로 (투명 하단에 검은 색)을로드하는 상층 액을 사용합니다.
      1. 선충을 볼 수있는 우물 아래로 지적 현미경 배경 제어 판을 준수하십시오. 후속 데이터 분석에 사용되는 배경이 추정치로부터 제외.
   2. 배경 컨트롤을 포함하여 각 96 웰 플레이트의 형광을 읽어보십시오. (설정 : 판의 바닥에서 광학, 20분의 485 여기 필터, 20분의 528 방출.)
   3. 발광 측정을위한 버퍼를 준비합니다 루시페​​린 (20 mM)을 부품을 제조하는 버퍼 (전날)를 추가, 1 %로 DMSO (1 배), 0.15 % 트리톤 - X100 (3 배) 0.3 MM의 루시페린 (배를 발광 버퍼를 얻기 위해 ). 150 μL 발광 버퍼 프라임 루미 인젝터의 6 배.
      1. 이전 단계는 약물 노출시 차량으로 1 % DMSO를 가정합니다. 차량이 물이있는 경우, CO를 조정3 %에 발광 버퍼에 DMSO의 ncentration (즉, 배).
   4. 한 번에 하나의 판으로 작업 할 수 있습니다. 웰 당 50 μL 발광 버퍼를 분배. (물론 150 μl의 최종 부피, 발광 버퍼의 3 배 희석 : 1 % DMSO, 0.05 % 트리톤 - X100 0.1 mM의 루시페린 최종 농도.) 장소 바로 플랫폼을 흔들어 타이머를 시작합니다.
      1. 플랫폼 (160 RPM)을 흔들어 3 분 후, 발광 (측정 당 1 초)를 참조하십시오.

4. 데이터 분석

1. 형광 결과에서 읽기 평균 GFP 배경을 뺍니다. 각각의 GFP 읽기에 의해 생물 발광을 나눕니다.
   1. 높은 GFP 값은 화합물에 노출 선충에 대해 검출되는 경우, 임의의 화합물의 형광을 고려하여 그 자체 화합물의 형광을 측정한다. 평균보다 높은 경우, 대신에 배경으로 사용합니다.
2. 익스프레스 생물 발광, GFP 정규화 된 생물 발광의각 플레이트에서의 차량 제어에 대한 평균 값의 비율로 ND GFP 형광 데이터.
3. 각각의 농도 평균값과 오차 막대 플롯.
4. '농도', '실험'과의 상호 작용의 효과와 2 웨이에게 분산 (ANOVA)의 분석을 이용하여 유의성에 대한 시험 (각 데이터 포인트는 하나의 웰을 말한다)와 대 (사후 시험으로서 듄 네트의 시험을 사용하여 . 차량 제어).
   주 : "실험"또는 "상호 작용"용어가 중요한 경우, 추가 실험이 응답을 확인해야한다. 실험 사이의 변동이 데이터 그림의 관찰로부터 명백한없는 경우, 일방향 ANOVA는 독립적 인 실험으로부터 풀링 된 데이터에 대해 수행 될 수있다.
   1. 단 차량 판 (들)의 통계적인 분석을 위해, 컬럼 (6) -7에서 모든 웰과 대조군으로 행 H의 모든 웰을 선택 (이 화합물은 일상적으로 테스트하는 동안 차량에 할당 된 위치에있다).

방법을 설명하는 대표 결과 로테 논 (도 1), 파라콰트 (도 2), 옥 살로 아세테이트 (도 3), 및 약물 라이브러리 (13) (도 4)의 선별 과정으로서 반딧불 루시퍼 라제 억제제로 선택하고 4 화합물에 대해 수득 하였다. 약물 노출은 모든 경우에 L4 단계에서 시작하고, 음식이 제하지만 다른 화합물에 비하여 45 ~ 46 시간에 제공 한 후 선충 파라콰트 노출 실험은 41 시간에 시작 하였다. 프로토콜은 약물 노출의 개시 및 노광 시간 길이를 선택하는 데있어서 유연성의 정도 허용한다. 그러나, 검사 목적, 설정 시간은 한 번 실험 사이의 재현성을 위해 선택하는 준수해야합니다. 엔드 포인트는 넓은 달걀 누워 우물에서 자손의 부화를 방지하기 위해 66 ~ 67 시간 개발 시간으로 측정해야한다. 타이밍에 대한 지침은 T에서 제공됩니다(1) 수.

로테 논, 내가 억제제 미토콘드리아 복합체는, 농도 범위에 모두 비교적 짧은 (2 시간)과 더 이상 노출 (24 시간) (그림 1) 이후 생물 발광을 감소시켰다. 이때, 어떠한 GFP 측정치가 수행되지 않았지만 기술적 복제 수가 사용 (N = 6)에 웰 (3) 사이에 웜 번호 차이를 고르게하기에 충분하다. 24 시간 노출이 생물 발광의 감소에 기여할 것으로 기대되었다 복잡한 I 억제의 결과로서 선충이 성장하는 동안의 시간 윈도우와 느린 개발이다. 이는 특히 상기와 20 μM의 농도에서, 본 발달 지연과 입체경 하에서 육안으로 확인 하였다; 또한 일부 치사율은 (질적 관찰 정량화되지 않음) 40 μM에서 발견되었다. 어떤 치사율은 2 시간 노출 후 관찰되지 않았다하지만 웜 운동에 효과가 관찰되었다. 제어 occu에 생물 발광 상대적으로 급락로테의 가장 낮은 농도로 rred 효과가 쉽게 2 시간 노출에 빠른 육안으로 검출되지 않았다하는 2.5 μm의를 테스트했다. 생물 발광에있는이 감소는 감소 된 세포의 ATP와 일치한다. 최대 억제가 특이 로테 타겟팅 후속 실험은 0, 5 μM [농도 범위 0-160 μM 사이에 수행되는 것을 나타내는 사용 로테의 최저 농도 (2.5 μM)에 의해 달성 된 다른 약물과 비교의 대상으로 선정 처음에 10 μm의에 심각한 영향이있는 것으로 확인 된 (다른 곳에 게시 할).

제초제 파라콰트는 활성 산소 종의 증가를 통해 미토콘드리아의 기능에 영향을 미친다. 여기, 우리는 C의 생물 발광에 미치는 영향을 보여 24 시간 (그림 2)에 대한 농도의 범위에 노출 된 후 간스 변형 PE254. 변형 루크 :: GFP 융합을 수행으로, GFP의 형광은 루게릭 병이었다O 정규화하는 수단으로 측정 하였다. 6,9- 파라콰트 크게 생물 발광, GFP 형광 정규화 생물 발광을 감소시켰다. 둔넷 (Dunnet) 사후 시험 차량 제어와 관련하여 상당한 차이 파라콰트의 농도를 생물 발광과 정규화 생물 발광 4 및 8 mm로했다뿐만 아니라 정규화 생물 발광 2 mM의 것으로 나타났다. 크게 GFP의 형광을 줄일 수있는 유일한 농도는 mM의 성장 효과와 가끔 죽은 웜 (질적 관찰) 관찰되었다되는 농도 (8)이었다. 생물 발광 (정규화 생물 발광)의 감소, 미토콘드리아의 기능과 ATP 생산에 대한 영향 감소와 일치 형광보다 더 컸다.

C. 테스트 시트르산 회로 중간 옥 살로 아세테이트 8 mm의 단일 농도 간스 변형 PE254은 생물 발광의 증가 (그림 3)되었다. 아니 GFP의 형광 없습니다NCE 측정치가 얻어 또는 추가 육안 관찰을 행 하였다; 그러나 하나의 농도에 이러한 반응은 더 농도 범위에 확증 노출 효과의 자세한 관찰을받을만한 것이다. 그것은 그럼에도 그것이 GFP 형광을 평가하여 루시페라아제 수준에 어떤 효과를 제어하는​​ 것이 바람직 할 것이다 ATP (궁극적으로 더 생산, 시트르산 사이클의 더 큰 활성을 이끌어 가정 될 수있는이 화합물에 의한 생물 발광의 향상은 놀라운 일이 아니다 후속 실험에서). 옥 살로 아세테이트 데이터 세트는 루시퍼 기초 실험에서 본 응답 변동의 정도를 나타내 도시. 경험상 이러한 가변성은 특히 덜 해로운 노광 조건에 대한 테스트 시스템의 기능이다.

반딧불이 루시퍼 라제 저해 화합물 DDD00001434는 DDD0001477, DDD00000635과 DDD00023047는 폴리 우레탄에 효과를보고 시험관 모두를 시험 하였다rified 및 생체 내에서 효소를 사용하여 C. 엘레의 루크 : GFP 변형을 표현. 시험 화합물 중 노광 조건 하에서 선충 사멸을 초래한다는 증거는 없었다. 모든 4 화합물 (25) 및 100 μM (도 4a)를 테스트 2 농도에서 시험 관내에서 루시페라아제 활성에 영향을 미쳤다. DDD00001434는 생체 내 생물 발광 (그림 4B)의 큰 감소를위한 신뢰할 수있는 명분을 제공하는, 거의 완전히 정제 된 루시 페라 제의 활성을 죽였다. 직접 비교하지 않지만, 시험 관내 및 생체 내 분석에서 DDD00023047에 응답하여 두 분석에서 유사했다. DDD0001477과 DDD00000635는 체외보다 생체 내에서 더 큰 감소를 일으키는 원인이되었다. 이들 화합물은 22 시간 전에 루시페린 기판 라이브 웜에 제공하고, 결과 루시페린이되었을 때 그들이 쉽게 루시퍼 라제 활성 부위에서 변위되지 않은 것을 반영 available가. 또한, DDD0001477 및 DDD00000635 셀룰러 ATP 수준에 추가적인 영향을 미칠 수 있습니다. 이 반딧불 루시 페라 제를 포함하지 않는 방법에 의해 평가되어야 할 것이다. 참고로 DDD00000635을 화합물에 노출 라이브 웜에 GFP 신호의 강한 강화했다. 이는 이하에서 논의 될 것이다.

미토콘드리아 복합체 I은도 1은 C. 로테의 에너지 상태를 감소 억제제 엘레 스트레인 PE254의 생물 발광에 의해 측정. 동기화 L4 스테이지 웜 0, 2.5, 5, 10, 20, 40, 80, 2, 1 % DMSO 내의 160 μM 로테 노출 (45-46 시간 L1 유충에 제공 음식 후) 시간 (짧은) 또는 각각 48에서 24 시간 (긴 노출) 생물 발광의 사전 판독 및 웜 개발의 69 시간 음식을 제공 한 후. 생물 발광 단위 (상대 라이트 유니트, RLU)을 차량 (1 % DMS의 백분율로 나타내었다O) 값. 오차 막대는 각각의 농도에서 로테 복제 기술의 SEM을 도시한다 (N = 6). 테스트 한 모든 농도는 비히클 대조군 (p <0.001)에 관하여 매우 유의 한 차이의 결과.

산화 적 스트레스에 파라쿼트도 2는 C.의 에너지 상태를 감소 (생물 발광 측정) 농도 의존적으로 간스 스트레인 PE254. (L1 유충에 제공 음식 후 41 시간에서이 경우에 편리) 동기화 L4 스테이지 웜은 0, 0.25, 0.5, 1, 2, 4 또는 8로 노출시켰다 24 시간 동안 MM의 파라쿼트. GFP의 형광 (단위 상대 형광 단위, RFU)는 생물 발광 데이터 (단위 RLU), 65 시간 개발에서 얻은 두 엔드 포인트를 정상화하는 데 사용되었다. 컨트롤 데이터의 비율 (1 % DMSO)로 표현된다. 오차 막대는 기술 복제의 SEM을 묘사(N = 서로 다른 농도 5, N = 18 컨트롤). 일원 분산 분석 : *** P <차량 제어 0.001 상대.

그림 3. TCA 회로의 중간 옥 살로 아세테이트 (8 mM)을 C의 생물 발광을 강화 엘레 변형 PE254. 동기화 L4 무대 웜 (L1 유충에 제공 음식 후 45 ~ 46 시간)을 갓 30 분 ± 18 시간 동안 8 MM의 옥 살로 아세테이트 준비에 노출되었다. 생물 발광도 (RLU)을 ± 63.5 시간 1 시간의 발달시 판독하고, 차량 제어의 백분율로 표현 하였다 (DDH 2 O). 다른 열은 동일한 실험에서 서로 다른 96 웰 플레이트에 분배 8 기술 복제의 다른 데이터 세트를 나타낸다. 오차 막대는 기술 복제의 SEM을 묘사 (N = 8). 이 방법-ANOVA '설정'과 '집중'요소로와 : ̵6; 설정 'P> 0.05,'농도 'P <0.001과 상호 작용 용어 P> 0.05.

(B)

반딧불 루시 페라 제 발광에 알려진 억제 활성 (DDD00023047 : DDD00001434, C2 : DDD0001477, C3 : DDD00000635 및 C4 C1) 던디 신약 화합물 라이브러리 (13) 4 화합물에 대한 응답 그림 4. 테스트. 정제 된 반딧불 루시퍼 라제의 활성에 대한 화합물 (A) 효과, (빛 단위로 측정 RLU) 비히클 대조군에 대한 백분율로 나타냈다. ATP 생물 발광 CLSII 키트 (로슈, 만하임, 독일)의 웰 (96-w 백색에 분주 루시퍼 라제 효소의 동일한 양의 지시에 따라 사용 하였다엘 마이크로 타이 터 플레이트). 10 μM ATP 및 화합물 1 μL의 최종 농도를 제공 하였다 (최종 농도를 나타냄) 또는 DMSO (1 %)를 첨가 하였다. 발광 신호는 10 초 동안 통합되었습니다. 오차 막대는 기술 복제의 SEM을 묘사 (N = 4). 분석 : 일원 분산 분석; * p <0.05 *** p <차량 제어에 대하여 0.001. 및 C2와 C3 상당한 (각각 DDD0001477 및 DDD00000635; P <0.05). GFP의 형광에 (B) 생물 발광의 생체 측정, 표준화 된 생물 발광하고, C1 (P <0.001 DDD00001434)에 매우 중요한 25과 100 μm의 차이점 C.의 GFP 형광 22 시간 동안 시험 화합물에 노출 된 후 67 시간 개발시 엘레 변형 PE254. 오차 막대는 기술 복제의 SEM을 묘사 (N = 8). 통계 분석 (편도-ANOVA)는 3 데이터 세트 (3 XN = 8)에서 풀링 된 데이터에 대해 수행. * p <0.05 *** p <각 차량 제어에 대하여 0.001. DifferenC4 (DDD00023047)에 노출 된 다음 정규화 된 생물 발광에 대한 25 100 μM 만 통계적으로 유의 한 (P <0.05) CES.

프로토콜 단계 표 1. 개요 선충 실험의 각 날에 (3 절)을 수행하고 타이밍을 제안한다.

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